Вис 2347 размер кузова: Грузовой фургон ВИС 2347

>

Грузовой фургон ВИС 2347

Для заказчика: Подбор материалов и опций для изготовления автофургона ВИС 2347

По сравнению с изотермическими кузовами при изготовлении промтоварного фургона не требуется использования сложной конструкции и оборудования.

Основное предназначение промтоварных фургонов — удобная транспортировка груза, не требующего соблюдения температурного режима внутри кузова, а также защита от внешних воздействий окружающей среды таких, как дождь, грязь, пыль и т.д. Как правило, это непродвольственные товары.

Промтоварный ВИС 2347 — легкий коммерческий автомобиль бюджетного класса, пользующийся популярностью у служб доставки и малого бизнеса. Основное предназначение — транспортировка на малые расстояния небольшой партии грузов, нейтральных к температурным условиям внутри кузова. Грузоподъёмность и объем промтоварного фургона достаточны для перевозки  запчастей, бытовой техники и других малогабаритных грузов. Полезный объем кузова составляет от 2,9 до 3,7 м3.

Фургон ВИС 2347 с полурамной конструкцией кузова и рессорной задней подвеской построен на базе Lada Samara (ВАЗ 2114), имеет привод на ведущие колеса и все агрегаты, узлы и оборудование от данной модели. Комплектуется инжекторным 4-цилиндровым рядным двигателем объёмом 1,6л, выдающим максимальную мощность в 81 л.с. Все без исключения модификации этой модели комплектуются центральными замками и электрическими стеклоподъемниками.

Конкурентными преимуществами ВИС 234700-30 являются его приемлемая цена, хорошая развесовка и отличная маневренность, легкость и удобство в управлении, повсеместная ремонтопригодность в России и странах СНГ, а также дешевые запчасти. Для лучшей аэродинамики и уменьшения расхода топлива (около 10%) на крышу автофургона устанавливается аэродинамический обтекатель (спойлер).

Технические характеристики ВИС 2347:

МодельВИС 2347 бортовойВИС 2347 с надстройкойВИС 2347 с фургоном
Базовая модельLada Samara (ВАЗ-2114)
Число мест2
Грузоподъёмность, кг640
Полная масса, кг1710
Задняя подвескаРессорная
Двигатель (модель)ВАЗ-11183, 4-хрядный, бензиновый
Система питанияРаспределенный впрыск
Экологический классЕвро-3
Рабочий объём, см31596
Мощность двигателя, кВт (л. с.)59,5 (80,9)
Крутящий момент, нМ при 3500 об/мин128
Расход бензина, л/100 км9,89,9
Объём топливного бака, л43
Коробка передач5МКПП
Максимальная скорость, км/ч130
Габаритные размеры автофургона, ммБаза2785
Длина4515
Ширина16601710
Внутренние размеры фургона, ммДлина18501830
Ширина15601580
Высота33010401110
Объём кузова, м32,93,2
Число открывающихся дверей (бортов)12


В зависимости от специфики деятельности Вашей компании «Алти-Авто» предлагает различные варианты исполнения модели ВИС 2347.

Вид кузоваОписание и характеристикиФотоПрименимость
Жесткая надстройка.
Объём — 2,9 м3.
Надстройка из стеклопластика. Защищает груз от внешних воздействий окружающей среды таких, как пыль, дождь, грязь и т.п.     ВИС 2345

     ВИС 2346

     ВИС 2347

Промтоварный фургон.
Внутренняя обшивка: оцинкованный лист.
Наружная обшивка — плакированная сталь.
Каркас фургона — из квадратной трубы 20х20.
Основание — из трубы 40х20.
Пол — металл 1,5 мм.
Задняя дверь — двухстворчатая.

   
   

     ВИС 2345

     ВИС 2346

     ВИС 2347

 
Промтоварный фургон.
Внутренняя обшивка — оцинкованный лист + влагостойкая фанера.
Хлебный фургон со съёмным комплектом хлебных направляющих.
Объём — 3,7 м3.
Утеплитель — пенополистерол.
Толщина утеплителя — 30 мм.
Продовольственный из цельных сэндвич-панелей. Внутренняя обшивка — оцинкованная сталь.
Наружная обшивка — плакированная сталь.
Пол — термоизолированный, покрыт алюминиевым рельефным листом.
Изотермический кузов.
Объём — 3,3 м3.
Утеплитель — пенополистерол.
Толщина утеплителя — 30 мм.
Продовольственный из цельных сэндвич-панелей.
Внутренняя обшивка — оцинкованная сталь.
Наружная обшивка — плакированная сталь.
Пол — термоизолированный, покрыт алюминиевым рельефным листом.
Задняя дверь — двухстворчатая.

Изотермический кузов.
Объём — 3,7 м3.
Утеплитель — пенополистерол.
Толщина утеплителя — 30 мм.

Изотермический кузов.
Объём — 3,7 м3.
Утеплитель — пенополистерол.
Толщина утеплителя — 40 мм.
Продовольственный из клееных сэндвич-панелей. Внутренняя обшивка — оцинкованная сталь.
Наружная обшивка — плакированная сталь.
Задняя дверь — двухстворчатая.
Изотермический кузов.
Объём — 3,7 м3.
Утеплитель — пенополистерол.
Толщина утеплителя — 50 мм.
Продовольственный из клееных сэндвич-панелей. Внутренняя обшивка — оцинкованная сталь.
Наружная обшивка — плакированная сталь.
Задняя дверь — двухстворчатая.
С закладными элементами под холодильную установку.
По требованию заказчика обеспечивается подбор и монтаж ХОУ с необходимым температурным режимом.
      ВИС 2345

     ВИС 2346

     ВИС 2347

 

VIS 2347 Рефрижератор на привлекательных условиях во всевозможных комлектациях и модификациях

Рефрижератор представляет собой конструкцию из изотермического фургона и холодильного оборудования. Это прекрасно реализовано на базе автомобиля ВИС 2347, что является одной из модификаций Лада Самара. Два места в кабине, включая место водителя, грузоподъемность 540 кг и общая масса 1,7 тонн делают этот автомобиль высокоэффективным при перевозке продукции замороженной категории, которая нуждается в поддержании определенной температуры.

Снят с производства с 1 января 2014 г.

Описание надстройки на шасси:

Фургон ИЗОТЕРМИЧЕСКИЙ из СЕНДВИЧ-ПАНЕЛЕЙ

производитель «Центртранстехмаш»
Изотермические фургоны предназначены для перевозки грузов, требующих защиты от воздействия атмосферной среды и поддержания определенного температурного режима внутри кузова.
Большая часть изотермических фургонов комплектуются холодильными установками, такие автофургоны называются рефрижераторами.

В зависимости от требований перевозимой продукции к температурному режиму, на ТС устанавливаются изотермические кузова трех степеней изотермичности: низкой; средней или высокой.

Варианты СЕНДВИЧ-фургонов:Плакированные
» ХИТ ПРОДАЖ «
Пластиковые
Материал облицовки:Плакируемый металлАрмированный пластик
Материал термоизоляции:Пенополиуретан (ППУ)
Цвет КФГ:Белый
Конструкция КФГ:Бескаркасная

Таблица соответствия модификации ТС и стандартных размеров надстройки на шасси:

МОДИФИКАЦИЯВИС 2347 (на базе ВАЗ 2114)
Габариты КФГ (мм.)1900х1550х1200
  • Возможно изготовление и установка КФГ с измененными (увеличенными/уменьшенными) габаритными размерами в пределах допустимых по ОТТС. Подробная информация у наших специалистов.

В стандартной комплектации фургоны оснащены:

  1. Наружное обрамление выполнено из оцинкованной стали с эмалевым покрытием. Обрамление крыши и передней стенки имеет закругленный профиль, что улучшает аэродинамические свойства автофургона.
  2. Пластиковые подкрылки с брызговиками
  3. Покрытие пола — ламинированная фанера сетчатая износостойкая

Опционально фургоны могут быть оборудованы:

  1. Дополнительные двери
  2. Изменение стандартных размеров КФГ
  3. Импортная нержавеющая фурнитура
  4. Кольца для крепления груза
  5. Такелажная рейка для крепления груза
  6. Алюминиевое обрамление КФГ снаружи (уголок полукруглый)
  7. Обшивка фургона внутри фанерой 6мм.
  8. Настил пола из алюминиевого/стального квинтета
  9. Заливной пол
  10. Нанесение вашей рекламы на фургон

Технические характеристики шасси

Характеристики шассиВИС 2347
Колесная база2785
Полная масса (кг)1710
Грузоподъемность (кг)540
Собственная масса автомобиля (без нагрузки) (кг)1170
Максимально допустимая нагрузка на передний мост (кг)850
Максимально допустимая нагрузка на задний мост (кг)1100
Клиренс165
Количество мест2
Колесная формула4×2(спарка)
ДвигательВАЗ-11183
Количествло и расположение цилиндров4, рядное
Рабочий объем (см3)1596
Максимальная мощность: кВт (л. с.)60 (82)
Максимальный крутящий момент: Нм120
Экологический классEuro 4
Топливо бензин, АИ95
ПриводПередний
СцеплениеОднодисковое, сухое
Коробка передач: число ступенейМКПП 5+1
Подвеска
Передняянезависимая, типа «Macpherson», пружинная, со стабилизатором поперечной устойчивости
Задняязависимая, рессорная, с гидравлическими телескопическими амортизаторами
Колеса
Шины185/75 R13С
Общие данные
Емкость топливного бака (л)42
Максимальная скорость (км/ч)110
Размеры, мм
Колесная база
2785
Длина4515
Ширина1710
Передняя колея1400
Задняя колея1380
Высота (по кабине без нагрузки)1420
Монтажная длина1900
Расход топлива, л/100 км9,8

Комплектация шасси :

ВИС 2347
Электростеклоподъемники передних дверей+
Инерционные ремни безопасности (2 передних)+
Индикация времени и температуры окружающего воздуха+
Комбинация приборов ВАЗ 2115+
Центральный замок+
Бампер полипропиленовый не окрашенный+
Лебедка запасного колеса+
Полноразмерное запасное колесо+

Рекомендуемое дополнительное и навесное оборудование

Которым вы можете доукомплектовать указанный автомобиль в нашей компании:

  • Холодильно-отопительное оборудование (Carrier, Элинж(Sanden), Zanotti, ThermoKing)
  • Автономный отопитель кабины/кузова
  • Обтекатель/спойлер на кабину
  • Подогреватель топливного фильтра
  • Инструментальный ящик
  • Защита картера
  • Сигнализация
  • Коврики в салон
  • Полосовые холодильные завесы (из ПВХ)

*** Цена транспортного средства в базовой комплектации с КФГ низкой изотермичности без учета стоимости ХОУ

Цена по запросу

Аналогичные:

История марки ВИС — CARobka.

ru

«ВАЗинтерСервис» — дочерняя компания ОАО «АВТОВАЗ» со штаб-квартирой в Тольятти, которая выпускает автомобили и автокомпоненты.

Компания была создана в 1991 году для выпуска автокомпонентов для АВТОВАЗа. Однако со временем она начала производить пикапы и тягачи на основе автомобилей ВАЗ.

История предприятия началась много раньше — в 1953 году, когда на базе Автоуправления Куйбышевгидростроя был создан Ставропольский Левобережный ремонтно-механический завод. Производственные мощности располагались в вывезенном после окончания войны из Германии самолетном ангаре. Сразу после создания Левобережный РМЗ занимался ремонтом автомобилей ГАЗ и ЗИЛ, а также их силовых агрегатов и узлов.

В 1960-х годах предприятие входит в состав Главэнергостроймеханизации Минэнерго СССР и ремонтирует не только автомобили, но и автопогрузчики, буровые машины, телескопические вышки, компрессоры, автокраны.

В 1971 году Тольяттинский РМЗ объединили с Жигулевским ремонтно-механическим заводом, и предприятие получило название Левобережного производства завода «Энергореммаш».

С 1991 года, когда началась новая история предприятия, названного «ВАЗинтерСервис», оно начало работы по перепрофилированию на выпуск новых видов продукции. Появилась площадка №1, на которой изготавливались отопители, был открыт окрасочный цех и цех пластмасс. Сейчас площадка №1 преобразовалась в Завод климатических систем.

В 1992 году структуру компании пополнил Автоагрегатный завод.

С 1993 года предприятие компании было оснащено новым оборудованием. В том же году выпускается 203 экземпляра первого пикапа на основе ВАЗ 21043.

В 1996-м компания начинает искать пути увеличения сфер применения автомобилей АВТОВАЗа. Поскольку в то время рынок нуждался в доступных автомобилях малой грузоподъемности, появилась необходимость в доработке конструкции существующих моделей, чтобы на их основе было можно создавать спецавтомобили.

Для этого создается конструкторская служба завода, которая разрабатывает новую полурамную конструкцию грузопассажирского пикапа на основе агрегатов ВАЗ. Через год начинается производство новой модели пикапа. Впоследствии полурамная конструкция кузова собственной разработки использовалась на всех автомобилях марки ВИС.

Легкие коммерческие автомобили появились несколько позже, чем сформировался спрос на них. Такие авто ждали, и предложение отечественного производителя было весьма кстати. Примечательной в этом плане была двухместная модель ВИС 1705, созданная на базе «Самары» с усиленной задней частью кузова.

Это был первый фургон российского производства с передним приводом. Автомобиль разгонялся до 130 км/час. Объем фургона исчислялся 2,25 кубическими метрами, при этом полезная нагрузка составляла 450 кг. Автомобиль комплектовался 1,5-литровым карбюраторным двигателем от ВАЗ 21083, развивающим 71 л.с.


ВИС 1705 (1998)

Вышедшая параллельно модель ВИС 2345 разрабатывалась на базе ВАЗ 2107. Она получила тот же инжекторный рядный четырехцилиндровый мотор объемом 1,5 литра и мощностью 71 л.с, который работал в паре с пятиступенчатой механической коробкой передач. Силовая установка позволяла автомобилю разгоняться до 110 км/час. Его грузоподъемность равнялась 640 кг, а объем фургона составлял 3 200 литров. Автомобиль пользовался популярностью благодаря маневренности и способности перевозить сравнительно габаритные грузы.


ВИС 2345 (1998)

В 2000 году «ВАЗинтерСервис» покупает новое помещение, которое позволяет увеличить мощность предприятия. Создается единый комплекс «ВИС-Авто» со службой главного конструктора, который дает возможность проводить работы по подготовке, изготовлению и экспериментальным испытаниям пикапов.

Одной из самых удачных моделей компании стала ВИС 2347 — двухместный пикап на основе LADA Samara. Он комплектуется 1,6-литровым восьмиклапанным рядным четырехцилиндровым двигателем мощностью 84 л.с. и пятиступенчатой механической коробкой передач. Это идеальный автомобиль для перевозки малогабаритных грузов. Существуют такие модификации автомобиля, которые получили рефрижератор или изотермическую будку.


ВИС 2347 (2002)

В 2003 году «ВИС-Авто» входит в состав ЗАО «Группа СОК». Годом позднее появляется собственная торговая марка компании — Vinters. Она используется для продажи автозапчастей класса «люкс».

В 2006 году на Заводе климатических систем образовывается участок, производящий продукцию для поставки на завод «ИжАвто».

10 марта 2011 года «Группа СОК» продает дочерней компании ОАО «Объединенные автомобильные технологии» 50%-ю долю «ВАЗ-Траст», в состав которой входит «ВАЗинтерСервис».

В 2011 году все акции ВИС выкупил АВТОВАЗ, и компания стала его дочерним предприятием. В 2013 году тольяттинский автогигант решил объединить два своих дочерних предприятия — ОАО «ПСА «Бронто» и ООО «ПСА «ВИС-Авто».

В 2012-м появляется новый переднеприводный коммерческий фургон, построенный на базе LADA Granta. Он отличается комфортабельной кабиной и современным дизайном. Автомобиль комплектуется 1,6-литровым восьмиклапанным мотором, развивающим 83 л.с., который агрегатируется с пятиступенчатой «механикой». Фургон модели рассчитан на 3 200 литров, грузоподъемность составляет 720 кг.


ВИС 2349 (2012)

Сейчас ОАО «ВИС-Авто» изготавливает коммерческие автомобили с грузоподъемностью до 720 кг. В его состав входит завод «ВИС-Авто», где производятся пикапы, а также автосборочный и автоагрегатный заводы. Ежегодно выпускается около 3 500 автомобилей.

Автомобильные комплектующие, которые изготавливает компания, используются не только АВТОВАЗом, но и другими автомобилестроительными предприятиями, а также идут на вторичный рынок для ремонта.

Продукция ОАО «ВИС-Авто» продается не только в России и странах СНГ, но и в Египте, Сирии, Македонии.

10 000 пикапов от »ВАЗИНТЕРСЕРВИСА»

23 января 2004 года на тольяттинском заводе »a href=»http://www.21century.vaz.ru/Partners/vazinterservice.htm»» «ВИС-Авто» »/a» был собран десятитысячный пикап первой базовой модели полурамной конструкции ВИС-2345, которая до сих пор является самой массовой в структуре выпускаемых автомобилей. Всего же с начала производства спецавтомобилей ВИС изготовлено и реализовано более 15 тысяч машин. Динамика роста производства впечатляет: если в 1997 году выпуск пикапов составил всего 130 штук, то за прошедший год — в 25 раз больше, точнее, 3253 автомобиля. И этому есть простое объяснение.

Пикапы были нужны всегда. Основными преимуществами подобных автомобилей являются маневренность, экономичность, комфорт легкового автомобиля. Конечно, на междугородных перевозках многотоннажные грузовики однозначно более уместны, но вот в городе такие машины являются оптимальным вариантом. Ведь во многих случаях даже полуторная «Газель» не окупает себя, перевозя по полтонны полезного груза рейсами по 2-3 километра. Поэтому еще в советские времена различные автозаводы так или иначе пытались решить проблему создания небольших грузовичков для города и сельской местности. В первую очередь это ижевский «каблучок», но можно вспомнить и пикапы на базе автомобилей ВАЗ, построенные на платформе «классических» моделей. Однако последние транспортные средства вряд ли можно рассматривать как полноценные грузовики из-за малой грузоподъемности, да и конструктивной неприспособленности несущего кузова легкового автомобиля к сугубо утилитарным задачам.

И во время экономических изменений в стране возник спрос именно на легкие, маневренные грузовички, которые имели бы достаточную унификацию с уже выпускаемыми моделями автозаводов. Поэтому в 1991 году приказом генерального директора АО «АвтоВАЗ» было создано акционерное общество »a href=»http://www.21century.vaz.ru/Partners/vazinterservice.htm»» «ВАЗинтерСервис» »/a» , перед которым была поставлена задача «основать производство автомобилей-пикапов малой грузоподъемности». И уже с 1993 года малыми сериями начали выпускаться пикапы на базе ВАЗ-21043, объем выпуска которых за время производства (до 1997 года) составил более 2000 машин.

Однако потребитель нуждался в более разнообразной гамме выпускаемых автомобилей, каждый из которых отвечал бы определенным требованиям. Поэтому в 1996 году в структуре ВИС была создана конструкторская служба, специалисты которой разработали принципиально новую полурамную конструкцию грузопассажирского пикапа на базе агрегатов Волжского автозавода, создали целый ряд моделей и модификаций спецавтомобилей. Планом перспективного развития было предусмотрено увеличение выпуска пикапов до 5000 штук в год. Для реализации этой задачи ЗАО «ВИС» в 2000 году был приобретен производственный корпус, в котором объединили подразделения функциональных служб, автосборочного и автоагрегатного заводов, занятые подготовкой производства и изготовлением пикапов, получивший статус завода «ВИС-Авто». Сейчас он производит целую гамму автомобилей — ВИС-2345, -2346, -1705, различные по комплектации, потребительским и функциональным свойствам: шасси, бортовые, с фургоном и жесткой надстройкой, с соответствием нормам токсичности «Евро-2» и «Евро-3», технологический транспорт.

Как отметил Валерий Щукин, директор завода «ВИС-Авто», производимые предприятием пикапы не являются конкурентами выпускаемым крупными сериями автомобилям ИЖ. В отличие от ижевских аналогов тольяттинские пикапы занимают свой сектор рынка, предоставляя потребителю возможность заказать автомобиль в желаемой комплектации, будь то изотермический фургон или цистерна для перевозки кваса. Кроме того, развитая сервисная сеть «АвтоВАЗа» позволяет эксплуатировать пикапы ВИС в тех регионах, где обслуживание ижевских машин затруднительно.

Интересна и перспектива использования автомобилей, построенных на узлах и агрегатах внедорожника «Нива». На маневренный автомобиль полурамной конструкции можно устанавливать достаточно широкий спектр коммунально-дорожной техники, что в условиях города окажется хорошим подспорьем работникам ЖЭКов.

Модель ВИС-2345 по-прежнему занимает основную долю в производстве, за 2003 год было произведено 1939 таких машин. В планах на следующий год намечен выпуск 2500 пикапов на базе «пятерки». Как отмечают специалисты маркетинговой службы, эта модель является наиболее востребованной из-за хорошего соотношения «цена — качество — потребительские характеристики». Однако предприятие выпускает и полноприводные пикапы модели ВИС-2346 на базе «Нивы» с двух- и пятиместной кабиной, полурамные пикапы ВИС-2347 на базе ВАЗ-2109 и коммерческие автомобили ВИС-1705 (грузовые фургоны на базе «Самары»). Перспективная разработка «ВАЗинтерСервиса» была представлена на Московском и Питерском автосалонах в 2003 году. Это модель ВИС-2348 с кузовом от «15-й» модели и ходовой частью от «Нивы», которая наверняка будет востребована и за пределами города, и в уже упомянутой сфере муниципального коммунального хозяйства. Существует еще и разработка ВИС «Капрал» с сочлененным кузовом, который позволяет разворачивать его в вертикальной плоскости относительно кабины на 30 градусов (аналогичный принцип можно встретить на тракторах К-150 и К-701 «Кировец»). Правда, для массового производства эта машина должна пройти сертификацию, которая, в свою очередь, возможна при выпуске хотя бы малыми сериями. Поэтому остается надеяться, что растущая популярность автомобилей off-road даст этому уникальному пикапу дорогу в жизнь.

Интересен и проект тягача на базе легкового автомобиля. Такие машины могут использоваться и на территории крупных заводов для перемещения специфичных грузов, и в аэропортах, не уступая зарубежным аналогам по функциональности и заметно выигрывая у них в стоимости. Один из вариантов седельного тягача с полуприцепом, разработанный в сотрудничестве с фирмой «Technics-Профи-Motors», был также выставлен на автосалоне в Санкт-Петербурге, где вызвал повышенный интерес у автолюбителей и деловых партнеров.

»b» Газета »Биржа плюс Авто» (Н.Новгород)ї 15 от 15.04.04г. »b»

Группа «АВТОВАЗ» является частью бизнес-подразделения Dacia-LADA в структуре Groupe Renault. Компания производит автомобили по полному производственному циклу и комплектующие для 2-х брендов: LADA и Renault. Производственные мощности АВТОВАЗа расположены в Тольятти – АО «АВТОВАЗ”, ОАО “LADA Запад Тольятти”, а также в Ижевске – ООО «LADA Ижевск».

Продукция марки LADA представлена в сегментах В, B+, SUV и LCV и состоит из 5 семейств моделей: Vesta, XRAY, Largus, Granta и Niva. Бренд лидирует на российском автомобильном рынке с долей более 20% и представлен в более чем 20 странах. LADA имеет самую большую официальную дилерскую сеть в России – 300 дилерских центров.

Самые лёгкие грузовики – Основные средства

С. Ионес

Данный материал рассказывает о тех моделях отечественных малотоннажных автомобилей, которые выпускаются в большом количестве и широко представлены в автосалонах.

Обзор автомобилей малой грузоподъемности следует начать с пикапов, созданных на базе легковых машин. Традиционно они считаются транспортом для малого бизнеса. За последние 10 лет на рынке появились пикапы на базе основных отечественных легковых моделей.

В России почти все пикапы по традиции оснащают жестким верхом, иначе невозможно защитить содержимое кузова от злоумышленников. Поэтому такие машины обычно причисляют к фургонам, однако в отличие от многих зарубежных моделей у большинства современных российских пикапов верхняя часть кузова (так называемый «топ») не интегрирована в боковины, а является легкосъемным элементом. Основой кузова таких машин, как Иж-2715, Иж-2717, базовые модели ВИС, является бортовая платформа, и это позволяет расценивать их как пикапы со съемной надстройкой. Фургонами же будем считать такие машины, как ВИС-1705 или модификации ВИС-2345, ВИС-2347, на которых вместо платформы на раме установлена цельная «будка».

У пикапов немало преимуществ. Прежде всего это самые маленькие грузовики. На них удобно пробираться в плотном потоке транспорта, как на обычной легковой машине. Их компактность и маневренность в полной мере проявляются в тесных дворах складов и магазинов. Пикап можно хранить во дворе жилого дома или в обычной «ракушке», ведь он занимает столько же места, сколько и легковой автомобиль. Спрос на пикапы должен возрасти с введением ограничений на въезд в исторический центр крупных городов машин класса «ГАЗель». Наконец, пикап можно доверить даже водителю с квалификацией автолюбителя- «подснежника», который никогда не садился за руль грузовика: ему понадобится только научиться маневрировать «по зеркалам».

В советское время основным производителем пикапов в стране являлся Ижевский автозавод. В 1980-е, когда конструкторы завода разрабатывали новую легковую модель Иж-2126, одновременно создали также пикап Иж-2717 на ее базе. Модель ждала своего часа 10 лет. В 1999 году Иж-2717 пришел на смену стоявшему на конвейере без малого 30 лет Иж-2715. У нового пикапа колесная база по сравнению с легковой машиной удлинена, а вместо пружинной задней подвески установлена рессорная. Расположенный под платформой подрамник заметно отличается от лонжеронов кузова легковой «Оды». Такая конструкция позволила увеличить ресурс автомобиля и поднять грузоподъемность до 600…700 кг. Кузов прежнего Иж-2715 был в значительной мере унифицирован с легковым седаном, а грузоподъемность составляла лишь 450…500 кг.

Довольно долго Иж-2717 оснащали в основном двигателем Уфимского завода УЗАМ-3317, который был создан на базе удачного двигателя прошлых лет УЗАМ-412, а отличался от него в основном увеличенным до 1,7 л рабочим объемом. В последний год отношения между заводами «Ижмаш» и УЗАМ осложнились, поэтому все машины семейства «Ода», включая пикапы, стали комплектовать двигателями ВАЗ-2106.

Фирма «ВАЗинтерсервис» из Тольятти создала пикап, построенный по иной схеме, чем ижевские модели. На старом и новом пикапах Иж кабина с платформой выполнены как единое целое. На автомобилях ВИС к передней половинке легкового кузова приваривают самостоятельную раму, на которую отдельно от кабины устанавливают либо бортовую платформу, либо какой-нибудь специализированный кузов. Задняя подвеска машин ВИС рессорная, причем использованы рессоры от Иж-2717, иногда усиленные дополнительными листами. Грузоподъемность основных моделей пикапов ВИС – 400…500 кг. Первой моделью данной серии стал ВИС-2345 – грузовой вариант «Жигулей» ВАЗ-2105. Его выпустили в удачный момент, когда в Ижевске переходили с «пятнадцатой» на «семнадцатую» модель, а пикапы на какое-то время превратились в дефицит. Потом новая ижевская модель стала массовой, но ВИС уже закрепился на рынке и стал ее достойным конкурентом. Сегодня это самый распространенный пикап ВИС. Популярности ВИС-2345 способствует то, что он базируется на проверенных десятилетиями узлах «Жигулей». Отсюда же его недостатки – большой радиус поворота, избыточное по современным меркам усилие на руле.

По такому же шаблону, как и «45-я» модель, выполнен ВИС-2347, только базой для него послужил ВАЗ-2109. Соответственно это один из немногочисленных отечественных грузовиков с приводом на передние колеса. Усилие на руле у него меньше.

«ВАЗинтерсервис» предоставляет покупателю право выбора: нравится автомобиль классической компоновки – приобретайте ВИС-2345. Больше по душе передний привод – берите ВИС-2347. Грузовые платформы и кузова-фургоны у этих автомобилей одинаковые. Кстати, о кузовах. Помимо бортовых машин с пластиковым «топом» в последнее время все большее распространение получают мебельные, промтоварные и изотермические фургоны. Будки для них строят несколько разных предприятий.

Полноприводного джипа-пикапа отечественный потребитель ждал много лет. Попытку сделать пикап на базе «Нивы» в начале 1990-х предприняла фирма «Восточное кольцо», но ей удалось выпустить только небольшое количество таких автомобилей. Инициативу подхватил «ВАЗинтерсервис». Пикап ВИС-2346 из «Нивы» сделали по той же схеме, что из «Жигулей». У ВИС-2346 в отличие от «45-й» и «47-й» моделей есть две модификации с удлиненной 5-местной кабиной. Такие машины встречаются довольно редко, но все-таки они относятся к серийной продукции и купить их при желании можно.

Свой вариант «Нивы»-пикапа предложил сам Волжский автозавод. В Опытно-промышленном производстве ВАЗа помимо пассажирских версий «Нивы» с удлиненной базой выпустили ее грузовой вариант ВАЗ-2329. В отличие от пикапов ВИС это автомобиль с несущим кузовом, у которого платформа объединена с кабиной. Причем кабина 4-местная, с двумя рядами сидений. Пружинная задняя подвеска от базовой модели определяет меньшую, чем у ВИС-2346, грузоподъемность, но повышает плавность хода.

Среди продукции «ВАЗинтерсервиса» особняком стоит фургон ВИС-1705. Автомобиль построен по иной схеме, чем остальные модели предприятия. Передняя часть и днище кузова целиком взяты от ВАЗ-21099. От легковой машины осталась также пружинная задняя подвеска. Каркас грузового отсека сварен из труб прямоугольного сечения, а наружные панели – пластиковые. Верх несъемный, поэтому ВИС-1705 является не пикапом, а настоящим фургоном. Дизайн автомобиля практически на европейском уровне 1980–1990-х годов. ВИС-1705, как и ВАЗ-2329, сохранил пружинную заднюю подвеску легкового автомобиля, что снижает его грузоподъемность.

Отличной базой для пикапа могла бы стать «Волга», большой и прочный автомобиль с тяговитым, практически грузовым двигателем. В советское время Горьковский автозавод пикапов не выпускал, но ремонтные заводы строили пикапы и фургоны на базе ГАЗ-24. Существовало несколько типовых проектов таких машин, однако в документах Министерства автомобильной промышленности они не числились и собственных индексов у них не было. В 1992–1994 годах автозавод выставлял прототипы пикапа «Бурлак» на базе ГАЗ-31029, но выпустить эту машину серийно не решился, опасаясь, что она станет конкурентом «ГАЗели».

Новой попыткой воплотить идею стал автомобиль ГАЗ-1731 «Трофим», построенный на основе ГАЗ-3110 или ГАЗ-31105 по той же схеме, что и ВИС: «половина» легкового кузова с рамой сзади. Двигатель и агрегаты «Волги», более мощные, чем узлы автомобилей ВАЗ, позволяют такой машине перевозить до 950 кг груза. Кимовский завод «Гидропривод» выпускает «Трофим» в трех исполнениях: фургон 17310В с цельнометаллическим кузовом размерами 2300х1820 мм, пикап 173100 с грузовым отсеком размерами 2120х1795 мм и цельнометаллический фургон-пикап 17310А со съемной верхней частью.

А теперь перейдем к автомобилям, семейства которых состоят из легких грузовиков, фургонов и микроавтобусов. Излишне представлять читателю автомобили семейства «ГАЗель». Эта машина – не просто настоящий хит автомобильного рынка нашей страны. Это эпохальная, знаковая для российского автомобилестроения 1990-х годов модель, открывшая целый класс 1,5-тонных грузовиков. Сегодня выпускаются не только бортовые грузовики, фургоны и автобусы. Достаточно массовой стала модификация с удлиненной кабиной ГАЗ-33023. Все больше на дорогах «ГАЗелей» с удлиненной базой, выпускаемых, правда, не самим ОАО «ГАЗ», а небольшими тюнинговыми фирмами. В 2003 году машина не только пережила рестайлинг, тогда же «ГАЗель» перестали комплектовать устаревшим, но любимым многими водителями двигателем ЗМЗ-402. Недолго продержалась и модификация с похожим по конструкции двигателем УМЗ-421 Ульяновского моторного завода. Теперь все «ГАЗели» оснащают двигателями семейства ЗМЗ-406, современными по конструкции, но дорогими в ремонте.

У «ГАЗели» есть младший брат – «Соболь» грузоподъемностью 900 кг. Он отличается не только укороченной колесной базой, но и полностью измененной конструкцией агрегатов ходовой части. Его семейство состоит из фургонов, автобусов и грузопассажирских «комби». Бортовой «Соболь» ГАЗ-2310 строили серийно, но массового распространения он пока не получил.

У зарубежных производителей самая маленькая по размеру модификация фургона и автобуса с короткой базой и низкой крышей считается самой демократичной. Почему-то модификацию «Соболя» с низкой крышей и поднимаемой наверх задней дверью ГАЗ позиционирует как микроавтобус класса «люкс» и выпускает только в пассажирском варианте. Эта машина носит собственную марку «Баргузин».

Настоящие ветераны отечественного рынка малотоннажных автомобилей – бескапотные УАЗы. Широко распространено мнение, что УАЗ-3303 и УАЗ-3741 – «устаревшие» модели, что у них очень низкий уровень комфорта для водителя и пассажиров. На самом деле УАЗ – уникальный автомобиль, незаменимый в тяжелых дорожных условиях. Это настоящий автомобиль для России, сделанный без оглядки на пресловутый «мировой уровень». Он сочетает в себе проходимость настоящего вездехода, компактность легкового автомобиля и вместимость грузовика. В последние годы завод делает определенные шаги, чтобы повысить уровень комфорта в кабине.

Например, на грузовики и микроавтобусы последних выпусков устанавливают современные сиденья от легкового внедорожника. Возможно, на сегодня эта машина – не самый лучший вариант для перевозки грузов в большом городе, но в районах с плохими дорогами она просто незаменима. Впрочем, для УАЗа нашлась работа и в городе. Такими машинами пользуются ремонтные бригады коммунальных служб. Особый комфорт для них значения не имеет: ездят они на короткие расстояния. Зато исключительная проходимость автомобиля УАЗ позволяет без проблем штурмовать сугробы, раскисшие газоны и ледяные горки во дворах. Именно у коммунальщиков пользуется спросом бортовой УАЗ-39094 с удлиненной 5-местной кабиной.

Конечно, российским моделям малотоннажных грузовых автомобилей есть достойная альтернатива. Рынок нашей страны насыщен иномарками аналогичного класса, причем подержанные часто стоят не дороже, чем новые отечественные автомобили. Особенно это относится к микроавтобусам, фургонам и легким бескапотным грузовикам. И все-таки потребитель не отказывается от поддержки отечественного производителя. В этом секторе рынка российское автомобилестроение на внутреннем рынке остается конкурентоспособным.



Помимо отечественных малотоннажных автомобилей, выпускаемых в настоящее время, на рынке представлены недорогие подержанные модели, снятые с производства в недавнем прошлом. Найти хорошо сохранившийся экземпляр любой из них вполне реально. Прежде всего это Иж-2715, классический советский пикап, модификация устаревшего, но добротного автомобиля «Москвич». Простой, дешевой в ремонте машине требуется тем не менее обязательная замена старых диагональных шин на современные радиальные. Экономия на антикоррозионной обработке кузова и регулярные перегрузки быстро «убивают» такой автомобиль.

Первый в России серийный грузовик с передним приводом «Москвич-2335» распространен меньше, так как «тираж» был небольшой. Автомобиль исключительно удобный для ремонта, но требующий грамотной эксплуатации. Другие его достоинства – большая вместимость и грузоподъемность 700…800 кг. Недостаток – дорогие запчасти.

О массовом микроавтобусе РАФ-2203 мнения противоречивые. У машины, построенной на компромиссах, много недостатков, однако большая вместимость, ремонтопригодность кузова и «волговских» агрегатов, а также низкая цена привлекают многих.

Наконец, «ГАЗель» старого образца, выпущенная до 2003 года. Чем-то хуже, а чем-то лучше нынешней. И главное, что, выбирая старую «ГАЗель», легко найти экземпляр с дешевым в эксплуатации двигателем ЗМЗ-402.

GPVN.RU / Автомобили ВАЗ / Производители / ВАЗИнтерСервис

Производство грузопассажирских коммерческих автомобилей

Пожарно-спасательный автомобиль ВИС 29476

ВИС 29476 — разработка конструкторов ЗАО «ВАЗИнтерСервис» представляет собой маневренный пожарно-спасательный автомобиль ВИС-29476, который оснащен новейшим оборудованием НПО «Простор» (г. Москва) и имеет ряд преимуществ, что делает его поистенне уникальным.

Пожарно-спасательный автомобиль ВИС 2946

ВИС 2946 является автомобилем постоянной готовности, средством повышенной мобильности пожарно-спасательных подразделений сил МЧС России, специальных служб других ведомств.

ВИС 23472

ВИС 23472 — двухместный пикап c изотермическим или промтоварным фургоном.

ВИС 2347-0000012-30

ВИС 2347 — двухместный бортовой пикап с пластиковой надстройкой.

ВИС 2347-0000010-30

ВИС 2347 — двухместный переднеприводной пикап на базе узлов и агрегатов Lada Samara. Задняя подвеска — рессорная. Полурамная конструкция кузова. Оснащается бензиновым двигателем объемом 1,6 литра (80,9 л.с.). Грузоподъемность — до 600 кг. Полная масса — 1790 кг.

ВИС 234600-30

ВИС 2346 — двухместный полноприводный пикап на базе узлов и агрегатов Lada 4х4. Задняя подвеска — рессорная. Полурамная конструкция кузова. Оснащается бензиновым двигателем объемом 1,7 литра (80,9 л.с.). Грузоподъемность — до 600 кг. Полная масса — 1950 кг.

ВИС 2346100-30

ВИС 23461 — пятиместная грузопассажирская версия полноприводного пикапа на базе узлов и агрегатов Lada 4х4. Задняя подвеска — рессорная. Полурамная конструкция кузова. Оснащается бензиновым двигателем объемом 1,7 литра (80,9 л.с.). Грузоподъемность — до 260 кг. Полная масса — 1950 кг.

ВИС 234500-30

ВИС 2345 — двухместный заднеприводный пикап на базе узлов и агрегатов Lada 2107. Задняя подвеска — рессорная. Полурамная конструкция кузова. Оснащается бензиновым двигателем объемом 1,5 литра (71 л.с). Грузоподъемность — до 600 кг. Полная масса — 1790 кг.

ВИС 234520-30

ВИС 23452 — двухместный пикап c изотермическим или промтоварным фургоном.

ВИС 23454

ВИС 23454 — двухместный тягач на базе узлов и агрегатов автомобиля Lada 2107. Тягач оснащается полуприцепом, который модет быть в бортовом исполнении (длина 3,9 м) или рамный (длина 5,7 м). Тягач оснащается бензиновым двигателем ВАЗ 21214 объемом 1,7 литра (80,9 л.с.). Грузоподъемность полуприцепа — до 1000 кг. Полная масса автопоезда — 2950 кг.

Грузовые «Жигули»

С. Ионес, фото автора

Ровно 40 лет назад, в марте 1966 года, на Женевском автосалоне был впервые показан автомобиль «Фиат-124». На его базе разработано семейство «Жигулей», которому в России была суждена долгая счастливая жизнь. На исходе прошлого века «Жигули» послужили основой для грузового пикапа ВИС-2345. За несколько лет он приобрел массовое распространение, а после прекращения выпуска пикапа Иж-2717 стал основной отечественной моделью такого типа.

Существует мнение, что автомобиль «Жигули» меньше приспособлен для перевозки грузов, чем «Москвич» или «Ода». А тем не менее владельцы «вазовских» седанов и универсалов возят на своих машинах грузы, по массе сопоставимые с теми, что можно перевезти на ижевском «каблуке». Даже несущий кузов и пружинная задняя подвеска выдерживают такое обращение. «Половинка» грузовой рамы и рессоры сзади позволили фирме «ВИС» превратить «Жигули» в настоящий грузовичок. Установить будку промтоварного или изотермического фургона на открытую раму ВИСа оказалось проще, чем «вписать» такой же кузов в платформу ижевского пикапа.

Как и всякий пикап, ВИС-2345 унаследовал многие особенности базового легкового автомобиля. Водитель, выбирая машину, непременно оценивает интерьер кабины. Споры об эргономике «Жигулей» идут давно. Многим не нравится, что из-за характерного расположения педалей приходится сгибать колени сильнее, чем в «Москвиче» и «Оде», жалуются и на сильно наклоненный руль. Кто-то станет утверждать, что руль немного смещен в сторону относительно педалей и сиденья.

Рабочее место водителя: как на легковушке

Наконец, мягкие сиденья от ВАЗ-2105 одним нравятся, а другим нет. Мнение автора не совсем объективно: я отношусь к числу поклонников «Жигулей». Мне и посадка за рулем кажется приемлемой, и мягкие сиденья – что надо. В конце концов, если не по вкусу «пятые» сиденья, на те же точки крепления можно установить кресла от ВАЗ-2107. Возможно, они покажутся более удобными…

Почти у любого пикапа спинка сиденья упирается в заднюю стенку кабины, таким образом сокращая диапазон его регулировки. ВИС-2345 – не исключение. Между спинками сидений и задней стенкой кабины остается место для чемодана с инструментом или небольших сумок. У «45-го» ВИСа эта ниша меньше, чем у Иж-2715. Держать запасное колесо за пассажирским сиденьем в пикапе из Тольятти практически невозможно.

Определенные преимущества «Жигулей» не вызывают сомнения. Прежде всего, тонкие стойки и высокие стекла обеспечивают отличную обзорность. У «45-й» модели все в порядке и с задней обзорностью. ВИС в отличие от «Ижмаша» не оснащал пикап зеркалами от легковой машины. На двери кабины грузовичка на заводе ставят большие зеркала на стойках. В них неплохо видна дорога слева и справа. Если же такое зеркало снесут при неосторожном маневре или разобьют на стоянке – невелика беда: оно есть в свободной продаже. Кстати, «висовские» наружные зеркала завоевали популярность у владельцев машин других марок: их ставят на «Нивы», УАЗы и ижевские пикапы.

Двигатель «Жигулей» всем хорошо известен

Другое достоинство «Жигулей» – очень теплая «печка». К тому же у пикапа она отапливает кабину, которая намного меньше салона седана. Более того, конструкторы «ВАЗинтерСервиса» предусмотрели на боковинах решетки вытяжной вентиляции, которых на других отечественных пикапах нет.

Есть, конечно, у ВИС-2345 конструктивные недостатки. Угол поворота управляемых колес у «Жигулей» меньше, чем у «Москвича» или «Оды». Колесная база пикапа длиннее, чем у легковой машины (2800 мм против 2424). Поэтому радиус поворота получился слишком большой для развозного автомобиля. Кто-нибудь пожалуется, что руль у ВИС-2345 «тяжелее», чем у ИЖ-2717 или у ВИС-2347, сделанного на базе «девятки». Червячный рулевой механизм требует большего усилия, чем реечный. Но нормальный мужчина справится с таким рулем, а для тех, кто водил грузовой ГАЗ без гидроусилителя, проблем и вовсе не возникнет.

Машины «ВИС» имеют свои особенности поведения на дороге. Их аэродинамика хуже, чем у легковых «Жигулей». Не случайно передняя часть пластикового верха бортового кузова скошенная, а боковины скругленные. Это уменьшает объем кузова, но придает ему обтекаемость, пусть минимальную. Прямоугольный кузов изотермического или товарного фургона на высокой скорости «загребает» воздух, как лопата. Чем выше кузов, тем сильнее это чувствуется. Лобовое сопротивление особенно заметно на машинах, у которых большая «будка» с задней дверью в виде рольставней.

Решетка вытяжной вентиляции

Владельцам фургонов стоит установить на крышу кабины обтекатель, который если не устранит, то уменьшит этот недостаток. Не следует забывать, что фургоны на трассе чувствительны к боковому ветру.

От любителей активного стиля вождения приходилось слышать, что на порожнем ВИС-2345 намного легче, чем на «Жигулях», сорвать в занос заднюю ось. Наверное, в задней подвеске пригодился бы стабилизатор поперечной устойчивости. Вопрос к производителю: не пора ли подумать о стабилизаторе, если не в серийной комплектации, то, как минимум, в качестве «опции», продаваемой в магазинах запчастей.

Двигатель и коробка передач от ВАЗ-2103 способны долго и без больших проблем служить на груженом пикапе. Важно только грамотно провести обкатку новой машины. Желательно не экономить на хорошем масле.

Известно, что у грузового автомобиля сцепление подвергается большим нагрузкам и изнашивается быстрее, чем у легкового. Когда потребует замены ведомый диск, новый лучше ставить не от «Жигулей», а от «Нивы». А еще лучше не пожалеть денег на надежный импортный комплект корзины с диском.

Полезное дополнение – обтекатель

К счастью, проблем с ремонтом «вазовских» узлов нет. Запчасти для «Жигулей» продаются во многих магазинах, стоят недорого, ремонтировать силовой агрегат или переднюю подвеску возьмутся практически в любом сервисе. Не страшно также разбить взятые от «ГАЗели» задние фонари: их продают в любом отделе, торгующем запчастями к автомобилям ГАЗ.

В то же время у ВИС-2345 есть ряд оригинальных узлов. Карданный вал, система выпуска отработавших газов, трос стояночного тормоза, бензобак «45-го» не унифицированы с другими машинами. Фирме «ВАЗинтерСервис», занимающейся производством запчастей и комплектующих, не составило труда освоить выпуск небольшого количества оригинальных деталей для грузовичка.

Не все знают, что у машин ВИС-2345 встречается два варианта задней подвески. Первый применяют на бортовых пикапах и некоторых фургонах. Главная особенность такой подвески – рессоры проложены под задним мостом, как у «Москвича-412». У второго типа подвески рессоры установлены над задним мостом, как на УАЗе или полноприводном «Москвиче-410». Рессоры этой модификации снабжены дополнительными листами-подрессорниками, вступающими в работу при загруженном кузове. Такая подвеска характерна прежде всего для фургонов с тяжелой «будкой». В последнее время появились бортовые пикапы с рессорами над мостом. Борта платформы у них заметно ниже, чем у модификации с рессорами под мостом. Кузов машины как будто «подрезали» на несколько сантиметров, сократив полезный объем.

При нижнем расположении рессор выхлопная труба расположена сбоку

При осмотре бывшей в употреблении машины ремонтники рекомендуют обратить особое внимание на задние кронштейны крепления рессор к раме. Из-за постоянной перегрузки у ВИСа они нередко оказываются погнутыми.

На указанных модификациях машины используются разные системы выпуска отработавших газов. У варианта с рессорами под мостом выхлопная труба находится в базе, «выглядывает» из-под платформы перед левым задним колесом. При втором типе подвески с рессорами над мостом глушитель и выхлопная труба находятся в заднем свесе справа, в привычном для владельцев «Жигулей» месте. Но выпускные трубы отличаются от тех, которыми оснащают легковые машины.

Встретить в продаже карданный вал, глушитель и трос ручного тормоза для ВИСа сложнее, чем те же детали для «Жигулей». Во многих московских магазинах такой товар отсутствует. Нам удалось найти детали грузового ВИСа в некоторых фирмах, владеющих сетью магазинов запчастей. Причем карданный вал и глушитель в отдельных магазинах не лежали на прилавке, а числились в компьютере у продавца. Понадобится – подходите и спрашивайте! Кстати, в «сетевых» магазинах нашлись и некоторые мелкие детали тольяттинского пикапа. Например, замки бортов.

При верхнем расположении рессор выхлопная труба справа сзади

Возможно, есть резон поискать «дефицитные» систему выпуска или трос ручного тормоза на рынках еще до того, как эти детали выйдут из строя. Вы будете заранее знать, в какой ларек обращаться.

Пикапы на заводе комплектуют специально разработанными для грузовых модификаций шинами размерности 185/75 R13. Чаще встречается модель Я-427 Ярославского завода, реже – «Кама-231». Рисунок протектора «Камы» лучше подходит для езды зимой. В отличие от памятной многим автомобилистам «грузовой» 13-дюймовой резины М-100, две названные модели радиальные. Однако такие покрышки слишком тяжелые для независимой передней подвески легковой машины. Прежде всего, колеса большой массы активно расходуют ресурс шаровых опор. У «Жигулей» этот узел, как известно, требует особого внимания. Каков выход?

Ставить усиленные шаровые опоры – значит сделать руль еще тяжелее. Можно подобрать меньшие по весу шины размерности 175/70 R13 или 165/80 R13. Важно только выбрать модель, которая подходит пикапу по индексу грузоподъемности.

Промтоварный фургон

От избыточного веса шин у «Жигулей» в отличие от «Москвича», «Оды» и переднеприводных автомобилей страдают рычаги и даже балка подвески. Если много ездить на таких шинах с высокой скоростью, особенно по плохой дороге, дело может дойти до разрушения передних лонжеронов кузова, знакомого тем, кто имел дело с сильно изношенными «Жигулями».

Без сомнения, ВИС-2345 – автомобиль, спроектированный с большим количеством компромиссов. Но если не экономить на антикоррозионной обработке кузова, фирменном масле для двигателя, коробки передач и заднего моста, если по инструкции провести обкатку новой машины и не перегружать ее на первых тысячах пробега, если беречь переднюю подвеску, то даже такой грузовик будет служить долго, не доставляя больших проблем.

Milwaukee 2347-XL M12 12V Li-Ion Комплект куртки с подогревом — XL

CPO Commerce, LLC («CPO») управляет веб-сайтами, расположенными по адресу www.cpooutlets.com, и другими веб-сайтами, на которых появляется копия этой политики конфиденциальности (в совокупности «Сайты CPO»), в качестве услуги для своих клиентов, проживающих в США. Штаты Америки, их территории и владения. CPO является владельцем или авторизованным пользователем контента, отображаемого на сайтах CPO.

CPO принял эту политику конфиденциальности, чтобы сообщить вам следующее:

  • Как мы собираем информацию на сайтах CPO.
  • Типы информации, которую мы собираем на сайтах CPO.
  • Как мы используем собираемую информацию.
  • Обстоятельства, при которых CPO может раскрывать информацию, собранную на сайтах CPO, третьим лицам.
  • Варианты, доступные вам на сайтах CPO в отношении сбора и использования вашей информации.
  • Процедуры безопасности, которые мы внедрили для защиты вашей личной информации.

Для целей этой политики конфиденциальности «Личная информация» — это личная информация об отдельном лице, как более подробно описано в применимых законах о конфиденциальности. Вам следует внимательно ознакомиться с этой политикой конфиденциальности перед использованием сайтов CPO.

Если у вас есть вопросы или опасения относительно этой политики конфиденциальности или сайтов CPO, вам следует связаться с нами, вам следует связаться с нами (см. Раздел 12).

1. Сфера действия политики

Настоящая политика конфиденциальности применяется к использованию вами Сайтов CPO и обработке CPO информации, включая Личную информацию, собранную CPO или от ее имени через Сайты CPO.Использование вами связанных или связанных веб-сайтов или веб-сайтов, на которые вы можете быть перенаправлены, может регулироваться другими или дополнительными условиями, уведомлениями и политиками, и такие условия, уведомления и политики должны регулировать эти веб-сайты. Для получения информации о сборе и использовании информации на любом из этих веб-сайтов или других сторонних сайтах, пожалуйста, ознакомьтесь с условиями использования и политиками, предоставленными этими веб-сайтами.

ПРИМЕЧАНИЕ. НАСТОЯЩАЯ ПОЛИТИКА КОНФИДЕНЦИАЛЬНОСТИ НЕ ПРИМЕНЯЕТСЯ К ИНФОРМАЦИИ, ПРЕДОСТАВЛЯЕМОЙ ВЫ ДОБРОВОЛЬНО ИЛИ НЕДОБРОВОЛЬНО, ЧЕРЕЗ ОТВЕТЫ НА НЕКОТОРЫЕ ЗАПРОСЫ ОБСЛЕДОВАНИЯ, НАЧИНАЯ НА САЙТАХ CPO.НЕКОТОРЫЕ ИЗ ЭТИХ ИССЛЕДОВАНИЙ проводит YAHOO! INC. И ДРУГИЕ ТРЕТЬИ СТОРОНЫ. ТАКАЯ ИНФОРМАЦИЯ БУДЕТ УПРАВЛЯТЬСЯ ПРИМЕНИМОЙ ПОЛИТИКОЙ КОНФИДЕНЦИАЛЬНОСТИ (IES) YAHOO! INC. ИЛИ ДРУГИМИ ТРЕТЬИМИ ЛИЦАМИ.

2. Наши методы сбора информации

Информация, собираемая автоматически. Когда вы посещаете сайты CPO для размещения заказа, просмотра, чтения или загрузки информации, мы можем автоматически собирать и хранить следующие типы нелично идентифицируемой информации:

  • Информация, собираемая в виде журналов сервера на основе информации, предоставленной вашим браузером.
  • Статистика переходов.
  • Ваш IP-адрес.
  • Тип веб-браузера, который вы используете для доступа к сайтам CPO.
  • Тип используемой операционной системы.
  • Имя домена и хоста, с которого вы выходите в Интернет.
  • Дата и время доступа к сайтам CPO.
  • Интернет-адрес сайтов, с которых вы напрямую перешли на CPO Sites.

Персональная информация, добровольно предоставленная пользователем. Вы можете использовать части Сайтов CPO без предоставления какой-либо личной информации. Однако для того, чтобы воспользоваться всеми возможностями сайтов CPO и получить доступ и использовать многие функции, имеющиеся на сайтах CPO, включая размещение заказов на продукты, предлагаемые для продажи на сайтах CPO, и получение CPO эксклюзивные сообщения электронной почты, вы должны предоставить определенную личную информацию.Вы также можете предоставлять Личную информацию, когда участвуете в различных услугах и предложениях на сайтах CPO. Личная информация может включать, без ограничений:

  • Ваше имя, почтовый адрес, адрес электронной почты, номер телефона, номер факса, платежная информация, номер кредитной карты и сопутствующая информация.
  • Информация о ваших интересах, профессии, использовании продукта и предпочтениях.

Вас также могут попросить ответить на дополнительные вопросы, чтобы помочь нам удовлетворить ваши потребности.Некоторые функции на сайтах CPO, такие как функция «Отправить эту страницу другу по электронной почте», могут потребовать от вас предоставления информации о третьих лицах. Точно так же, если вы запрашиваете отправку заказа или подарка непосредственно другому лицу, а не вам, вас также попросят предоставить информацию о получателе заказа или подарка. Эта информация может включать имя третьей стороны, адрес, номер телефона, номер факса, адрес электронной почты и другую подобную информацию.

3.Информация Гарантия

Если вы предоставляете Личную информацию через Сайты CPO, включая Личную информацию о лицах, кроме вас самих, вы гарантируете, что (i) у вас есть полномочия предоставлять эту Личную информацию и предоставлять CPO право использовать такую ​​Личную информацию в соответствии с настоящим Соглашением. политика конфиденциальности, (ii) вы предоставили эту Персональную информацию добровольно и (iii) вы соглашаетесь на использование этой Персональной информации в соответствии с настоящей политикой конфиденциальности.

4. Использование и раскрытие информации

Использование автоматически собираемой информации. Информация, автоматически собираемая через сайты CPO, предоставляет нам информацию об использовании вами сайтов CPO, в том числе о том, какие страницы наиболее популярны среди пользователей сайтов CPO. Эта информация также позволяет нам определять, правильно ли работают сайты CPO, и вносить изменения в сайты CPO, чтобы пользователь мог лучше взаимодействовать с сайтами CPO.Мы не используем эту информацию для идентификации конкретного пользователя.

Мы можем агрегировать и использовать определенную информацию, не позволяющую установить личность, в исследовательских или маркетинговых целях, а также можем передавать, продавать и сдавать в аренду или обменивать полученную информацию и статистическую информацию с нашими партнерами по маркетингу, рекламодателями или другими третьими сторонами.

Использование информации, не позволяющей установить личность, добровольно предоставленной пользователем. Оставаясь включенным в наш список рассылки, вы подтверждаете, что мы можем продавать, сдавать в аренду, делиться, обменивать или иным образом предоставлять или передавать вашу неличную информацию, такую ​​как демографические и профессиональные данные, третьим лицам.Такие третьи стороны могут использовать такую ​​информацию для любых целей, которые они пожелают, или могут передавать такую ​​информацию другим третьим лицам.

Использование информации в коммерческих целях. CPO использует личную информацию, которую вы нам предоставляете, для внутренних деловых целей, таких как (i) для проверки при входе в систему в качестве зарегистрированного пользователя, если применимо; (ii) в маркетинговых целях; (iii) связаться с вами по поводу продуктов или услуг, которые вы заказали или запросили, и предоставить то же самое; (iv) для проведения рекламных акций, включая, помимо прочего, розыгрыши, конкурсы или подписки, в которых вы участвовали; (v) обрабатывать и отправлять заказы; (vi) для отправки подтверждений заказа и отгрузки; (vii) для обслуживания клиентов, ответа на ваши запросы и запросы и улучшения предложения продуктов и услуг; (viii) вести учет заказов, возвратов и обменов; (ix) для защиты вас и нас от ошибок и мошенничества; (x) для отправки информации, предупреждений о продуктах и ​​услугах и эксклюзивных предложений; (xi) для записи использования Сайтов CPO; (xii) для настройки Сайтов CPO в соответствии с вашими личными предпочтениями; и (xiii) настраивать рекламную и маркетинговую информацию о наших продуктах и ​​услугах.Мы также можем обмениваться информацией, включая Личную информацию, с другими компаниями и организациями для защиты от кредитного мошенничества и снижения рисков.

Поставщики услуг и продавцы. Мы также можем передавать вашу Личную информацию определенным третьим сторонам, которые предоставляют услуги для CPO. Эти третьи стороны могут размещать Сайты CPO, управлять определенными функциями Сайтов CPO, распечатывать или отправлять рассылки, предоставлять маркетинговые материалы для Сайтов CPO, авторизовывать и обрабатывать ваши платежи, обеспечивать обслуживание клиентов, анализировать данные и помогать в выполнении ваших заказов, отправлять электронные письма от имени CPO или иным образом помогают CPO в работе сайтов CPO.Эти третьи стороны не имеют права использовать или раскрывать вашу Личную информацию для каких-либо целей, кроме оказания услуг, указанных CPO.

Совместные службы баз данных. Мы можем участвовать в совместных службах баз данных. Эти услуги помогают нам направлять печатные рассылки и другие маркетинговые инициативы соответствующим покупателям и посетителям веб-сайтов. Имена и почтовые адреса могут совместно использоваться участвующими сторонами в услугах совместной базы данных, но кооперативу не предоставляется информация о кредитной карте или адреса электронной почты.

Деловые переводы. Автоматически собираемая информация и ваша личная информация могут быть переданы в качестве актива в связи со слиянием или продажей, включающей все или часть CPO, или как часть корпоративной реорганизации, продажи акций или другой смены контроля.

Требования к раскрытию информации. CPO может также предоставить вашу Личную информацию третьей стороне, если CPO добросовестно считает, что доступ, использование, сохранение или раскрытие разумно необходимы для удовлетворения любого применимого закона, постановления, судебного процесса или имеющего исковую силу запроса правительства.Например, от CPO может потребоваться раскрыть вашу Личную информацию для ответа на повестку в суд, постановление суда или другой судебный процесс.

5. Согласие на обработку и передачу информации

CPO может передавать информацию, которую вы отправляете нам, включая, помимо прочего, Личную информацию, получателям в странах, которые не обеспечивают такой же уровень правовой защиты данных, как страна, из которой вы получаете доступ к Сайтам CPO. Используя Сайты CPO, вы даете согласие на такую ​​передачу и обработку этой информации CPO.

6. Уведомление для родителей

Сайты CPO считаются сайтами для широкой аудитории и не предназначены для использования детьми. CPO не продает товары, предназначенные для детей, и не намеревается собирать Личную информацию от лиц младше восемнадцати (18) лет. Если вы являетесь родителем или опекуном ребенка, который предоставил нам личную информацию, сообщите нам, как указано в разделе 12 ниже, и мы удалим эту личную информацию.

7. Использование файлов cookie

Файлы cookie

— это фрагменты информации, которые веб-сайт передает на жесткий диск человека для идентификации предыдущих посетителей этих сайтов. Файлы cookie — это текстовые файлы, которые вы можете отклонить или удалить в любое время. Вы можете отключить файлы cookie в настройках вашего интернет-браузера. Однако, удаляя или отклоняя файлы cookie, вы можете помешать работе пользователей на сайтах CPO и других сайтах. Например, для совершения онлайн-транзакций необходимо принимать файлы cookie.

CPO использует файлы cookie для хранения информации о вашем посещении сайтов CPO, чтобы улучшить ваше посещение сайтов CPO. Например, хранение этой информации позволит нам иногда настраивать страницы учетной записи для вас. Мы также используем файлы cookie и технологии отслеживания для:

  • Отслеживайте посещения пользователей.
  • Отслеживайте свою корзину и покупки.
  • Определите, какие настройки отображаются чаще всего.
  • Сохраните свой пароль, чтобы вам не приходилось вводить его каждый раз при посещении сайтов CPO.

Кроме того, в настоящее время мы заключаем контракты с несколькими онлайн-партнерами для помощи в управлении и оптимизации сайтов CPO. Мы пользуемся услугами маркетинговой компании, чтобы помочь нам измерить эффективность нашей рекламы и то, как посетители используют наши сайты. Для этого мы используем веб-маяки и файлы cookie, предоставляемые нашей маркетинговой компанией на сайтах CPO. Тип информации, которую мы собираем, включает, какие страницы посещаются, какие продукты помещаются в корзину, какие заказы попадают в процесс оформления заказа, какие проверки выполняются с оплатой и т. Д.Пополняя наши записи, эта информация помогает нам узнать, какие страницы наиболее привлекательны для наших посетителей, какие из наших продуктов больше всего интересуют наших клиентов и какие предложения хотят видеть наши клиенты. Хотя наша маркетинговая компания управляет информацией, поступающей с наших сайтов от нашего имени, мы контролируем, как эти данные могут и не могут использоваться. Если вы не хотите помогать нам узнать, как улучшить наши сайты, продукты, предложения и маркетинговую стратегию, вы можете отказаться от нашей возможности анализировать такие данные, связавшись с нами (см. Раздел 12).

8. Безопасность

CPO и уполномоченные третьи стороны принимают разумные меры, включая административные, технические и физические меры, для защиты вашей Личной информации от несанкционированного доступа, потери, изменения, использования или раскрытия. Например, любая личная информация, которую вы вводите при размещении заказа на продукт, включая, помимо прочего, вашу кредитную карту и другую личную информацию, шифруется перед передачей на серверы сайтов CPO с использованием 128-битного шифрования Secure Sockets Layer, если оно поддерживается. вашим браузером.Кроме того, мы используем разумные меры для ограничения раскрытия вашей личной информации в соответствии с настоящей политикой конфиденциальности. Однако ваша личная информация никогда не может быть защищена на 100%: информация может передаваться по сетям без соответствующих мер безопасности и может быть доступна, удалена, изменена, использована или раскрыта неуполномоченными лицами. Вы можете помочь нам защитить вашу Личную информацию, (i) не передавая свой пароль или другую информацию учетной записи третьим лицам, (ii) используя безопасный веб-браузер и (iii) часто меняя свой пароль.

9. Управление вашей информацией

CPO оставляет за собой право сохранять любую личную информацию, разумно необходимую для надлежащего документирования своей коммерческой деятельности, а также для целей архивирования и хранения записей. Мы будем хранить вашу личную информацию столько времени, сколько разумно необходимо для целей, описанных в этой политике конфиденциальности. Вы можете узнать более подробную информацию об этой политике конфиденциальности, связавшись с нами (см. Раздел 12).

Вы можете «отказаться» от получения в будущем электронных писем или других сообщений от нас, щелкнув ссылку «отказаться от подписки» в нижней части любого электронного письма, которое вы получаете от нас, или связавшись с нами (см. Раздел 12).Обратите внимание, что удаление вашей личной информации из нашей базы данных или «отказ» не остановит (i) маркетинговый или рекламный контент, который готов к отправке по почте или находится в очереди для передачи вам до того момента, когда мы сможем реализовать ваш запрос. или (ii) использование вашей личной информации третьими сторонами, с которыми CPO, возможно, уже поделился вашей информацией.

10. Обновления и изменения политик

CPO может время от времени изменять эту политику конфиденциальности, размещая здесь обновленные версии политики конфиденциальности.Поскольку мы можем вносить изменения в эту политику конфиденциальности в любое время, не уведомляя вас, мы предлагаем вам просматривать эту политику конфиденциальности каждый раз, когда вы получаете доступ к Сайтам CPO или используете их. Обратите внимание, что наши права на использование вашей личной информации будут основываться на политике конфиденциальности, действующей на момент сбора информации.

11. Связаться с CPO

Если у вас есть вопросы относительно сайтов CPO, политики конфиденциальности или вашей конфиденциальности на сайтах CPO, вы можете отправить запрос с любыми дополнительными вопросами в наш отдел обслуживания клиентов по электронной почте privacy @ cpooutlets.com или по почте на:

Розетки CPO
P.O. Box 50768
Пасадена, CA

Права на конфиденциальность в Калифорнии

В соответствии с законодательством Калифорнии жители Калифорнии имеют право потребовать, чтобы CPO не делился своей личной информацией с третьими сторонами для использования этими третьими сторонами в прямом маркетинге. Чтобы сделать такой запрос, напишите нам по адресу [email protected] или по почте:

Розетки CPO
П.О. Box 50768
Пасадена, CA

Действует с 31 декабря 2007 г.

% PDF-1.4 % 1013 0 объект > эндобдж xref 1013 411 0000000016 00000 н. 0000010273 00000 п. 0000010362 00000 п. 0000010628 00000 п. 0000015459 00000 п. 0000016103 00000 п. 0000016678 00000 п. 0000017209 00000 п. 0000017529 00000 п. 0000017568 00000 п. 0000017618 00000 п. 0000017667 00000 п. 0000017717 00000 п. 0000017767 00000 п. 0000017818 00000 п. 0000017868 00000 п. 0000017918 00000 п. 0000017967 00000 п. 0000018016 00000 п. 0000018065 00000 п. 0000018115 00000 п. 0000018165 00000 п. 0000018215 00000 п. 0000018265 00000 п. 0000018314 00000 п. 0000018363 00000 п. 0000018413 00000 п. 0000018463 00000 п. 0000018513 00000 п. 0000018563 00000 п. 0000018613 00000 п. 0000018663 00000 п. 0000018713 00000 п. 0000018763 00000 п. 0000018812 00000 п. 0000018862 00000 п. 0000018911 00000 п. 0000018961 00000 п. 0000019011 00000 п. 0000019061 00000 п. 0000019111 00000 п. 0000019161 00000 п. 0000019211 00000 п. 0000019261 00000 п. 0000019311 00000 п. 0000019360 00000 п. 0000019409 00000 п. 0000019458 00000 п. 0000019509 00000 п. 0000019560 00000 п. 0000019609 00000 п. 0000019659 00000 п. 0000019709 00000 п. 0000019758 00000 п. 0000019807 00000 п. 0000019857 00000 п. 0000019908 00000 п. 0000019957 00000 п. 0000020006 00000 п. 0000020056 00000 п. 0000020106 00000 п. 0000020156 00000 п. 0000020206 00000 п. 0000020255 00000 п. 0000020305 00000 п. 0000020354 00000 п. 0000020405 00000 п. 0000020454 00000 п. 0000020504 00000 п. 0000020553 00000 п. 0000020602 00000 п. 0000020651 00000 п. 0000020701 00000 п. 0000020751 00000 п. 0000020801 00000 п. 0000020852 00000 п. 0000020902 00000 н. 0000021322 00000 п. 0000021731 00000 п. 0000021810 00000 п. 0000021888 00000 п. 0000025217 00000 п. 0000027403 00000 п. 0000028033 00000 п. 0000030698 00000 п. 0000030994 00000 п. 0000031406 00000 п. 0000031609 00000 п. 0000033266 00000 п. 0000035692 00000 п. 0000037609 00000 п. 0000039098 00000 н. 0000041274 00000 п. 0000062857 00000 п. 0000069887 00000 п. 0000072012 00000 н. 0000074707 00000 п. 0000079894 00000 п. 0000079949 00000 н. 0000080004 00000 п. 0000084194 00000 п. 00000

00000 п. 00000 00000 п. 00000

00000 п. 00000 00000 н. 00000

00000 н. 00000 00000 п. 0000091253 00000 п. 0000091413 00000 п. 0000091641 00000 п. 0000092193 00000 п. 0000092622 00000 п. 0000092690 00000 п. 0000092885 00000 п. 0000093058 00000 п. 0000093243 00000 п. 0000093314 00000 п. 0000093500 00000 п. 0000093697 00000 п. 0000093765 00000 п. 0000093961 00000 п. 0000094038 00000 п. 0000094230 00000 п. 0000094417 00000 п. 0000094482 00000 п. 0000094672 00000 п. 0000094837 00000 н. 0000095104 00000 п. 0000095193 00000 п. 0000095393 00000 п. 0000095448 00000 п. 0000095655 00000 п. 0000095833 00000 п. 0000095888 00000 п. 0000096071 00000 п. 0000096268 00000 п. 0000096449 00000 п. 0000096636 00000 п. 0000096833 00000 п. 0000097005 00000 п. 0000097206 00000 п. 0000097387 00000 п. 0000097608 00000 п. 0000097670 00000 п. 0000097887 00000 п. 0000098074 00000 п. 0000100111 00000 н. 0000125410 00000 н. 0000134615 00000 н. 0000134707 00000 н. 0000134907 00000 н. 0000135106 00000 п. 0000136079 00000 п. 0000136291 00000 н. 0000138242 00000 н. 0000138443 00000 н. 0000138843 00000 н. 0000140932 00000 н. 0000141139 00000 н. 0000141312 00000 н. 0000141525 00000 н. 0000142207 00000 н. 0000142409 00000 н. 0000142510 00000 н. 0000142732 00000 н. 0000142945 00000 н. 0000143010 00000 н. 0000143191 00000 п. 0000143392 00000 н. 0000143566 00000 н. 0000143775 00000 н. 0000143976 00000 н. 0000144277 00000 н. 0000144451 00000 н. 0000144509 00000 н. 0000144685 00000 н. 0000144858 00000 н. 0000144916 00000 н. 0000145091 00000 н. 0000145272 00000 н. 0000145513 00000 н. 0000145688 00000 п. 0000149843 00000 н. 0000150019 00000 н. 0000154482 00000 н. 0000154658 00000 н. 0000154832 00000 н. 0000155005 00000 н. 0000155179 00000 н. 0000155381 00000 п. 0000155583 00000 н. 0000155785 00000 н. 0000155987 00000 н. 0000156189 00000 н. 0000156397 00000 н. 0000156599 00000 н. 0000156811 00000 н. 0000156927 00000 н. 0000157150 00000 н. 0000157322 00000 н. 0000157567 00000 н. 0000157777 00000 н. 0000157966 00000 н. 0000158176 00000 н. 0000158355 00000 н. 0000158544 00000 н. 0000158723 00000 н. 0000158910 00000 н. 0000159219 00000 н. 0000159504 00000 н. 0000159676 00000 н. 0000159884 00000 н. 0000160064 00000 н. 0000160265 00000 н. 0000160444 00000 н. 0000160620 00000 н. 0000160799 00000 н. 0000161004 00000 н. 0000161205 00000 н. 0000161381 00000 н. 0000161557 00000 н. 0000161744 00000 н. 0000161960 00000 н. 0000165737 00000 н. 0000165915 00000 н. 0000166087 00000 н. 0000166318 00000 н. 0000166518 00000 н. 0000166716 00000 н. 0000166916 00000 н. 0000167117 00000 н. 0000167403 00000 н. 0000167769 00000 н. 0000167967 00000 н. 0000168262 00000 н. 0000168605 00000 н. 0000168663 00000 н. 0000168840 00000 н. 0000168902 00000 н. 0000169078 00000 н. 0000169250 00000 н. 0000169478 00000 н. 0000169946 00000 н. 0000170146 00000 п. 0000170345 00000 п. 0000170547 00000 н. 0000170749 00000 н. 0000170949 00000 н. 0000171149 00000 н. 0000171426 00000 н. 0000171638 00000 н. 0000172303 00000 н. 0000172484 00000 н. 0000172657 00000 н. 0000172833 00000 н. 0000172919 00000 н. 0000173118 00000 н. 0000173294 00000 н. 0000173494 00000 н. 0000173667 00000 н. 0000173843 00000 н. 0000174043 00000 н. 0000174242 00000 н. 0000174442 00000 н. 0000174654 00000 н. 0000174719 00000 н. 0000174901 00000 н. 0000175100 00000 н. 0000175363 00000 н. 0000175698 00000 н. 0000175898 00000 н. 0000176098 00000 н. 0000176334 00000 н. 0000176535 00000 н. 0000176744 00000 н. 0000176916 00000 н. 0000177127 00000 н. 0000177400 00000 н. 0000177495 00000 н. 0000177692 00000 н. 0000177865 00000 н. 0000178041 00000 н. 0000178242 00000 н. 0000178409 00000 н. 0000178623 00000 н. 0000178721 00000 н. 0000178918 00000 н. 0000179127 00000 н. 0000179456 00000 н. 0000179655 00000 н. 0000179835 00000 н. 0000180011 00000 н. 0000180192 00000 н. 0000180366 00000 н. 0000180542 00000 н. 0000180634 00000 н. 0000180837 00000 н. 0000180929 00000 н. 0000181126 00000 н. 0000181369 00000 н. 0000181683 00000 н. 0000181766 00000 н. 0000181964 00000 н. 0000182193 00000 н. 0000182423 00000 н. 0000182848 00000 н. 0000183067 00000 н. 0000183305 00000 н. 0000183524 00000 н. 0000183722 00000 н. 0000183941 00000 н. 0000184162 00000 н. 0000184359 00000 н. 0000184724 00000 н. 0000184942 00000 н. 0000185129 00000 н. 0000185312 00000 н. 0000185505 00000 н. 0000186010 00000 н. 0000186211 00000 н. 0000186409 00000 н. 0000186606 00000 н. 0000186822 00000 н. 0000188490 00000 н. 0000188688 00000 н. 0000188861 00000 н. 0000189102 00000 н. 0000189311 00000 н. 0000189493 00000 н. 0000189696 00000 н. 00001

00000 н. 00001 00000 н. 00001

00000 н. 00001

00000 н. 00001

00000 н. 00001

00000 н. 00001 00000 н. 0000191273 00000 н. 0000191482 00000 н. 0000191681 00000 н. 0000191860 00000 н. 0000192069 00000 н. 0000192268 00000 н. 0000192478 00000 н. 0000193164 00000 н. 0000193854 00000 н. 0000194735 00000 н. 0000194907 00000 н. 0000195107 00000 н. 0000195279 00000 н. 0000195475 00000 н. 0000195742 00000 н. 0000195918 00000 н. 0000196416 00000 н. 0000196746 00000 н. 0000196832 00000 н. 0000197034 00000 н. 0000197223 00000 н. 0000197408 00000 н. 0000197598 00000 н. 0000201631 00000 н. 0000201824 00000 н. 0000202062 00000 н. 0000205808 00000 н. 0000206097 00000 н. 0000206427 00000 н. 0000206633 00000 н. 0000207460 00000 н. 0000208052 00000 н. 0000208276 00000 н. 0000215531 00000 н. 0000215947 00000 н. 0000216396 00000 н. 0000221900 00000 н. 0000222128 00000 н. 0000223352 00000 н. 0000230764 00000 н. 0000230997 00000 н. 0000231177 00000 н. 0000231353 00000 н. 0000233075 00000 н. 0000233137 00000 п. 0000233318 00000 п. 0000233530 00000 н. 0000233622 00000 н. 0000233827 00000 н. 0000233904 00000 н. 0000234100 00000 н. 0000234318 00000 н. 0000234532 00000 н. 0000234714 00000 н. 0000234931 00000 н. 0000235243 00000 п. 0000235502 00000 н. 0000235702 00000 н. 0000235927 00000 н. 0000241572 00000 н. 0000241794 00000 н. 0000248619 00000 н. 0000248791 00000 н. 0000254733 00000 н. 0000254921 00000 н. Eȶ: B`Vq}; E; V ݙ KδkSq’7Qkf7sg {ss

Цикл ARL3 – UNC119 – RP2 GTPase нацелен на миристоилированный NPHP3 в первичную ресничку

Резюме

мембраны первичной цилии узкоспециализированный отсек, который организует белки для достижения пространственно упорядоченной передачи сигналов.Нарушение организации ресничек приводит к заболеваниям, называемым цилиопатиями, с фенотипами от дегенерации сетчатки и кистозных почек до дефектов нервной трубки. Как белки избирательно транспортируются и организуются в первичных ресничках, остается неясным. Используя протеомный подход, мы идентифицировали эффектор ARL3 UNC119 в качестве партнера по связыванию миристоилированного цилиопатического белка нефроцистина-3 (NPHP3). Мы картировали связывание UNC119 с N-концевыми 200 остатками NPHP3 и обнаружили, что для взаимодействия требуется миристоилирование.Создавая направленные мутанты, предсказанные на основе структурной модели UNC119-миристатного комплекса, мы определили высококонсервативные фенилаланины внутри гидрофобного β-сэндвича, которые необходимы для связывания миристата. Кроме того, мы обнаружили, что связывание ARL3-GTP служит для высвобождения миристоилированного груза из UNC119. Наконец, мы показали, что ARL3, UNC119b (но не UNC119a) и ARL3 GAP Retinitis Pigmentosa 2 (RP2) необходимы для нацеливания на реснички NPHP3 и что нацеливание требует активности связывания миристоила UNC119b.Наши результаты раскрывают избирательный, нацеленный на мембрану цикл GTPase, который доставляет миристоилированные белки к цилиарной мембране, и предполагают, что другие миристоилированные белки могут быть подобным образом нацелены на специализированные мембранные домены.

Ключевые слова: ARL3, NPHP, UNC119, миристоилирование

Цилиопатии редки, аутосомно-рецессивные расстройства с фенотипами, включая кистозные почки, дегенерацию сетчатки, дефекты нервной трубки, полидактилию и ожирение (для обзора см. Hildebrandt et al.2011). Почечная цилиопатия нефронофтиз (NPHP) и связанное с ней ретинально-почечное расстройство синдром Сеньора-Локена (SLS) вызываются мутацией любого из 13 известных в настоящее время генов болезни (Wolf and Hildebrandt 2011). Белки, кодируемые этими генами, локализуются в первичных ресничках на основе микротрубочек или в базальных тельцах / центросомах у основания ресничек, что приводит к гипотезе, что дефекты функции ресничек лежат в основе патологии NPHP / SLS.

Ген NPHP3 мутирует примерно в 1% случаев NPHP (Olbrich et al.2003 г.). Он кодирует белок с консервативным глицином в положении 2, который, как мы предполагаем, будет миристоилирован на N-конце, а также, как было показано, локализуется в отдельной области первичной реснички (Shiba et al. 2010). Мутация потери функции Nphp3 приводит к эмбриональной летальности, а гипоморфная мутация Nphp3 является причинной мутацией у мышей pcy , классической модели кистозной болезни почек (Olbrich et al. 2003). Исследования направленного белок-белкового взаимодействия показали, что NPHP3 ассоциируется с другими белками NPHP, особенно с NPHP1 (Olbrich et al.2003) и Inversin / NPHP2 (Бергманн и др., 2008). NPHP3, как полагают, играет роль как в канонической, так и в неканонической передаче сигналов Wnt, хотя молекулярные детали этих функций не поняты (Bergmann et al. 2008; Zhou et al. 2010).

Высококонсервативная малая GTPase Arf-like 3 (ARL3) была идентифицирована в нескольких скринингах для идентификации генов ресничек с использованием разных методов (Avidor-Reiss et al. 2004; Efimenko et al. 2005; Pazour et al. 2005). ARL3 локализуется в первичной ресничке (Zhou et al.2006), а у мышей с нокаутом обнаруживается поражение почек и сетчатки, поразительное сходство с синдромом Сеньора-Локена (Schrick et al. 2006). Хотя фактор обмена гуаниновых нуклеотидов (GEF) для ARL3 неизвестен, было показано, что белок, кодируемый геном пигментного ретинита Retinitis Pigmentosa 2 ( RP2 ), действует как ARL3-специфический белок, активирующий GTPase (GAP). (Велтель и др., 2008). Интересно, что RP2 локализуется в первичной ресничке (Hurd et al.2011) и участвует в транспортировке белков от Гольджи к цилиарной мембране (Evans et al. 2010). ARL3 имеет три известных GTP-специфических взаимодействующих белка (эффекторов): BART, PDE6D и UNC119 (Linari et al. 1999; Sharer and Kahn 1999; Van Valkenburgh et al. 2001). Интересно, что UNC119, первоначально идентифицированный у Caenorhabditis elegans как нескоординированный мутант, демонстрирующий широкие нейронные дефекты (Maduro and Pilgrim 1995), также был идентифицирован в нескольких скринингах ресничек, предполагая, что ARL3 и UNC119 могут функционировать вместе в некоторых аспектах биологии ресничек ( Avidor-Reiss et al.2004; Ли и др. 2004; Лю и др. 2007). UNC119 имеет обширную гомологию последовательностей с PDE6D, который связывается с пренилированными белками и помогает локализовать пренилированные белки в фоторецепторах (Zhang et al. 2004, 2007), и совсем недавнее исследование демонстрирует, что UNC119 обладает многими из тех же биохимических свойств, включая связывание и извлечение липидов. -модифицированные белки мембран (Zhang et al. 2011). Геномы позвоночных содержат два гена UNC119 , UNC119a и UNC119b , хотя функциональные различия между этими двумя генами не исследовались.Кодируемые белки имеют очень похожий PDE6D-подобный домен, тогда как N-концевые домены значительно разошлись. UNC119a Мутантные мыши обнаруживают дегенерацию сетчатки (Ishiba et al. 2007), а гетерозиготное усечение UNC119a было обнаружено у пациента с дистрофией колбочек-палочек (Kobayashi et al. 2000).

Считается, что N-концевое миристоилирование белков придает модифицированному белку обратимое мембранно-связывающее действие (Resh 1999). Как миристоилированные белки нацелены на соответствующие клеточные участки, остается неясным.Хотя было высказано предположение о существовании специфического миристоил-связывающего «рецептора», такой белок не был идентифицирован. Здесь мы сообщаем, что UNC119 является миристоил-связывающим белком, который связывается с субнабором миристоилированных белков, включая NPHP3 и цистин, и что малая GTPase ARL3 регулирует связывание миристоил-карго. Используя структурную модель UNC119-миристоил-пептидного комплекса для управления мутагенезом, мы идентифицировали ключевые остатки, важные для связывания миристата. Клеточные анализы локализации NPHP3 в ресничках показывают, что ARL3, UNC119b и его миристоил-связывающая активность (но не UNC119a), а также ARL3 GAP RP2 необходимы для правильного нацеливания NPHP3 в реснички.Мы также показали, что миристоил-связывающая активность UNC119 также необходима in vivo. Кроме того, мы идентифицировали C5orf30 как белок, связывающий UNC119, который предпочтительно связывает нелигандированный UNC119. Наконец, морфолино (MO) -опосредованные эксперименты по нокдауну у рыбок данио согласуются с ролью этого пути в функции ресничек. Основываясь на наших результатах, мы предполагаем, что ARL3-UNC119b-RP2 составляют цикл GTPase, который нацелен на специфический набор миристоилированных белков на цилиарную мембрану.

Результаты

UNC119 связывает N-конец цилиопатического белка NPHP3 миристоил-зависимым образом

Мы недавно создали сеть белок-белкового взаимодействия для спектра заболеваний NPHP-JBTS-MKS, которая включала тандемную аффинную очистку N- концевой меткой NPHP3 (Sang et al.2011). Анализ последовательности предсказывает, что NPHP3 является миристоилированным на N-конце, что может быть заблокировано нашим N-концевым слиянием. Мы стремились определить, будет ли по-другому локализоваться меченный на С-конце миристоилированный NPHP3. С этой целью мы создали стабильную линию пигментированных эпителиальных клеток сетчатки (RPE), экспрессирующую на С-конце LAP-меченный мышиный NPHP3. В отличие от нашей конструкции, меченной на N-конце (данные не показаны), меченный на C-конце NPHP3 был способен локализоваться в первичной ресничке (), что позволяет предположить, как это видно для других белков ресничек, включая цистин (Tao et al.2009), что миристоилирование способствует правильному нацеливанию на NPHP3. Несколько попыток создать немиристоилированную стабильную клеточную линию NPHP3 мутанта G2A, подходящую для тандемной аффинной очистки, оказались безуспешными, вероятно, из-за низкой стабильности мутантного белка. Интересная возможность состоит в том, что зависящее от миристоилирования нацеливание может быть важным для накопления NPHP3 в ресничках.

Белки UNC119 связывают N-концевой домен NPHP3 миристоил-зависимым образом. ( A ) Стабильно экспрессируемый GFP (LAP7) с C-концевой меткой полноразмерный мышиный NPHP3 в клетках RPE был лишен сыворотки, фиксирован и иммуноокрашен на перицентрин (PCNT) и ацетилированный тубулин (AcTub).Пруток, 3 мкм. ( B ) NPHP3-ассоциированные белки выделяли тандемной аффинной очисткой LAP-меченного NPHP3 из стабильной линии клеток RPE LAP7-NPHP3 и визуализировали на окрашенных серебром SDS-полиакриламидных гелях. Меченые белки идентифицировали масс-спектрометрией. ( C ) Полноразмерные (FL) и N-концевые фрагменты NPHP3, содержащие аминокислоты 1–100, 1–200 и 1–300 с C-концевой меткой Myc, транслировались in vitro; инкубировали с рекомбинантным очищенным GST-UNC119a; очищенный на гранулах глутатиона; разрешено SDS-PAGE; и визуализировали с помощью иммуноблоттинга на С-концевую метку.( D ) Транслированные in vitro дикого типа (wt) или немиристоилированные (G2A) NPHP3 1–200 инкубировали с белком GST-UNC119a и анализировали на связывание, как в C . ( E ) LAP7-NPHP3 1–200 трансфицировали в клетки RPE и обрабатывали для визуализации, как описано в A .

Чтобы идентифицировать факторы, которые нацелены на NPHP3 на реснички, мы использовали тандемную аффинную очистку нашего C-концевого меченого NPHP3. Очистка LAP-NPHP3 дала несколько сильно взаимодействующих белков ().Вырезание и тандемная масс-спектрометрия идентифицировали полосы 33 кДа и 31 кДа как UNC119a и UNC119b соответственно. Затем мы подтвердили взаимодействие NPHP3: UNC119 посредством GST pull-down с использованием бактериально экспрессированного GST-UNC119a и myc-tagged NPHP3 in vitro, транслируемого в экстракте зародышей пшеницы, системе, которая, как известно, является компетентной для миристоилирования (; Heuckeroth et al. 1988). Используя этот анализ, мы впоследствии локализовали UNC119-связывающий домен NPHP3 на N-концевых 200 остатках () и обнаружили, что при экспрессии в клетках RPE этого домена достаточно для локализации в ресничках ().Попытки определить локализацию мутанта G2A N-концевого фрагмента NPHP3 не увенчались успехом из-за плохой стабильности, что аналогично результатам, полученным с полноразмерной мутантной конструкцией. Затем мы спросили, требует ли взаимодействие миристоилирования. Примечательно, что мутация миристоилированного глицина в положении 2 NPHP3 в аланин отменяет связывание (). Эти данные свидетельствуют о том, что UNC119 функционирует как миристоил-связывающий белок.

UNC119 представляет собой миристоил-связывающий белок

Для дальнейшего изучения того, является ли UNC119 главным образом миристоил-связывающим белком, и для определения других функций UNC119, мы хотели очистить две изоформы UNC119 и идентифицировать их взаимодействующие белки.Чтобы идентифицировать эти белки, мы создали стабильные клеточные линии RPE, экспрессирующие LAP-tag UNC119a и UNC119b, а также линию клеток мышиного внутреннего мозгового собирающего протока (IMCD3), экспрессирующую LAP-tagged Unc119a (данные не показаны). Интересно, что LAP-UNC119a локализуется в центросоме, что определяется совместной локализацией с перицентрином (). Что еще более важно, LAP-UNC119b был обогащен в переходной зоне и простирался до проксимального конца реснички (). Окрашивание серебром тандемно очищенных аффинно очищенных комплексов UNC119a и UNC119b показывает перекрывающийся набор взаимодействующих, а также уникальные взаимодействия ().Поразительно, но одним из наиболее распространенных белков, присутствующих в каждом комплексе, является NPHP3, взаимно подтверждающий взаимодействия NPHP3-UNC119a / b. Для клеточной линии IMCD3 LAP-Unc119a был использован подход аффинной очистки-масс-спектрометрии с целью идентификации менее распространенных взаимодействующих белков. В дополнение к Nphp3, тандемно-очищенный комплекс Unc119a содержал сильное обогащение белков (всего 10), которые, как известно, или предположительно являются миристоилированными на N-конце (). К ним относятся известный цилиарный белок цистин, который мутирован в модели кистозной почки мыши cpk (Hou et al.2002). Цистин также нуждается в миристоилировании для правильной локализации цилиарной мембраны (Tao et al. 2009). Чтобы подтвердить взаимодействие с цистином в клетках, мы создали стабильную клеточную линию RPE, экспрессирующую первые 20 аминокислот цистина, меченных на его С-конце, что достаточно для нацеливания цистина на реснички (Supplemental Fig. S1). Тандемная аффинная очистка этого полипептида цистина дала практически стехиометрические количества UNC119a и UNC119b (). Чтобы подтвердить, что это было прямое взаимодействие in vitro и охарактеризовать взаимодействие, мы синтезировали биотинилированные пептиды с С-конца, соответствующие остаткам цистина 2-20 либо немиристоилированным (цистин), либо миристоилированным (Myr-цистин) на N-конце, чтобы проверить прямое взаимодействие. .Как показано на фиг.3, миристоилированный пептид цистина эффективно соосаждался in vitro транслированным UNC119a, тогда как немиристоилированный пептид не мог взаимодействовать с UNC119a. Затем мы спросили, может ли взаимодействие NPHP3: UNC119a конкурировать с добавлением пептида Myr-цистин. Добавление возрастающих количеств пептида Myr-цистин, но не немиристоилированного пептида, в реакцию GST-pull-down, содержащую GST-UNC119a и транслируемый in vitro NPHP3, нарушает взаимодействие NPHP3: UNC119 ().Эти данные убедительно подтверждают идею, что UNC119 может функционировать как высокоселективный грузовой адаптер для миристоилированных белков.

UNC119 представляет собой миристоил-связывающий белок. ( A ) Стабильные клетки RPE LAP6-UNC119a и LAP6-UNC119b подвергали голоданию по сыворотке, фиксировали и иммуноокрашивали на перицентрин (PCNT) и ацетилированный тубулин (AcTub). Стрелка указывает на базальное тело, а острие стрелки указывает на ресничку. Пруток, 3 мкм. ( B ) UNC119a и UNC119b с меткой LAP были очищены аффинно тандемно из стабильных клеточных линий, используемых в A .Элюаты разделяли с помощью SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием серебром. Меченые белки идентифицировали масс-спектрометрией. ( C ) Таблица, показывающая семь основных белков, предположительно миристоилированных, которые были идентифицированы тандемной аффинной очисткой и масс-спектрометрией стабильной линии IMCD3 LAP-Unc119a, и их процентное покрытие. ( D ) LAP-меченные цистиновые аминокислоты 1–20 были очищены тандемной аффинностью из клеток RPE, стабильно экспрессирующих LAP5-цистин 1–20. Элюат разделяли с помощью SDS-PAGE и визуализировали окрашиванием серебром.UNC119a и UNC119b были идентифицированы масс-спектрометрией. ( E ) Myc-меченные in vitro транслированные BBS1 или UNC119a инкубировали с биотинилированным пептидом на С-конце, соответствующим остаткам цистина 2-20, либо немиристоилированным (цистин), либо миристоилированным на его N-конце (Myr-цистин). Комплексы осаждали гранулами стрептавидина, разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали иммуноблоттингом с антителом myc. BBS1 был включен в качестве отрицательного контроля. ( F ) Реакции связывания GST-UNC119a выполняли с меченным на С-конце Myc полноразмерным NPHP3, как описано выше, за исключением того, что цистин или пептид Myr-цистин были включены в 0.1, 1, 5 или 10 мкМ. ДМСО добавляли в качестве контроля. ( G , верхняя панель ) Реакции связывания GST-UNC119a выполняли так же, как с N-концом Myc, меченным in vitro транслированным C5orf30. ( Нижняя панель ) Пептидный конкурентный анализ с GST-UNC119a и переведенным in vitro C5orf30 проводили, как на правой панели .

C5orf30 представляет собой UNC119-связывающий белок, который предпочтительно связывает нелигандированный UNC119

В дополнение к множественным миристоилированным белкам, которые совместно очищаются с UNC119, мы обнаружили неохарактеризованный белок, названный C5orf30, который не имеет глицина в положении 2 и, как предполагается, не является миристоилированным ( ).В отличие от генов ARL3 и UNC119 , C5orf30 , по-видимому, обнаруживается только в геномах позвоночных. Когда GFP-tagged, C5orf30 локализуется в переходной зоне и проксимальной ресничке в дополнение к обнаружению по всей цитоплазме (Supplemental Fig. S2A), что согласуется с возможной ролью в управлении движением ресничек. Гибридизация in situ срезов сетчатки мыши показывает, что C5orf30 высоко экспрессируется в фоторецепторах (Supplemental Fig. S2B), предполагая роль C5orf30 в транспортировке белков в фоторецепторы.Мы подтвердили, что C5orf30 является прямым связывающим UNC119 белком, с помощью анализа GST pull-down с in vitro транслированными C5orf30 и GST-UNC119a (). Мы рассмотрели несколько моделей того, как C5orf30 может регулировать связывание UNC119 с миристоилированными белками. Сначала мы определили, нарушается ли связывание C5orf30 с UNC119 пептидом Myr-цистин. Действительно, взаимодействие UNC119a: C5orf30 было нарушено добавлением пептида Myr-цистин, но не немиристоилированного пептида (). Мы хотели рассмотреть вопрос о том, может ли C5orf30 реципрокно блокировать связывание миристоилированного белка.Нам еще предстоит произвести форму белка C5orf30, которая позволила бы провести простой конкурентный анализ. Однако мы сравнили относительную эффективность связывания между C5orf30, UNC119 и NPHP3 в наших очистках LAP каждого белка (,; данные не показаны). В соответствии с нашими прогнозами, NPHP3 эффективно связывался с UNC119, но мы не обнаружили C5orf30 путем окрашивания серебром. В свою очередь, очищенный C5orf30 связывает UNC119, но мы не смогли обнаружить NPHP3. UNC119, очищенный LAP, связывается как с C5orf30, так и с NPHP3 (), которые, как мы полагаем, представляют собой смешанную популяцию комплексов C5orf30 – UNC119 и NPHP3 – UNC119.Эти данные предполагают, что C5orf30 связывается преимущественно с UNC119 без лиганда. Интересная возможность заключается в том, что C5orf30 может действовать как фактор рециклинга, помогая извлекать UNC119 из мембраны после высвобождения миристоилированного груза.

Остатки фенилаланина, выстилающие гидрофобную β-двустворчатую оболочку UNC119, опосредуют связывание миристата

Кристаллическая структура UNC119a была решена Северо-восточным консорциумом структурной геномики (Protein Data Bank [PDB] 3GQQ), выявив гидрофобную β-сэндвич-складку, аналогичную другим слоям липидов. -связывающие белки, такие как PDE6D и RhoGDI.Длина гидрофобного ядра составляет ~ 20 Å, что образует туннель, который легко вмещает 14-углеродный миристатный фрагмент. Наиболее поразительными являются 11 высококонсервативных остатков фенилаланина, выстилающих гидрофобный β-сэндвич (). Мы использовали структурное моделирование, чтобы поместить миристат в гидрофобное ядро ​​(), основываясь на позиционировании с туннельным доменом, ограниченным этими фенилаланинами. Наша модель удивительно похожа и полностью согласуется с недавно опубликованной сокристаллической структурой UNC119a и лауроилированного пептида (Zhang et al.2011). Основываясь на нашей модели, мы предположили, что остатки фенилаланина, выстилающие гидрофобный «туннель», будут важны для связывания миристата, и что эти фенилаланины объединяются в четыре сайта гидрофобного связывания. Чтобы проверить нашу гипотезу, мы создали четыре мутантных конструкции UNC119b, заменив от двух до четырех фенилаланинов на аланины в каждом из сайтов. Эти конструкции транслировали in vitro и тестировали на миристоил-связывающую активность с использованием биотинилированного пептида Myr-цистин. Как показано на фиг.4, все четыре мутанта продемонстрировали пониженное связывание с пептидом Myr-цистин, причем мутант Mut-4 (F144A, F148A и F207A) имел наибольший эффект.Важно отметить, что каждый из мутантов фенилаланина был способен связываться с ARL3 QL так же эффективно, как UNC119b дикого типа, подтверждая, что общая архитектура UNC119b не нарушается нашим мутагенезом (). Затем мы по отдельности мутировали каждый из фенилаланинов в сайте Mut-4. Мы обнаружили, что хотя F144 мало способствует связыванию Myr-цистина, F148 и F207 имеют решающее значение для связывания с пептидом Myr-cystin (), подтверждая нашу структурную модель.

Мутации в высококонсервативной фенильной бороздке UNC119 нарушают связывание миристоил-пептид.( A ) Выравнивание последовательностей UNC119b человека и гомолога POC7 Chlamydomonas . Остатки фенилаланина, мутировавшие в C , обозначены и закодированы цветом. ( B ) Структурная модель UNC119a и трех миристоилированных N-концевых трех аминокислот цистина на основе кристаллической структуры UNC119a 3GQQ. Четыре группы консервативных фенилаланинов, мутагенизированных в C , показаны и обозначены цветом. Номера остатков соответствуют последовательности UNC119b. Части структуры были удалены, чтобы можно было визуализировать миристоил-связывающий карман.( C , top иммуноблоттинг) Анализы связывания биотинилированного Myr-цистина выполняли как и только с использованием in vitro транслированного дикого типа (wt) или мутантного Myc-tagged UNC119b. Нижний иммуноблот показывает результаты реакции связывания между GST-ARL3 QL и in vitro транслированным Myc-tagged UNC119b. ( D ) Анализы связывания биотинилированного Myr-цистина выполняли как и только с использованием транслированного in vitro дикого типа (wt) или мутантного Myc-tagged UNC119b.

Цилиарная малая GTPase ARL3 связывает UNC119 и мембраны GTP-специфическим образом в клетках RPE

UNC119 является известным GTP-специфическим эффектором ARL2 и ARL3 (Van Valkenburgh et al.2001). Мы сфокусировали наше внимание на ARL3, потому что он локализуется в первичных ресничках в клетках RPE (Zhou et al. 2006), тогда как ARL2 нет (данные не показаны). Авторы изобретения создали стабильные клеточные линии RPE, экспрессирующие LAP-меченный GDP-мимикрирующий ARL3 TN и GTP-мутантные белки ARL3 QL. В отличие от других малых GTPаз ресничек, таких как Rab8, мутантные формы ARL3, имитирующие GDP и GTP, локализованные в первичной ресничке (дополнительный рисунок S3), предполагают, что цикл ARL3 GTPase может функционировать для высвобождения белков внутри реснички. , а не регулирует вход ресничек.Тандемная аффинная очистка LAP-ARL3 TN не дала сильных взаимодействующих белков, в то время как LAP-ARL3 QL совместно очищался с шестью дополнительными белковыми полосами (). Для идентификации каждого из белков использовали масс-спектрометрию. Мы обнаружили все известные эффекторы ARL3 (BART, PDE6D и UNC119), а также два новых эффектора с неизвестной функцией (CCDC104 и C20orf194), а также ARL3 GAP RP2 (). Эффекторы ARL3 анализировали с помощью GST-pull-down с использованием либо GST-ARL3 TN, либо GST-ARL3 QL вместе с транслированным эффектором in vitro (), и, действительно, каждый из этих эффекторов-кандидатов связывается GTP-зависимым образом.Эти новые эффекторы не будут обсуждаться далее и будут охарактеризованы в будущих работах.

Связывание ARL3, но не связывание ARL2, высвобождает миристоилированный груз из UNC119. ( A ) Гель, окрашенный серебром, демонстрирующий элюаты от тандемной аффинной очистки LAP-меченных ARL3 TN и ARL3 QL. Указанные белки идентифицировали масс-спектрометрией. ( B ) Реакции связывания проводили с использованием GST-ARL3 TN или GST-ARL3 QL вместе с транслированными in vitro белками, меченными Myc, указанными на левой стороне панели.Взаимодействующие белки, меченные Myc, выявляли иммуноблоттингом с антителом myc. ( C ) Стабильные клеточные линии RPE, экспрессирующие LAP-ARL3 TN или LAP-ARL3 QL, фракционировали на растворимую (S100) и нерастворимую (P100) мембранные фракции. Эти фракции разделяли с помощью SDS-PAGE и подвергали иммуноблоттингу на GFP-метку. ( D ) Анализы конкуренции пептидов выполняли, как и в случае с транслированным in vitro белком ARL3 QL-myc и 5 мкМ пептидом Myr-цистин. ( E ) Преформированные комплексы биотинилированного Myr-цистина и транслируемого in vitro Myc-tag UNC119a или UNC119b, захваченного на стрептавидин-сефарозных гранулах, инкубировали с возрастающими количествами либо GST-ARL2 TN, GST-ARL2 QL, GST-ARL3 TN. , или GST-ARL3 QL.Комплексы промывали и анализировали иммуноблоттингом с антителом myc.

Семейство ARF и ARF-подобные GTPases, как известно, связывают мембраны GTP-специфически (Gillingham and Munro 2007; Jin et al. 2010). Мы проверили, способен ли ARL3 аналогичным образом связываться с мембранами, фракционируя LAP-ARL3 TN и LAP-ARL3 QL стабильные клеточные линии RPE на растворимые (S100) и нерастворимые (P100) мембранные фракции и иммуноблоттинг для LAP-ARL3. Как показано на фигуре, ARL3 QL осаждается в мембранной фракции, в то время как ARL3 TN не осаждается, что указывает на то, что ARL3 действительно связывает мембраны GTP-специфично.

ARL3 QL высвобождает миристоилированные пептиды из UNC119

Далее мы рассмотрели, будет ли взаимодействие ARL3 регулировать взаимодействия UNC119 с миристоилированными белками. Во-первых, мы проверили, может ли N-концевой пептид цистина нарушить известное взаимодействие между UNC119 и GTP-связанной небольшой GTPase ARL3. Как показано, добавление цистинового пептида в реакцию связывания, содержащую GST-UNC119a и транслированный in vitro ARL3 QL, не имело эффекта. Этот результат подтверждает специфичность конкурентного связывания, наблюдаемого между NPHP3 и миристоилированным пептидом цистина.Более того, как и многие белки семейства ARF / ARL, ARL3 содержит глицин в положении 2 и, как предполагается, сам будет миристоилированным. Миристоилирование этих факторов может помочь направить ARF / ARL GTPase к мембране. Здесь, по-видимому, ARL3 связывает UNC119 только через свою эффекторную функцию GTP, а не через сигнал миристоилирования.

Затем мы проверили, будет ли ARL3 QL высвобождать миристоилированный груз из UNC119. Мы предварительно сформировали комплексы транслированных in vitro UNC119a или UNC119b и биотинилированного пептида Myr-цистин на гранулах стрептавидин-сефарозы, а затем добавили рекомбинантный GST-ARL3.Примечательно, что добавление возрастающих количеств GST-ARL3 QL, но не добавление GST-ARL3 TN, приводит к дозозависимому высвобождению UNC119 из иммобилизованного пептида Myr-цистин (). Интересно, что мы обнаружили, что, несмотря на связывание с UNC119 аналогично ARL3 QL, ARL2 QL не смог высвободить UNC119 из пептида Myr-цистин (). Эти данные предполагают, что ARL3 QL способствует высвобождению миристоилированного груза из UNC119 в соответствующий мембранный домен. Учитывая, что PDE6D имеет сходство последовательностей с UNC119, а также связывается с ARL2 / ARL3 и липид-модифицированными белками, вполне вероятно, что ARL2 или ARL3 будут аналогичным образом регулировать связывание груза PDE6D.

Путь ARL3 необходим для локализации NPHP3 в ресничках

Установив биохимическую взаимосвязь между ARL3, UNC119 и миристоилированными цилиарными белками (NPHP3 и цистин), мы попытались протестировать модель, согласно которой ARL3 / UNC119 ответственны за нацеливание на миристоилированные цилиарные белки. к первичной ресничке. Чтобы проверить эту идею, мы создали стабильную клеточную линию RPE, экспрессирующую LAP-tagged NPHP3 1–200. Мы выбрали этот N-концевой фрагмент NPHP3 по всей длине, потому что он демонстрирует заметно более эффективную и последовательную локализацию в ресничках, что делает этот вариант более подходящим для анализа нацеливания на реснички.Мы трансфицировали эти клетки либо контрольной скремблированной миРНК, либо миРНК, нацеленной на ARL2, ARL3, UNC119a, UNC119b или RP2 (). Мы использовали две разные миРНК для ARL3, UNC119a, UNC119b и RP2, чтобы минимизировать вероятность нецелевых эффектов. Все миРНК истощили эндогенные транскрипты до <15% от контрольных уровней (дополнительный рисунок S4). Как и ожидалось, истощение ARL2 не имело никакого эффекта. Поразительно, но нокдаун ARL3, UNC119b и RP2 драматически снижает процент ресничек с локализованными NPHP3 1–200.Мы наблюдали очень низкие количества нашего белка LAP-NPHP3 1–200 в нокдаун-ресничках при визуализации при более длительном воздействии (<10-кратные уровни дикого типа), что, вероятно, отражает комбинацию уровня сверхэкспрессии нашей репортерной конструкции и, возможно, неполного нокдауна. целевого белка. Интересно, что истощение UNC119a не имело эффекта, даже если он способен связывать NPHP3. Мы подозреваем, что это происходит из-за разницы в локализации между UNC119a и UNC119b в клетках RPE, но можем сообщить более широко о функциональных различиях между UNC119a и UNC119b (см. Обсуждение).Истощение ARL3 и UNC119b в стабильной клеточной линии, экспрессирующей GFP-меченный цистин 1–20, дало аналогичные результаты (данные не показаны). Кроме того, нокдаун ARL3, UNC119a, UNC119b или RP2 не показал никакого эффекта на транспортировку рецепторов, связанных с G-белком ресничек (дополнительный рис. S5), что указывает на то, что доставка немиристоилированных белков к ресничкам не нарушается истощением ARL3. компоненты пути.

ARL3, UNC119b и RP2 необходимы для локализации NPHP3 в ресничках. ( A ) Клетки RPE, стабильно экспрессирующие LAP7-NPHP3 1–200, трансфицированные siRNA против указанных генов и иммуноокрашенные антителами к перицентрину (PCNT) и ацетилированному тубулину (AcTub).Пруток, 3 мкм. ( B ) Количественная оценка процента ресничек, содержащих LAP7-NPHP3 1–200, после трансфекции указанными миРНК. Эксперименты проводились в двух экземплярах и представлены как среднее плюс стандартное отклонение. ( C ) Клетки RPE, стабильно экспрессирующие LAP7-NPHP3 1–200, трансфицировали tdTomato-tag-tag-wild-type или Mut-4 UNC119b, затем трансфицировали миРНК, нацеленными на 3′-UTR UNC119b. Затем клетки иммуноокрашивали на перицентрин и ацетилированный тубулин и визуализировали.Стрелка указывает на базальное тело, а острие стрелки указывает на ресничку. Пруток, 3 мкм. ( D ) Количественная оценка процента ресничек, содержащих LAP7-NPHP3 1–200, после трансфекции указанными плазмидами и миРНК. Эксперименты проводились в двух экземплярах и представлены как среднее плюс стандартное отклонение.

Миристоил-связывающая активность UNC119b необходима для локализации NPHP3 в первичной ресничке

Установив, что N-концевой фрагмент NPHP3 требует UNC119b для правильной локализации в ресничках, мы задались вопросом, потребует ли эта локализация миристоил-связывающей активности UNC119b.Чтобы проверить эту гипотезу, мы провели серию экспериментов по siRNA / спасению в нашей стабильной клеточной линии LAP-NPHP3 1–200 с использованием tdTomato-tagged UNC119b конструкций и siRNA, нацеленных на 3 ‘нетранслируемую область UNC119b (UTR) (). Как и ожидалось, конструкция tdTomato-UNC119b дикого типа была способна полностью восстановить локализацию NPHP3 в ресничке в клетках, истощенных по UNC119b. Поразительно, что миристоил-связывающий мутант tdTomato-UNC119b Mut-4 неспособен к спасению в той же степени, это указывает на то, что нацеливание на реснички NPHP3 действительно требует миристоил-связывающей активности UNC119b.Интересно, что миристоил-связывающий мутант UNC119b был обнаружен только в базальном теле / ​​переходной зоне (открытая стрелка), тогда как версия дикого типа присутствовала в проксимальных ресничках (закрытая стрелка), а также в базальном теле / ​​переходной зоне. . Интересная возможность состоит в том, что при отсутствии своего миристоилированного белкового груза UNC119b может перемещаться только в базальное тело, и что связывание груза может запускать проникновение в реснички UNC119b.

Миристоил-связывающая активность UNC119b требуется в

C.elegans

Unc-119 мутантные черви обнаруживают дефекты локомоции (Maduro and Pilgrim 1995), а сенсорные нейроны у этих мутантов неспособны заполняться липофильным красителем (см. ниже). Мы спросили, сможет ли UNC119b человека с мутациями в сайте связывания миристоила (Mut-4) спасти фенотипов C. elegans unc-119 . Человеческий UNC119b дикого типа, но не Mut-4, был способен устранить дефекты заполнения красителем как локомоторных, так и головных сенсорных нейронов у животных с мутантами unc-119 , в то время как Mut-4, по-видимому, имел доминантно-отрицательную активность в красителе. -заполнение сенсорных нейронов в хвосте ().Эти данные предполагают, что белки семейства UNC119 требуют миристоил-связывающей активности in vivo.

Миристоил-связывающая активность необходима для спасения мутантов C. elegans unc-119 (ed) , а нокдаун nphp3 , unc119a и c5orf30 у рыбок данио приводит к фенотипам, связанным с ресничками. ( A ) Локомоторная активность червей дикого типа, мутанта unc-119 (ed3) и мутанта unc-119 (ed3) , спасенных с помощью UNC119b дикого типа или Mut-4 человека.Звездочка (*) и решетка (#) обозначают значения, которые значительно отличаются (при P <0,05) от значений дикого типа и unc-119 (ed3) соответственно. ( B ) Способность сенсорных нейронов головы и хвоста животных указанных генотипов заполняться красителем DiI была проанализирована и нанесена на график. Звездочка (*) и решетка (#) обозначают значения, которые значительно отличаются (при P <0,05) от значений дикого типа и unc-119 (ed3) соответственно.(C) Типичные изображения MO-инъецированных эмбрионов рыбок данио через 48 часов после оплодотворения (hpf). ( D ) Типичные изображения рыбок данио, которым вводили низкие дозы MO, через 5 дней после оплодотворения (dpf), использованные в анализе зрения. Обратите внимание, что было необходимо меньшее количество MO, поскольку эмбрионы с изогнутым телом не могут использоваться в анализе зрения. ( E ) Таблица с результатами анализа KV и анализа зрения. (*) P <0,01; (**) P <0,05, точный критерий Фишера.

Функция ресничек у рыбок данио требует

nphp3 , unc119a и c5orf30

Рыбки данио стали полезной моделью организма, используемой для изучения основной функции ресничек. Опосредованный MO нокдаун генов, участвующих в функции ресничек, обычно приводит к искривлению тела, дефектам размера реснитчатой ​​эмбриональной структуры, известной как пузырь Купфера (KV), и снижению зрительной функции (Yen et al. 2006; Pretorius et al. 2010 ; Baye et al.2011). Эмбрионы рыбок данио, которым инъецировали на стадии от одной до четырех клеток ген-специфичные МО, оценивали на общую морфологию, размер KV и зрительную функцию.Предыдущая работа отметила роль в ресничках nphp3 и unc119a (наиболее сходна с человеческим UNC119b ) (Manning et al. 2004; Zhou et al. 2010). Мы обнаружили, что нокдаун рыбок данио nphp3 , unc119a и c5orf30 каждый приводит к дозозависимой изогнутой оси тела и дефектам KV (). Более того, мы обнаружили, что нокдаун nphp3 и unc119a приводит к снижению зрительной функции (). В соответствии с результатами нашего клеточного анализа нацеливания на NPHP3 и различиями в локализации, наблюдаемыми между человеческими UNC119a и UNC119b, нокдаун рыбок данио unc119b (наиболее похожих на человеческий UNC119a ) дал только легкий дефект KV, но никаких других очевидных ресничек. родственные фенотипы.Наконец, у рыбок данио мы идентифицировали три гена с высокой гомологией с ARL3 : arl3 (95%), синтенический ген с человеческим ARL3 и два arl3-подобных фактора, arl3l1 (75%) и arl3l2 (77%), которые не встречаются у людей или мышей. Нокдаун синтенического arl3 с использованием двух независимых MOs не приводит к очевидным дефектам, связанным с ресничками, указывая тем самым на возможную субфункционализацию членов семейства arl3 внутри рыбок данио (данные не показаны).Взятые вместе, эти данные демонстрируют, что nphp3 , unc119a и c5orf30 играют сильную роль в функции ресничек у рыбок данио.

Обсуждение

Мы описываем здесь данные, показывающие, что высококонсервативные белки UNC119 распознают миристоилированный N-конец подмножества белков, включая цилиопатический белок NPHP3 и цистин. Мутагенез, основанный на нашей структурной модели комплекса UNC119-миристат, позволил нам идентифицировать четыре группы консервативных остатков фенилаланина, которые важны для связывания миристоил-пептид, причем два ключевых фенилаланина имеют решающее значение для связывания.Затем мы обратили внимание на маленькую цилиарную GTPase ARL3. Используя протеомный подход, мы идентифицировали исчерпывающий список GTP-специфических эффекторных белков, включая известные эффекторы ARL3 BART, PDE6D и UNC119, а также два белка с неизвестной функцией (CCDC104 и C20orf194). Путем фракционирования наших клеточных линий, экспрессирующих формы ARL3, имитирующие GDP и GTP, мы обнаружили, что, подобно другим членам семейства ARF и ARF, ARL3 специфически связывается с мембранами GTP. Затем мы обнаружили, что связывание ARL3, но не связывание ARL2, высвобождает миристоилированный пептид из UNC119.На основании экспериментов по нокдауну с использованием нашего клеточного анализа, контролирующего локализацию в ресничках миристоилированного N-концевого UNC119-связывающего фрагмента NPHP3, мы предполагаем, что путь ARL3 GTPase (ARL3-GTP, UNC119b и GAP RP2) необходим для нацеливания на миристоилированную цилиарную систему. белки цилиарной мембраны.

Модель переноса миристоилированных цилиарных белков

На основании представленных данных мы предлагаем модель (), в которой UNC119b сначала связывает субнабор миристоилированных грузовых белков в цитоплазме.Поскольку миристоилирование происходит котрансляционно (Wilcox et al. 1987), это связывание может происходить вскоре после инициации трансляции, чтобы предотвратить ошибочно направленные взаимодействия миристат-мембрана (см. Ниже). UNC119b-миристоилированный грузовой комплекс затем будет нацелен на реснички с помощью неизвестного в настоящее время механизма. Также работая на ранней стадии процесса, цилиарная малая GTPase ARL3 д. Быть активирована с помощью неизвестного в настоящее время GEF. Эта активация потенциально может происходить внутри ресничек, потому что как GTP-, так и GDP-заблокированные формы являются ресничными, хотя сайт этой активности не совсем ясен.Попадая в ресничку, связанный с мембраной ARL3-GTP связывается с UNC119b, высвобождая миристоилированный груз в ресничную / цилиарную мембрану. ARL3 GAP RP2, который, как известно, находится внутри цилиарной мембраны (Hurd et al. 2011), активирует активность ARL3 GTPase, тем самым высвобождая UNC119b (Veltel et al. 2008). Интересно, что мы получили несколько пептидов, идентифицирующих RP2 как присутствующие в нашей очистке NPHP3 (данные не показаны). Возникает соблазн предположить, что сам груз может придавать специфичность осаждению на мембране-мишени за счет содержания последовательностей, связывающих GAP.Основываясь на наших экспериментах по конкурентному связыванию с C5orf30 и пептидом Myr-cystin, мы предполагаем, что C5orf30 связывается преимущественно с нелигандированным UNC119. На основании этой активности и наших наблюдений, что C5orf30 может находиться в первичной ресничке (Supplemental Fig. S3A), C5orf30 может способствовать либо высвобождению груза, либо рециркуляции UNC119b.

Модель ARL3 – UNC119b – RP2-зависимого нацеливания на реснички NPHP3 / цистина. UNC119b и его цилиарный миристоилированный груз сначала доставляются к ресничкам с помощью неизвестного в настоящее время механизма.В ресничке ARL3 активируется неизвестным GEF. Связанный с мембраной ARL3-GTP затем связывается с UNC119b / миристоилированным грузовым комплексом и высвобождает груз в реснички. Затем ресничный GAP RP2 активирует активность ARL3 GTPase, которая высвобождает UNC119b из ARL3. Затем UNC119b покидает ресничку для следующего раунда незаконного оборота.

Когда мы готовили нашу статью, Zhang et al. (2011) опубликовали исследование, в котором сообщалось, что UNC119 связывает миристоилированный Gα-белок трансдуцин, и биохимически показали, что UNC119 облегчает его извлечение из мембран наружных сегментов палочек.В то время как мы рассматривали возможный GDI-подобный механизм «экстракции» для UNC119, наши результаты, показывающие, что NPHP3 не может локализоваться в первичных ресничках, когда UNC119b истощается, а не накапливается в цилиарной мембране, предполагают функцию нацеливания на мембрану. Будет интересно определить, какие факторы диктуют роль UNC119 в мембранной экстракции по сравнению с доставкой.

UNC119a по сравнению с UNC119b

Белки UNC119a и UNC119b имеют очень похожий PDE6D-подобный домен, составляющий более трех четвертей каждого белка, который, как мы показали, связывается с миристатным фрагментом субнабора миристоилированных белков на N-конце.Несмотря на эту высокую степень сходства, мы обнаружили, что UNC119b, но не UNC119a, необходим для правильной локализации NPHP3 в ресничках. Напротив, N-концевые ∼50 остатков двух ортологов значительно разошлись. Интересно, что мы обнаружили, что при экспрессии в клетках RPE, UNC119a локализуется в центросоме, тогда как UNC119b локализуется в переходной зоне и проксимальной ресничке. Последовательность, нацеленная на реснички, таким образом, может находиться внутри дивергентного N-конца UNC119b, хотя эксперименты для проверки этой гипотезы будут необходимы.Мы также отметили различия в полосах наших окрашенных серебром гелей при сравнении очищенных комплексов UNC119a и UNC119b. Дивергентные N-концевые домены могут дополнительно вносить вклад в избирательность связывания миристоил-пептид, что объясняет различия, наблюдаемые между двумя очищенными комплексами. Кроме того, у рыбок данио нокдаун unc119a приводит к трем фенотипам, связанным с ресничками (искривленное тело, дефект KV и нарушение зрения), в то время как истощение unc119b демонстрирует только легкий дефект KV, поддерживая различные роли для unc119a и unc119b in vivo.Дополнительные исследования, касающиеся партнеров по связыванию, специфичности и нокаутного фенотипа мыши UNC119b , могут стать важными последующими исследованиями.

Специфичность UNC119 и функциональные ортологи

Предполагается, что примерно 0,5% генома человека будет миристоилированным (Maurer-Stroh et al. 2004) и> 50 белков в протеоме жгутиков и базальных тел (FABB), список кандидатов ресничные белки (Li et al. 2004) обладают глицинами в положении 2 (наше наблюдение). Подмножество этих миристоилированных белков содержит цистеин в положении 3, который, как предполагается, также будет пальмитоилирован, включая RP2.Основываясь на нашей структурной модели, β-сэндвич-складка вряд ли вмещает вторую длинную гидрофобную липидную цепь и, таким образом, дважды ацилированные белки вряд ли будут кандидатами на путь нацеливания на ARL3-UNC119. Примечательно, что все предсказанные миристоилированные белки, идентифицированные в наших очистках UNC119, не содержали цистеина в положении 3. Наши очистки UNC119a и UNC119b предполагают, что они распознают только подмножество общей популяции миристоилированных белков, хотя будущие очистки из разных типов клеток или тканей могут расширить текущий репертуар.Интересно рассмотреть, существуют ли функциональные эквиваленты UNC119 для других миристоилированных белков.

UNC119 как шаперон

Помимо действия в качестве фактора нацеливания на реснички для субнабора миристоилированных белков, UNC119 может также действовать как шаперон, закапывая миристат до тех пор, пока груз не достигнет соответствующей мембраны-мишени. Интересно, что другие миристоилированные белки, такие как HIV gag и c-abl, способны скрывать свои миристатные фрагменты внутри внутреннего белкового домена (Hantschel et al.2003; Tang et al. 2004 г.). В механизме «переключения миристата» миристат ВИЧ-гена обнажается только тогда, когда белок достигает своего места назначения на апикальной мембране (Tang et al. 2004). Возможно, белки, неспособные похоронить свой миристат, потребуют UNC119 или UNC119-подобных белков для правильной локализации в мембране. Здесь, особенно когда эти белки консервативны до Chlamydomonas , функция независимого миристат-связывающего белка, по-видимому, является древним устройством для нацеливания на мембрану.

Сильная эволюционная консервация пути ARL3

Гены ARL3 и UNC119 сохраняются от человека до зеленых водорослей Chlamydomonas (называемых ARL3 и POC7 соответственно). Геном Chlamydomonas также содержит по крайней мере два RP2-подобных белка (Stephan et al. 2007). Хотя цилиарные грузы, идентифицированные здесь (NPHP3 и цистин), явно не консервативны, миристоилированные белки, по-видимому, обогащены биохимической очисткой жгутиковых белков Chlamydomonas (Pazour et al.2005). Эта замечательная степень консервативности предполагает древнее происхождение описанного здесь механизма нацеливания на мембраны, основанного на миристоилировании.

Новые кандидаты в гены почечной дегенерации и дегенерации сетчатки (NPHP / SLS)

NPHP и SLS — это аутосомно-рецессивные генетические заболевания, характеризующиеся кистозными и кистозными почками плюс дегенерация сетчатки соответственно. В настоящее время известно 13 генов, вызывающих NPHP или SLS при мутации, причем мутации некоторых из этих генов приводят к обоим заболеваниям.Эти известные аллели болезней составляют лишь ~ 30% диагностированных случаев NPHP, что позволяет предположить, что еще предстоит идентифицировать еще много генов болезней. Основываясь на данных, представленных здесь, мы предполагаем, что UNC119b и C5orf30 являются сильными кандидатами для генов болезни NPHP или SLS. Кроме того, кандидатами могут быть пациенты с пигментным ретинитом или врожденным амаврозом сетчатки глаза у детей, имеющим поражения этих генов. Будущие исследования будут необходимы, чтобы подтвердить, что эти два гена являются настоящими генами цилиопатии.

Материалы и методы

Плазмиды

Входные клоны для ARL3, BART, BBS1, CCDC104, PDE6D и UNC119a человека были получены от Invitrogen. C5orf30, цистин 1–20, C20orf194 и UNC119b были синтезированы с помощью ДНК 2.0. NPHP3 с LAP-меткой на С-конце получали путем удаления стоп-кодона из ранее описанного вектора NPHP3 мыши. Усечения NPHP3 производили с помощью ПЦР с использованием мышиного NPHP3 в качестве матрицы. Конструкции G2A NPHP3 были получены с помощью мутагенеза на основе ПЦР.ARL3 TN и ARL3 QL получали с помощью основанного на ПЦР мутагенеза Т31 на N и Q71 на L, соответственно. Мутагенез UNC119b был выполнен GeneWiz. Клоны входа Multisite Gateway были созданы для UNC119b и UNC119b Mut-4 с использованием вектора pDONR221-5,2, и были созданы для tdTomato с использованием вектора pDONR221-1,5r; LR plus использовали для помещения конструкций tdTomato и UNC119b в pDEST47 в соответствии с рекомендациями производителя (Invitrogen). Вышеупомянутые входные клоны были помещены в один или несколько следующих векторов-приемников посредством LR-рекомбинации: pG-LAP5, pG-LAP6, pG-LAP7, pCS2-DEST + 6xMyc, pCS2-DEST + C-term 3xMyc и pGEX6p1-DEST. .Вектор pCS2-DEST + C-концевой 3xmyc был создан путем вставки последовательностей, кодирующих три эпитопа myc в рамке считывания, в сайты XhoI и XbaI pCS2 + DEST.

Генерация клеточной линии

Стабильные клеточные линии RPE и IMCD3 были получены, как описано ранее (Sang et al. 2011). Вкратце, родительская клеточная линия RPE или IMCD3, содержащая стабильно интегрированную кассету FRT, была трансфицирована pOG44, кодирующей рекомбиназу FLP (Invitrogen), и соответствующим вектором LAP. Затем клетки отбирали с помощью соответствующего антибиотика.

Микроскопия

Клетки помещали на покровное стекло и вызывали образование инфузорий путем удаления сыворотки. Через 24 часа клетки обрабатывали холодом в течение 15 минут на льду для деполимеризации небеленых микротрубочек, фиксировали 10 минут в 4% формальдегиде в PBS и трижды промывали PBS. Покровные стекла блокировали иммунофлуоресцентным буфером (PBS плюс 30 мг / мл BSA, 0,1% NP-40) плюс 5% нормальной ослиной сыворотки (Jackson ImmunoResearch). Реснички и базальные тельца / центросомы визуализировали путем иммуноокрашивания с использованием 6-11b-1 антиацетилированного тубулина (1: 2000; Sigma) и кроличьих антиперицентриновых антител (1: 2000; Abcam) в иммунофлуоресцентном буфере соответственно.Вторичные антитела против Cy3 против кролика и Cy5 против мыши (Jackson ImmunoResearch) добавляли в соотношении 1: 2000 в иммунофлуоресцентном буфере в течение 30 минут после пяти промывок иммунофлуоресцентным буфером. Добавляли Hoechst 33342 (AnaSpec, Inc.) на 5 мин, покровные стекла пять раз промывали иммунофлуоресцентным буфером и помещали в Fluoromount G. Изображения получали на рабочей станции деконволюции Everest (Intelligent Imaging Innovations), оснащенной Zeiss AxioImager.Z1 микроскоп, охлаждаемая CCD-камера CoolSnapHQ (Roper Scientific) и 40 × PlanApochromat NA 1.3 объектива или 63 × PlanApochromat NA 1.4.

Тандемная аффинная очистка

Тандемная аффинная очистка выполнялась в основном, как описано (Mukhopadhyay et al. 2010). Вкратце, клетки, стабильно экспрессирующие конструкцию с LAP-меткой, лизировали в 50 мМ HEPES (pH 7,4), 300 мМ KCl, 1 мМ EGTA, 1 мМ MgCl 2 , 0,5 мМ DTT, 0,3% NP-40, 0,2 мМ PMSF, и 1 × ингибиторы протеазы Roche Complete. Лизаты очищали на 27000 г , а затем снова на 100000 г .Комплексы иммунопреципитировали кроличьими антителами против GFP и элюировали протеазой TEV (LAP6) или PreScission (LAP5 и LAP7). Комплексы снова захватывали с использованием S-протеиновой агарозы (Novagen) и, наконец, элюировали в буфере для образцов 1 × SDS.

Рекомбинантные белки

Рекомбинантные GST, GST-ARL3 TN, GST-ARL3 QL и GST-UNC119a были экспрессированы в клетках Rosetta 2 (EMD Biosciences), индуцированы 0,2 мМ IPTG при 18 ° C в течение ночи и очищены с использованием глутатиона. сефароза в соответствии с рекомендациями производителя (GE Healthcare Life Sciences).Транслируемые in vitro белки были получены с использованием системы экспрессии TNT HighYield Wheat Germ Protein в соответствии с рекомендациями производителя (Promega).

GST pull-down анализы

Для каждой реакции pull-down добавляли 2,5 мкг слитого белка GST или GST вместе с 5–10 мкл транслируемого in vitro белка и 5 мкл глутатион-сефарозы в связывающем буфере (300 мкл 25 мМ HEPES при pH 7,4, 150 мМ NaCl, 2 мМ MgCl ( 2 , 1% Triton X-100) в течение 1 часа при 4 ° C. Гранулы промывали пять раз тем же буфером и элюировали буфером для образцов SDS.Элюаты разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали иммуноблоттингом с антителами против myc-HRP (GeneTex). Для конкурентных анализов реакции связывания проводили, как описано выше, включая только 0,1 мкМ, 1 мкМ, 5 мкМ или 10 мкМ пептид.

Анализы связывания пептидов

Пептиды были синтезированы и очищены с помощью обращенно-фазовой хроматографии с помощью Elim Biopharmaceuticals, что соответствует белку цистина человека. Более 95% пептида Myr-цистин содержат миристоильный фрагмент.Реакции связывания пептидов проводили путем добавления 450 фмоль биотинилированного пептида на С-конце с 5-10 мкл белка IVT экстракта зародышей пшеницы (Promega) и 5 ​​мкл стрептавидин-сефарозы (GE Healthcare Life Sciences) в 300 мкл связывающего буфера для 1 ч при комнатной температуре. Гранулы промывали пять раз буфером для связывания и элюировали буфером для образцов SDS. Для анализа высвобождения пептида 450 фмоль биотинилированного пептида Myr-цистин инкубировали с 5–10 мкл транслированного in vitro белка и 5 мкл стрептавидин-сефарозы в 300 мкл буфера для связывания в течение 1 ч при комнатной температуре.После двух промывок буфером для связывания GST-ARL2 или GST-ARL3 добавляли до 5,5 нМ, 11 нМ, 22 нМ или 44 нМ с конечным объемом 300 мкл. После 1-часовой инкубации комплексы промывали и анализировали, как описано выше.

Структурное моделирование

Для построения нашей структурной модели мы использовали структуру усеченного UNC119 (код PDB 3GQQ) в качестве эталона. Докинг миристоилированного пептида выполняли в два этапа. Сначала миристоильная группа была помещена в полость, окруженную фенильной рощей UNC119, а энергия была минимизирована с помощью программы интерактивного моделирования Benchware3D (Tripos).Выбор ориентации миристоильного полярного хвоста был сделан таким образом, чтобы было доступно пространство для присоединения пептида. Затем пептид был построен из сложного эфира миристата и нанесен на поверхность белка, чтобы дополнить поверхностный заряд и форму UNC119. Затем пептид был снова усечен до пяти N-концевых остатков, чтобы получить модель, представленную здесь. Иллюстрация модели сделана с помощью MacPyMOL.

Клеточное фракционирование

Стабильные клеточные линии, экспрессирующие LAP-tagged ARL3 TN или ARL3 QL, фракционировали, сначала лизируя клетки в гипотоническом буфере и раскачивая.Ядра осаждали в количестве 1400, г, и отбрасывали. Затем супернатант разделяли на растворимую фракцию (S100) и нерастворимый осадок (P100) центрифугированием при 100000 g . Затем равные количества каждого из них разделяли с помощью SDS-PAGE и анализировали иммуноблоттингом с антителом против GFP (Abcam).

Анализ трафика NPHP3 и эксперименты по спасению

Стабильная линия клеток LAP7-NPHP3 1–200 была помещена на покровные стекла в течение ночи и трансфицирована миРНК с помощью Lipofectamine RNAi Max (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя.Через 48 часов клетки лишали сыворотки среды, содержащей 0,2% FBS. Спустя двадцать четыре часа клетки обрабатывали иммунофлуоресценцией, как описано выше. Изображения из каждого образца были собраны и проанализированы с использованием идентичных настроек. Процент цилиарного NPHP3 определяли, сначала подсчитывая количество NPHP3-положительных ресничек (просматривая только канал Cy3 для перицентрина и канал GFP для NPHP3), а затем подсчитывая общее количество ресничек, определяемое иммуноокрашиванием ацетилированного тубулина Cy5.Эксперименты по спасению проводили путем первой трансфекции клеток плазмидой восстановления с использованием набора Amaxa Nucleofection Kit V и нанесения их на покровное стекло. На следующий день клетки трансфицировали миРНК, как описано выше. Через 24 часа клетки голодали по сыворотке в течение 24 часов для индукции ресничек, обрабатывали для визуализации и анализировали, как описано выше. Следующие используемые миРНК были приобретены у Dharmacon: ON-TARGETplus нецелевой контроль, ON-TARGETplus SMARTpool, нацеленный на ARL2, ON-TARGETplus UNC119a oligos J-009734-07 и J-009734-08, ON-TARGETplus ARL3 oligos J-0116-06 и J-011813-07, олигонуклеотиды ON-TARGETplus UNC119b J-035010-15 и J-035010-16 и олигонуклеотиды ON-TARGETplus RP2 J-012350-08 и J-012350-09.UNC119b oligo J-035010-15 нацелен на 3′-UTR и использовался в анализе «спасения».

C. elegans исследований
Штаммы

Штамм дикого типа был C. elegans Bristol, штамм N2. Дополнительными штаммами были DP38 unc-119 (ed3) ( Caenorhabditis Genetics Center) и CX3553 lin-15 (n765 ts ) ; kyIs104 [str-1 p :: gfp + lin-15 (+)] (Troemel et al. 1997).

Молекулярная биология

Ce unc-119p :: Hs unc119 b кДНК :: Ce unc-119 3′-конструкции UTR были получены последовательными слияниями ПЦР (Hobert 2002).Слияния содержат 2,56 т.п.н. и 1,27 т.п.н. последовательностей перед и после кодирующей области Ce unc-119 , соответственно (Maduro et al. 2000). Последовательности праймеров доступны по запросу. Продукты слияния ПЦР секвенировали для подтверждения отсутствия мутаций, индуцированных ПЦР. Трансгенные штаммы получали путем инъекции плазмид в концентрации 100 нг / мкл вместе с unc-122 :: dsRed в качестве маркера коинъекции.

Анализ заполнения красителем

Животных заполняли красителем DiI, как описано ранее (Perkins et al.1986; Герман и Хеджекок 1990). Отдельных животных помещали на предметные стекла с агарозой и исследовали при 400-кратном увеличении на микроскопе Zeiss Axioplan.

Отслеживание передвижения

Сытых однодневных взрослых животных помещали на чашку со свежим посевом, и их движения регистрировали в течение 15 минут, как описано (Biron et al. 2008; Beverly et al. 2011). Скорости движений отдельных животных были извлечены с использованием специально написанных скриптов в MatLab (The MathWorks, Inc.).

Статистический анализ

Статистический анализ проводился с использованием пакета статистического анализа SPSS 19.

Исследования на рыбках данио

Следующие антисмысловые МО стартовых сайтов были разработаны и приобретены у GeneTools: unc119a, AGCTCTGACTGTTCATCTCTCGGAA; unc119b, GCTGGTACAAGAATAGCTCATTATC; C5orf30, ACGCTCCACTGGCATCCATTTCCAT; и nphp3, TCACCAGAGAGGATGCCGTACCCAT. МО вводили под давлением воздуха в эмбрионы, состоящие из 1–4 клеток, в количествах, указанных на рис.

Анализ размера KV

Размер KV оценивали на живых эмбрионах на стадии развития от шести до 12 сомитов, как описано ранее (Yen et al.2006 г.). Вкратце, эмбрионы с KV меньше ширины хорды оценивались как аномальные.

Анализ реакции вздрагивания зрения

Поведенческий анализ реакции вздрагивания, индуцированного зрением, проводили, как описано ранее (Pretorius et al. 2010). Вкратце, 5-дневные эмбрионы после оплодотворения (dpf) подвергались 1-секундному блоку яркого света в качестве визуального стимула. Положительный визуальный ответ регистрировался, если эмбрион резко менял свое поведение при плавании сразу после смены освещения.Было проведено пять испытаний с интервалом 30 секунд, за которыми следовали механические стимулы зондирования эмбрионов тупой иглой. В анализ зрения были включены только эмбрионы, которые ответили на механический стимул и имели прямое тело.

Границы | Почему числа являются воплощением концепций

Числовые концепции часто считаются абстракциями, например, потому что количество множеств (например, их «тройность») — это характеристика, очевидно не связанная с сенсорным опытом с конкретными членами множества, такими как их размер, форма или цвет. .Другими словами, количественные переживания, кажется, изменяются произвольно, когда мы перечисляем три яблока, три машины, трех человек или три пальца. Следовательно, Фреге (1884) и другие логически мыслящие философы считали положительные целые числа идеальными когнитивными конструкциями для перечислительных мыслительных операций, удаленными от контекстных ограничений, но сохраняющих точность и обобщающие для ситуаций (например, арифметические операции).

Тем не менее, при более внимательном рассмотрении несколько сенсорных, а также моторных функций систематически сочетаются с каждым подсчетом, который мы проводим; это совпадение устанавливает паттерны опыта, посредством которых числовые концепции воплощаются как часть их истории приобретения (см.Фишер и Брюггер, 2011). Я описываю здесь несколько таких систематических совпадений и цитирую подтверждающие доказательства. Этот психологический взгляд на число не противоречит, а расширяет чисто логические соображения о числовых концепциях как основах формальной арифметики, как это было предложено Фреге (1884).

Объекты, подлежащие перечислению, обычно все одновременно доступны нам и, таким образом, по физической необходимости распределены в пространстве, потому что два объекта не могут занимать одно и то же место в одно и то же время.Следовательно, большее количество объектов занимает больше места, и их перечисление предлагает пространственно распределенное и расширенное во времени поведение; это сенсорные сигналы к числу. Систематическая направленность поведения при счете, кроме того, устанавливает пространственно-числовые ассоциации, которые, в свою очередь, можно обнаружить с помощью хронометрических методов и с помощью поведенческих предубеждений (обзоры см. В Fischer and Shaki, 2014; Winter et al., 2015).

Мы знаем, что элементы множества должны быть выровнены или сгруппированы в пространстве, чтобы уменьшить нагрузку на пространственную память при их подсчете.Мы применяем вербальные сенсомоторные процедуры для установления взаимно однозначных соответствий между объектами и числовыми именами до тех пор, пока на каждый объект (или группу) не будет ссылаться один раз, а последнее числовое имя не установит размер набора или количество элементов (например, Gelman and Gallistel, 1978). Без такой прямой ссылки на объекты посредством наведения указателей наши глаза и пальцы являются универсальным средством связывания положений тела (то есть пространственных, визуальных, кинестетических и проприоцептивных сигналов) с числовыми именами (Fischer, 2003a; Di Luca and Pesenti, 2011).Как следствие, положение глаз предсказывает числовые мысли (Loetscher et al., 2010), тактильная стимуляция пальцев обрабатывает числа, а восприятие чисел, в свою очередь, модулирует визуально-пространственное (Fischer et al., 2003), а также тактильную чувствительность (Tschentscher et al. ., 2012; Sixtus et al., 2017; Sixtus et al., В редакции). Даже когда мы избегаем явных движений пальцев, мы спонтанно генерируем повторяющиеся движения верхней части тела, чтобы обогатить наш счет сенсорно-моторной обратной связью (Carlson et al., 2007).

Обычно люди, выросшие в западных культурах, указывают на горизонтально расположенные объекты слева направо и, таким образом, связывают все большее число имен с все более правосторонними действиями (Opfer and Furlong, 2011; Shaki et al., 2012). Происхождение этого культурного предубеждения можно отнести к наблюдательному обучению в дошкольном возрасте (Göbel et al., 2018), но может иметь эволюционное происхождение (Rugani et al., 2015). Другими словами, повсеместная пространственно-числовая ассоциация кодов ответа (SNARC) с эффектом является результатом предпочтительных сенсомоторных привычек.

Два других характерных эффекта числового познания также могут быть воплощены в происхождении, а не только эпифеноменально. Во-первых, когда решается, какой из двух наборов физически больше, производительность регулируется законом Вебера, где едва заметная разница между ними увеличивается с размером набора. Более того, мы эвристически ожидаем, что чем больший набор, тем многочисленнее. Этот образец сохраняется, когда мы различаем символические величины (то есть различая значения двух цифр). Этот так называемый числовой эффект расстояния (Мойер и Ландауэр, 1967) предполагает, что мы обязательно возвращаемся к конкретным сенсорным и моторным переживаниям, имевшимся при усвоении этих концепций.

А во-вторых, собирая объекты, мы расширяем наши сенсомоторные ощущения от аудиовизуальных и моторных до тактильной области. В результате более широкие отверстия для захвата дают большие числа (Andres et al., 2004), а величина числа, в свою очередь, искажает текущий зрительно-моторный контроль (Fischer, 2003b). Удерживание наборов объектов также позволяет нам ощутить положительную корреляцию количества и веса. Таким образом, систематические мультимодальные сенсомоторные опыты сопровождают использование концепций натуральных чисел и создают масштабные проблемы обработки для когнитивной системы.Это воплощенная основа эффекта числового размера , то есть систематического увеличения затрат на обработку, связанного с большей численностью, улавливающей большинство повседневных событий, таких как умение жонглировать 3, а не 4 мячами (Fischer, 2017).

Подводя итог, три основных признака числового познания, эффект SNARC, эффект расстояния и эффект размера, могут быть основаны на сенсомоторном опыте и в этом смысле воплощены (для терминологического различия между «заземленным» и « воплощенная »числовая обработка, см. Fischer, 2012).Поэтому неудивительно, что мы находим кросс-доменное прайминг в широком диапазоне задач, когда люди думают количественно, будь то временные, пространственные или концептуальные (Casasanto and Boroditsky, 2008; Scheepers and Sturt, 2014; Walsh, 2015). Эти ассоциации выходят за рамки положительных целых чисел или манипуляций с ними в ментальной арифметике (например, Werner and Raab, 2014) и даже формируют то, как мы думаем об отрицательных числах, которые нельзя воспринимать как сенсорные величины. Первоначальный отчет (Fischer, 2003b) связывал отрицательные числа с левым пространством, а также показал эффект размера (при контроле эффекта расстояния).Этот вывод вызвал некоторые противоречия (обзор в Mende et al., 2017), но был подтвержден, когда оценка устранила потенциальные искажения из пространственно распределенного представления стимула или записи ответа (Fischer and Shaki, 2017). Таким образом, наш привычный опыт с пространственно организованными величинами заменяет отсутствие сенсорного опыта отрицательными числами, чтобы вызвать предсказуемые сенсомоторные ассоциации.

В заключение, числовые концепции, хотя часто используются вне контекста и кажутся абстрактными (Frege, 1884), всегда несут сенсомоторные коннотации.Этот коррелятивный опыт используется для прогнозирования, а не абстракции — другими словами, мы применяем конкретный опыт, собранный в области знаний (источник), для создания прогнозов, которые обогащают, казалось бы, «абстрактные» концептуальные знания (целевая область). Таким образом, только через призму воплощения мы можем оценить всю природу знаний о числах и разработать соответствующие методы для эффективного обучения и восстановления числового познания.

Авторские взносы

MF: придумал и написал этот комментарий и несет полную ответственность за его содержание.

Финансирование

Это исследование финансировалось Немецким исследовательским фондом (DFG) FI 1915 / 5-1 (Подход к решению проблем, основанный на использовании двигателя).

Заявление о конфликте интересов

Автор заявляет, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Список литературы

Андрес М., Даваре М., Пезенти М., Оливье Э. и Серон X. (2004).Взаимодействие между величиной числа и отверстием захвата. Neuroreport 15, 2773–2777.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Карлсон, Р. А., Авраамидес, М. Н., Кэри, М., и Страсберг, С. (2007). Что руки выражают в простой арифметике. J. Exp. Psychol. 33, 747–756. DOI: 10.1037 / 0278-7393.33.4.747

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фишер, М. Х. (2003a). Пространственные представления в обработке чисел — свидетельство задания на указатель. Vis. Cogn. 10, 493–508. DOI: 10.1080 / 13506280244000186

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фишер, М. Х. (2017). «Почему числа (не) являются абстрактными понятиями», в презентации на 20-м заседании Европейского общества когнитивной психологии (Потсдам).

Google Scholar

Фишер, М. Х., и Брюггер, П. (2011). Когда цифры помогают цифрам: пространственно-числовые ассоциации указывают на счет пальцев как на яркий пример воплощенного познания. Фронт. Psychol. 2: 260. DOI: 10.3389 / fpsyg.2011.00260

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фишер М. Х., Шаки С. (2014). Пространственные ассоциации в числовом познании: от однозначных чисел до арифметических. Q. J. Exp. Psychol. 67, 1461–1483. DOI: 10.1080 / 17470218.2014.927515

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фишер М. Х., Шаки С. (2017). Неявные пространственно-числовые ассоциации: отрицательные числа и роль направления счета. J. Exp. Psychol. 43, 639–643. DOI: 10.1037 / xhp0000369

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фреге, Г. (1884). Die Grundlagen der Arithmetik (Основы арифметики) . Бреслау: Вильгельм Кебнер.

Google Scholar

Гельман Р. и Галлистель К. Р. (1978). Детское понимание числа . Кембридж, Массачусетс: Издательство Гарвардского университета.

Google Scholar

Гёбель, С.М., МакКринк, К., Фишер, М. Х., и Шаки, С. (2018). Наблюдение за направленным чтением сборников сказок влияет на направление счета маленьких детей. J. Exp. Child Psychol. 166, 49–66. DOI: 10.1016 / j.jecp.2017.08.001

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лётчер, Т., Бокиш, К. Дж., Николлс, М. Э. Р., и Брюггер, П. (2010). Положение глаз предсказывает, какое число вы имеете в виду. Curr. Биол. 20, R264 – R265. DOI: 10.1016 / j.cub.2010.01.015

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Менде, М.А., Шаки, С., и Фишер, М.Х. (2017). О развитии и представлении понятий отрицательных чисел (это специальная тема исследования).

Google Scholar

Опфер Дж. Э. и Ферлонг Э. Э. (2011). Как числа влияют на пространственный поиск дошкольников. J. Cross Cul. Psychol. 42, 682–695. DOI: 10.1177 / 0022022111406098

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ругани, Р., Валлортигара, Г., Прифтис, К., и Реголин, Л. (2015). Отображение числа в пространстве новорожденного цыпленка напоминает числовую линию человека. Наука 347, 534–536. DOI: 10.1126 / science.aaa1379

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шиперс, К., и Стерт, П. (2014). Двунаправленное синтаксическое праймирование в когнитивных областях: от арифметики к языку и обратно. Q. J. Exp. Psychol. 67, 1643–1653. DOI: 10.1080 / 17470218.2013.873815

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шеки, С., Фишер, М. Х., Гебель, С. М. (2012). Направление подсчета: сравнительное исследование пространственно-направленных систематических ошибок в культурах с разными направлениями чтения. J. Exp. Child Psychol. 112, 275–281. DOI: 10.1016 / j.jecp.2011.12.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ченчер, Н., Хаук, О., Фишер, М. Х., и Пульвермюллер, Ф. (2012). Вы можете рассчитывать на моторную кору: фМРТ показывает обработку воплощенных чисел. NeuroImage 59, 3139–3148.DOI: 10.1016 / j.neuroimage.2011.11.037

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Уолш В. (2015). «Теория величины: части, которые суммируются с числом», в Оксфордский справочник по числовому познанию , ред. Р. Коэн Кадош и А. Даукер (Oxford: University Press), 552–565.

Google Scholar

Вернер К. и Рааб М. (2014). Перемещение взгляда на решение: влияние движений на восприятие задачи, связанной с решением проблемы. Q. J. Exp.Psychol. 67, 1571–1578. DOI: 10.1080 / 17470218.2014.889723

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

от лоскутов до микрохирургии, регенеративной медицины и биотехнологии?

  • 1. Бимер Э., Йегер К. Медикаментозное лечение после ухода и вторичных вмешательств после реконструкции голени путем свободного переноса ткани. Chirurg 1986; 57: 140. (на немецком языке)

    PubMed
  • 2. Hay EL, Shealy GJ, Hanel DP, Stoddard LC. Спасение нижних конечностей с помощью лоскутов, свободных от микрососудов.JSC Med Assoc 1985; 81: 311-6.

    PubMed
  • 3. Hallock GG. Тяжелая травма нижних конечностей. Обоснование микрохирургической реконструкции. Ортоп Ред. 1986; 15: 465-70.

    PubMed
  • 4. Вальгенбах К.Дж., Фойгт М., Андре С., Старк Г.Б., Хорьх РЭ. Лечение гиповаскуляризованных ран, не отвечающих на традиционную терапию, посредством свободной трансплантации мышц. Васа 2001; 30: 206-11.

    DOIPubMed
  • 5. Ducic I, Rao SS, Attinger CE. Результаты микрососудистой реконструкции однососудистых нижних конечностей: спасение конечности в сравнении с ампутацией.Журнал Reconstr Microsurg 2009; 25: 475-8.

    DOIPubMed
  • 6. Дайгелер А., Кнезер У, Фанса Х, Ристер Т., Удер М., Хорьх РЭ; Deutschsprachige Gemeinschaft für Mikrochirurgie der периферийный Nerven und Gefäße. Реконструкция сосудистой скомпрометированной нижней конечности — отчет о консенсусном семинаре на 35-м заседании DAM (Deutschsprachige Gemeinschaft fur Mikrochirurgie der периферийные нервы и Gefasse) 2013 в Дайдесхайме. Хандчир Микрочир Пласт Чир 2014; 46: 248-55. (на немецком языке)

    PubMed
  • 7.Kneser U, Arkudas A, Beier JP, Dragu A, Stübinger A, Lang W, Horch RE. Расширенные дефекты кожи и мягких тканей после сосудистых ран: концепции пластической хирургии. Zentralbl Chir 2013; 138: 536-42. (на немецком языке)

    PubMed
  • 8. Horch RE, Horbach T., Lang W. Лоскут без питательного сальника: реваскуляризация с обходом вен и лоскутом большого сальника при тяжелых артериальных язвах. J Vasc Surg 2007; 45: 837-40.

    DOIPubMed
  • 9. Horch RE, Lang W., Arkudas A, Taeger C., Kneser U, Schmitz M, Beier JP.Не содержащие питательных веществ лоскуты с сосудистыми шунтами для спасения конечностей у пациентов с хронической ишемией конечностей. J Cardiovasc Surg (Турин) 2014; 55: 265-72.

  • 10. Хорьх Р.Э., Ланг В., Мейер А., Шмитц М. Шунтирование дистальных педалей в сочетании со свободными микрохирургическими лоскутами при хронической ишемии конечностей при проблемных ранах. Int Wound J 2016; 13: 425-6.

    DOIPubMed
  • 11. Horch RE, Walgenbach KJ, Voigt M, Stark GB. Бесплатная «экстренная» пересадка лоскута прямой мышцы живота для лечения сложных травм кисти.Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd 1998; 115: 1194-6. (на немецком языке)

    PubMed
  • 12. Hallock GG. Смена парадигмы в протоколах выбора лоскута для зон нижней конечности с использованием лоскута перфоратора. Журнал Reconstr Microsurg 2013; 29: 233-40.

    DOIPubMed
  • 13. Колен LB. Спасение конечностей у пациента с тяжелым заболеванием периферических сосудов: роль микрохирургического переноса свободных тканей. Пласт Реконстр Сург 1987; 79: 389-95.

    DOIPubMed
  • 14. Вальгенбах KJ, Horch R, Voigt M, Andree C, Tánczos E, Stark GB.Бесплатная микрохирургическая лоскутная пластика в реконструктивной терапии язвы диабетической стопы. Zentralbl Chir 1999; 124 Приложение 1: 40-4. (на немецком языке)

    PubMed
  • 15. Walgenbach KJ, Voigt M, Horch R, Stark GB. Хирургически индуцированный ангиогенез как основной принцип лечения гиповаскуляризованных ран — питательный лоскут. Langenbecks Arch Chir Suppl Kongressbd 1998; 115: 1186-8. (на немецком языке)

    PubMed
  • 16. Goldberg JA, Alpert BS, Lineaweaver WC, Buncke HJ. Реконструкция микрососудов нижней конечности у пожилых людей.Clin Plast Surg 1991; 18: 459-65.

    PubMed
  • 17. Лоренцетти Ф., Джордано С., Тукиайнен Э. Интраоперационная гемодинамическая оценка лоскута широчайшей мышцы спины: проспективное исследование. Журнал Reconstr Microsurg 2012; 28: 273-8.

    DOIPubMed
  • 18. Лудольф И., Ленхардт М., Аркудас А., Кнезер У., Пирер Дж., Хардер Й., Хорьх РЭ. Пластическая реконструктивная микрохирургия у пожилого пациента. Заявление о консенсусе немецкоязычной рабочей группы по микрохирургии периферических нервов и сосудов.Хандчир Микрочир Пласт Чир 2017; 49: 1-8. (на немецком языке)

  • 19. Polykandriotis E, Schmidt VJ, Kneser U, Jianming S, Boccaccini AR, Horch RE. Биореакторы в регенеративной медицине — от технического устройства до реконструктивной альтернативы? Хандчир Микрочир Пласт Чир 2012; 44: 198-203.

    DOIPubMed
  • 20. Вейганд А., Байер Дж. П., Аркудас А., Аль-Аббуди М., Поликандриотис Е., Хорьх Р. Э., Боос А. М.. Артериовенозная (av) петля в модели небольших животных для изучения ангиогенеза и васкуляризованной тканевой инженерии.Журнал Vis Exp 2016; (117): 54676.

    DOI
  • 21. Weigand A, Beier JP, Hess A, Gerber T., Arkudas A, Horch RE, Boos AM. Ускорение создания васкуляризированных конструкций из костной ткани в модели на крупных животных, сочетающей внутреннюю и внешнюю васкуляризацию. Tissue Eng Часть A 2015; 21: 1680-94.

    DOIPubMed
  • 22. Arkudas A, Beier JP, Heidner K, Tjiawi J, Polykandriotis E, Srour S, Sturzl M, Horch RE, Kneser U. Осевая преваскуляризация пористых матриксов с использованием артериовенозной петли способствует выживанию и дифференцировке трансплантатов. остеобласты.Tissue Eng 2007; 13: 1549-60.

    DOIPubMed
  • 23. Arkudas A, Tjiawi J, Saumweber A, Beier JP, Polykandriotis E, Bleiziffer O, Horch RE, Kneser U. Оценка прорастания кровеносных сосудов в фибриновом геле в зависимости от типа и концентрации факторов роста. J Cell Mol Med 2009; 13: 2864-74.

    DOIPubMedPMC
  • 24. Бертрам У., Штайнер Д., Поппиц Б., Диппольд Д., Кён К., Байер Дж. П., Детч Р., Боккаччини А. Р., Шуберт Д. В., Хорш Р. Е., Аркудас А. Инженерия сосудистой ткани: эффекты интеграции коллагена в Материал нановолокна на основе PCL.Биомед Рес Инт 2017; 2017: 9616939.

    DOIPubMedPMC
  • 25. Диппольд Д., Цай А., Хардт М., Боккаччини А.Р., Хорьх Р., Байер Дж. П., Шуберт Д.В.. Новый подход к выровненным нановолоконным конструкциям PCL-коллаген из безвредной системы растворителей. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl 2017; 72: 278-83.

    DOIPubMed
  • 26. Rottensteiner U, Sarker B, Heusinger D, Dafinova D, Rath SN, Beier JP, Kneser U, Horch RE, Detsch R, Boccaccini AR, Arkudas A. Биосовместимость альгинатного диальдегида in vitro и in vivo желатиновые гидрогели с наноразмерным биоактивным стеклом и без него для инженерии костной ткани.Материалы (Базель) 2014; 7: 1957-74.

    DOIPubMedPMC
  • 27. Witt R, Weigand A, Boos AM, Cai A, Dippold D, Boccaccini AR, Schubert DW, Hardt M, Lange C, Arkudas A, Horch RE, Beier JP. Мезенхимальные стволовые клетки и дифференцировка миобластов при стимуляции HGF и IGF-1 для трехмерной инженерии ткани скелетных мышц. BMC Cell Biol 2017; 18:15.

    DOIPubMedPMC
  • 28. Horch RE, Beier JP, Kneser U, Arkudas A. Успешное долгосрочное применение инженерии костной ткани in situ на людях.J Cell Mol Med 2014; 18: 1478-85.

    DOIPubMedPMC
  • 29. Гролл Дж., Боланд Т., Бланк Т., Бурдик Дж. А., Чо Д. В., Далтон П. Д., Дерби Б., Форгач Дж., Ли Кью, Миронов В. А., Морони Л., Накамура М., Шу В., Такеучи С., Воцци Дж., Вудфилд Т. Б., Сюй Т., Ю Дж. Дж., Мальда Дж. Биотехнология: переоценка определения развивающейся области. Биотехнология 2016; 8: 013001.

    DOIPubMed
  • 30. Wu C, Wang B, Zhang C, Wysk RA, Chen YW. Биопечать: оценка, основанная на степени готовности производства.Crit Rev Biotechnol 2017; 37: 333-54.

    DOIPubMed
  • 31. Равник DJ, Леберфингер А.Н., Озболат ИТ. Биопечать и клеточная терапия диабета 1 типа. Trends Biotechnol 2017; DOI: 10.1016 / j.tibtech.2017.07.006.

    DOI
  • 32. Horch RE. Будущие перспективы тканевой инженерии. J Cell Mol Med 2006; 10: 4-6.

    DOIPubMedPMC
  • 33. Horch RE, Weigand A, Beier JP, Arkudas A, Boos AM. Потенциальная роль телоцитов для тканевой инженерии и регенеративной медицины.Adv Exp Med Biol 2016; 913: 139-47.

    DOIPubMed
  • Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

    Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

    Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

    Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

    • В вашем браузере отключены файлы cookie.Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
    • Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
    • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
    • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie.Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
    • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

    Почему этому сайту требуются файлы cookie?

    Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу.Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

    Что сохраняется в файле cookie?

    Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

    Как правило, в файлах cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта.Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

    Характеристика активации микроглии: подход пространственной статистики для максимального извлечения информации

    Животные

    Все исследования проводились в соответствии с Заявлением ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения и Директивой Совета европейских сообществ от 22 сентября 2010 г. (2010 г.) / 63 / EU) и бельгийского законодательства (KB от 29 мая 2013 г.) и были одобрены институциональным этическим комитетом KU Leuven (P025-2013).Мышей дикого типа (C57Bl6 / J; Charles River Laboratories) в возрасте от 2 до 4 месяцев содержали при 12/12 часовом цикле свет-темнота и ad libitum доступа к пище и воде.

    Хирургические процедуры

    Внутриглазничное раздавливание зрительного нерва (ONC) выполняли, как описано 15 , у 14 животных. Вкратце, на конъюнктиве делали височный разрез, а затем обнаженный зрительный нерв раздавливали на расстоянии 1 мм от глазного яблока щипцами перекрестного действия (№ 11262-30, Fine Science Tools) в течение 5 секунд.Фундускопия была выполнена до и после процедуры для оценки целостности перфузии сетчатки. Животных умерщвляли через 4 дня после ONC.

    Все хирургические вмешательства проводились под общей анестезией с применением ксилазина (внутрибрюшинно 10 мг / кг веса тела, XYL-M) и кетамина (внутрибрюшинно 70 мг / кг веса тела, Ниматек). После процедуры наносили мазь с антибиотиком (тобрамицин 3 мг / г, Тобрекс), чтобы избежать инфицирования и высыхания роговицы. Наивные глаза из отдельной когорты нелеченных животных служили контролем (N = 14).

    Иммуногистохимия на Iba-1 на целых образцах сетчатки

    Для того, чтобы пометить микроглию (и потенциальную инфильтрацию макрофагов из кровотока), иммуноокрашивание Iba-1 было выполнено на целых образцах сетчатки 30 . Мышей подвергали глубокой анестезии (внутрибрюшинно 30 мг / кг пентобарбитала натрия, нембутала) и умерщвляли путем смещения шейных позвонков. Глаза вскрывали и фиксировали в течение 1 часа в 4% PFA. Затем сетчатку полностью фиксировали и снова фиксировали в течение 1 часа в 4% PFA. Сетчатку целиком замораживали в течение 15 минут при -80 ° C и кроличьи анти-Iba-1 (Wako Chemicals, # 019-19741) (1: 1000) разводили в 10 мМ фосфатно-солевом буфере (PBS), содержащем 2% Тритон Х-100 и 2% козья предиммунная сыворотка применяли в течение ночи.На следующий день на 2 часа наносили вторичное козье антитело против кроличьего IgG, конъюгированное с флуорофором Alexa-488 (Life Technologies) (1: 200). Целые образцы сетчатки промывали PBS с 0,5% Triton X-100 между этапами и устанавливали с использованием монтажной среды mowiol (10% mowiol 4–88, 40% глицерина, 0,1% 1,4-диазабицикло- [2,2, 2] -октан в 0,2 М трис-HCl [pH 8,5]). Мозаичные изображения z-стопки (размер шага 3 мкм; 20–30 стопок на изображение, включая слой нервных волокон сетчатки до слоя фоторецепторов; объектив с 20-кратным увеличением; 1 пиксель = 1.24 мкм) всей монтировки были получены с помощью лазерного конфокального сканирующего микроскопа (FV1000, Olympus), контролируемого с помощью программного обеспечения FluoViewer 4.2 (Olympus), и была сделана проекция максимальной интенсивности для дальнейшего анализа.

    Автоматическая количественная оценка микроглии, меченной Iba-1, в целых образцах сетчатки

    (Шаг 1) Анализ изображения был выполнен с использованием программного обеспечения Fiji (ImageJ, v1.51 h, 64-bit Windows) 38 с MorphoLibJ (v1.3.1) интегрированная библиотека и плагин 39 .Количественная оценка микроглии, меченной Iba-1, в целых образцах сетчатки была достигнута с использованием многоэтапного алгоритма. Во-первых, сегментация микроглии, меченной Iba-1, была достигнута путем применения фильтра открытия атрибута шкалы серого (минимум области: 25 пикселей; возможность подключения: 8) к максимальной 8-битной проекции всей монтировки сетчатки. Открывающий морфологический фильтр (восьмиугольник с радиусом в 1 пиксель) затем эффективно использовался для отделения сомы микроглии от процессов, прежде чем был использован максимальный порог энтропии для сегментации сомы микроглии от фона изображения.{2}} $$

    (1)

    , где A — площадь сомы микроглии, а M — длина большой оси, производная от самой длинной оси эллипса, подходящего к каждой соме микроглии. Чтобы построить график вышеуказанных измерений как функцию расстояния от ONH, было определено евклидово расстояние каждого центроида микроглии относительно центра головки зрительного нерва (ONH) с использованием метода, ранее описанного для ганглиозных клеток сетчатки ( уравнение 2) 40 .{2}} $$

    (2)

    где d — евклидово расстояние микроглии, (a, b) — центр координат ONH (определяется вручную), а (x, y) — центроид каждой микроглии в сетчатке. Результаты были представлены в виде процентных частотных распределений (размер ячейки: 50 мкм), чтобы обеспечить усреднение нескольких сетчаток и сравнения между группами лечения.

    (Шаг 3) Расстояние до ближайшего соседа (NND) было определено с использованием скрипта для Фиджи (ImageJ), разработанного Y.Mao 41 , и только частицы с NND <14 пикселей считались микроглией, чтобы исключить крупные артефакты процесса из последующего анализа. Индекс регулярности (RI) был рассчитан с использованием уравнения 3:

    $$ RI = \, \ frac {{X} _ {NND}} {{\ delta} _ {NND}} $$

    (3)

    , где X NND — это средний NND для популяции, а δ NND — стандартное отклонение для этой популяции 42 .

    (Шаг 4) Площадь сетчатки целиком определялась, как описано ранее 40 .Вкратце, операторы, замаскированные для групп лечения, применяли порог низкой интенсивности (0–5) к каждому 8-битному изображению. Площадь пикселя этой выборки была измерена с использованием Fiji (ImageJ) и преобразована в 2 мм, и из этой выборки глобальная плотность микроглии была определена путем деления общей популяции микроглии на общую площадь сетчатки. Границы каждой области сетчатки были экспортированы как список xy-координат и использовались вместе с координатами центроида микроглии для создания пространственных точечных процессов с границами области сетчатки.

    Подробное описание процесса сегментации микроглии, а также ссылка на исходный код Фиджи включены в качестве дополнительного файла. Исходный код Фиджи также общедоступен по адресу http://bio.kuleuven.be/df/lm/research/methods. Наборы данных, сгенерированные и проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

    Параметрический статистический анализ

    Для параметрической статистики нормальное распределение и параллельная одинаковая дисперсия между группами тестировались с помощью тестов Д’Агостино-Пирсона (омнибус K2) и Брауна-Форсайта, соответственно.Уровень значимости α <0,05 считался значимым (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,005). Все данные в тексте представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего. GraphPad Prism 5 (программное обеспечение GraphPad) использовался для всех анализов, включая графики Бланда-Альтмана.

    K — означает кластеризацию и цветовое картирование.

    Данные о площади сомы и округлости для каждой микроглии, идентифицированной в этом исследовании, были объединены перед нормализацией с 90% победой каждой популяции для удаления крайних значений 43 . K — означает кластеризацию с использованием протокола, описанного Хартиганом и Вонгом 44 , была определена с помощью функции K -means в программном пакете R stats (v3.3.1) популяции микроглии с низкой и высокой активностью. После приписывания кластеров популяции микроглии были разделены сетчаткой, и цветные карты центроидов микроглии (координаты x, y), построенные с микроглией «низкой» активности, были идентифицированы как черные, а микроглия «высокой» активности — красным.

    Функции Ripley

    K- и L

    Центроиды микроглии от каждой сетчатки использовались в сочетании с обозначениями «низкой» или «высокой» активности для создания пространственных точечных процессов, ограниченных областью сетчатки. Чтобы определить степень отклонения распределения микроглии от пространственной однородности, были применены функции Ripley K 46 с использованием функции Kest из программного пакета R spatstat 47 , чтобы сравнить пространственные точечные паттерны микроглии и оценить отклонение от конкурирующей пространственной случайности. .{-1} $$

    (4)

    , где N — количество ячеек на расстоянии r от другой точки, λ — средняя плотность ячеек на единицу площади, а P и — это и -я ячейка и сумма, взятая по n ячейкам.

    Конкурирующая пространственная случайность оценивалась с использованием случайного распределения Пуассона K ( r ) = π r 2 где r > 0.{0,5} $$

    (5)

    Используя это преобразование, при конкурентной пространственной случайности r является линейным, а L ( r )> r указывает на кластеризацию, а L ( r ) < r указывает на рассредоточение. L ( r ) может быть дополнительно нормализован для получения H -функции 50 , так что ожидаемое значение r при конкурирующей пространственной случайности равно нулю (уравнение 6).

    Это преобразование полезно для анализа пространственных точечных процессов микроглии. Используя адаптацию работы Кишковски и др. . 48 , радиусы территорий микроглии (радиусы исключения) можно оценить как вторые минимумы — поскольку распределение микроглии — это процесс рассредоточения, а не кластеризации — H ( r ), исключая первые минимумы, которые являются артефактом. алгоритмов NND радиусов исключения. Чтобы определить, изменились ли радиусы исключения популяции микроглии «низкой активности» ( Kii ), «высокой активности» ( Kjj ) и межгрупповой ( Kij ) при повреждении ONC, изменения пространственного поведения «высоких» и «Низкоактивные» популяции микроглии в отмеченных точечных процессах оценивались с использованием функций self- K и cross- K программного пакета R spatstat для каждой сетчатки.

    -тест Диксона χ

    2 -тест

    Поскольку кластеризация популяции микроглии могла происходить независимо от существования ранее определенных радиусов исключения, для оценки пространственного разделения «низкой активности» и «высокой активности» был использован тест Диксона χ 2 .

    Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *