Википедия паз 32053: — Википедия

ПАЗ-3205 — Вики

ПАЗ-3205
ПАЗ-32053 (рестайлинг 2014 года)
Завод-изготовитель	ПАЗ → Павловский автобус) РусАвтоПром[1]
Проект, г	1982
Выпускался, гг	1989 — настоящее время 2010 — настоящее время (
Экземпляры	более 145000
Полная масса, т	7,61
Снаряжённая масса, т	5,61
Макс. скорость, км/ч	70
Класс автобуса	высокопольный малый
ЭКО стандарт	Евро-0—Евро-5
Мест для сидения	23
Номинальная вместимость (5 чел./м²)	42
Полная вместимость (8 чел./м²)	50
Длина, мм	7000
Ширина, мм	2500
Высота по крыше, мм	2880
База, мм	3600
Просвет, мм	264
Количество дверей для пассажиров	2
Формула дверей	2 2+1 2+2
Напряжение бортовой низковольтной сети, В	12
Модель двигателя	ЗМЗ-5234 Производитель ЗМЗ Тип Бензиновый Объём 4670 см3 Максимальная мощность 130 л. с., при 3200 об/мин Максимальный крутящий момент 314 Н·м, при 2000 об/мин Конфигурация V8 Цилиндров 8 Клапанов 16 Макс. скорость 90 Расход топлива при смешанном цикле 32 Экологические нормы EURO-0 — 4 Диаметр цилиндра 92 мм Ход поршня 88 мм Степень сжатия 6,5 Система питания карбюратор К-135 Охлаждение жидкостное Клапанной механизм OHV Материал блока цилиндров алюминий Материал ГБЦ алюминий Тактность (число тактов) 4 Рекомендованное топливо АИ-80, АИ-92, ЗМЗ-5245.10 Производитель ЗМЗ Тип Бензиновый Объём 4670 см3 Максимальная мощность 98,7 кВт (134 л. с.), при 3600 об/мин Максимальный крутящий момент 308 Н·м, при 2600 об/мин Конфигурация V8 Цилиндров 8 Клапанов 16 Макс. скорость 90 Расход топлива при смешанном цикле 32 Экологические нормы EURO-4 — 5 Диаметр цилиндра 92 мм Ход поршня 88 мм Степень сжатия 8,3 Система питания Инжектор Охлаждение жидкостное Клапанной механизм OHV Материал блока цилиндров алюминий Материал ГБЦ алюминий Тактность (число тактов) 4 Рекомендованное топливо АИ-92, АИ-95 ММЗ Д-245. 7 Производитель ММЗ Тип Дизель Объём 4750 см3 Максимальная мощность 129 л. с., при 2400 об/мин Максимальный крутящий момент 455 Н·м, при 1600 об/мин Конфигурация R Цилиндров 4 Макс. скорость 90 Расход топлива при смешанном цикле 25 Экологические нормы EURO-1 — 5 Диаметр цилиндра 110 мм Ход поршня 125 мм Степень сжатия 15 Система питания дизель Охлаждение жидкостное Материал блока цилиндров чугун Тактность (число тактов) 4 Порядок работы цилиндров 1-3-4-2 Рекомендованное топливо ДТ
Модель коробки передач	механическая 4-ступ. Производитель ГАЗ Модель ГАЗ-3307 Тип механическая Число ступеней 4 1 передача 6,55 2 передача 3,09 3 передача 1,71 4 передача 1,0 Задняя передача 7,77 Синхронизаторы 2-4 передачи Переключение напольный рычаг механическая 5-ступ. Производитель СААЗ Модель СААЗ-3206-70 Тип механическая Число ступеней 5 1 передача 5,63 2 передача 2,64 3 передача 1,48 4 передача 1,0 5 передача 0,81 Задняя передача 5,36 Синхронизаторы 2-4 передачи Переключение напольный рычаг
Тип задней подвески	Зависимая, рессорная с амортизаторами;
Тип передней подвески	Зависимая, рессорная с корректирующими пружинами и амортизаторами
Медиафайлы на Викискладе

ПАЗ-32051. Вид сбоку

ПАЗ-3205 (разг. «Па́зик») — советский и российский высокопольный автобус малого класса производства завода «Павловский автобус», является базовой и классической моделью завода с 1989 года.

С 2014 года для модификаций автобуса ПАЗ-32053, ПАЗ-32054, ПАЗ-4234 появился рестайлинг. Модели ПАЗ-3205 и ПАЗ-32051 не выпускаются с 2003 года.

История

Разрабатывался путём создания десятков опытных образцов в течение почти 15 лет. Основой послужил разрабатываемый в 1972—1977 годах и подготовленный к серийному производству с 1979 года, но так и не запущенный в производство автобус ПАЗ-3203^[2]. Первая опытная партия автобусов для испытаний была изготовлена в 1979 году, конвейерная сборка была начата в 1984 году^[3]. Окончательный вариант автобуса был утверждён в 1986 году. Массовый выпуск начался 1 декабря 1989 года, когда на конвейере полностью прекратили выпуск предыдущей модели ПАЗ-672М.

4 июня 2001 года на заводе отмечался выпуск 100-тысячного автобуса данной модели. В 2008 году проведена модернизация производства, что позволило проводить сертификацию для регулярного использования на загруженных маршрутах, значительно возрос ресурс службы кузова (с 5 до 10 лет), в салон устанавливаются более эффективный отопитель и более комфортные сиденья.^[4] В 2014 году было освоено производство рестайлинговой версии^[5].

Модификации

Модель представлена большим количеством модификаций:

• ПАЗ-3205 — исходный базовый автобус с одной автоматической дверью, карбюраторным двигателем ЗМЗ-5234.10 и пневмогидравлической тормозной системой. Выпускался с 1989 по 2001 год в различных модификациях:
  • ПАЗ-3205-10 — автобус, предназначенный для работе на сжатом газе, опытный экземпляр которого был выпущен в 1997 году. Газовые баллоны у этой машины спрятаны под специальным кожухом на крыше, установленном на месте третьего люка. Автобус так и остался опытным.
  • ПАЗ-3205-20 — грузо-пассажирский вариант автобуса ПАЗ-3205, выпускающийся в нескольких вариантах с разным объёмом грузового отсека, который расположен в задней части кузова. Количество посадочных мест — 16. Задняя аварийная дверь в таких автобусах отсутствует — её функции выполняет дверь грузового отсека в задней панели. Объём грузового отсека может варьировать от 5,3 до 15 м³.
  • ПАЗ-3205-30 — автобус для инвалидов, оборудованный гидроподъёмником и креплениями для колясок. Был разработан в 1998 году и изначально носил индекс ПАЗ-3208.
  • ПАЗ-3205-40 — самоходное шасси на базе узлов и агрегатов автобуса ПАЗ-3205. В 70-80-е годы XX века Советский Союз осуществлял значительные объёмы поставок самоходных шасси на базе автобуса ПАЗ-672 на Кубу, где заказчик монтировал на него свои кузова. В связи с прекращением выпуска 672-й модели планировалось продолжить поставки шасси уже на базе ПАЗ-3205. Однако изменение политической обстановки не дало этим планам осуществиться — на Кубу было отправлено лишь незначительное число шасси ПАЗ-3205-40 перед распадом СССР.
  • ПАЗ-3205-50 — вариант «люкс», разработанный в начале 1990-х годов. Первые опытные автобусы имели индекс ПАЗ-3205Т. От стандартных автобусов отличается установкой мягких нерегулируемых кресел в салоне на надстройке (подиуме), наличием багажных полок над сиденьями вдоль окон и багажного отсека объёмом около 2 м³ в задней части салона.
  • ПАЗ-3205-60 — северный вариант автобуса был разработан ещё в восьмидесятые годы XX века, а первый опытный образец, называвшийся тогда ПАЗ-320501, появился в 1984 году. От базовой модели он отличается улучшенной термоизоляцией, двойным остеклением, полностью отгороженной от салона кабиной водителя. Система отопления калориферная — от радиатора и 3 отопителей, подключенных к системе охлаждения двигателя.
  • ПАЗ-3205-70 — изначально этот индекс был присвоен дизельному автобусу ПАЗ-3205, который появился в 1995 году. Однако вскоре его поменяли на ПАЗ-3205-07, а под индексом ПАЗ-3205-70 ныне выпускается школьный автобус. От базовой модели он отличается четырьмя ступеньками, из которых нижняя — выдвижная, сиденьями с полумягкой высокой спинкой, ремнями безопасности на каждом сиденье, кнопкой сигнала водителю возле каждого места. Также автобус оборудован полками для ранцев школьников, предусмотрено место для двух инвалидных колясок в сложенном состоянии. По периметру кузова нанесена светоотражающая полоса, а на крыше установлен мегафон.
  • ПАЗ-3205-70^[6] РАП — вариант школьного автобуса с белорусскими комплектующими. КПП: ГАЗ мех., 4-ст (бензин) или СААЗ мех., 5-ст(дизель).^[7]
• ПАЗ-32051 — автобус с двумя автоматическими дверями для пригородных маршрутов (часто ставился на городские) и пневмогидравлической тормозной системой (расположение сидений в салоне у однодверных и двухдверных модификаций различается). Технически близок к исходной модели 3205. Выпускался с 1989 по 2001 год.
• ПАЗ-32052 — опытный с одной широкой автоматической дверью для городских маршрутов; в серию не пошёл.
• ПАЗ-32053 — автобус с одной автоматической дверью для пригородных маршрутов и пневматической тормозной системой с ABS, следующее поколение, сменившее ПАЗ-3205. Выпускался с 2001 по 2016 год в различных модификациях:
  • ПАЗ-32053 — базовый вариант с бензиновым карбюраторным двигателем ЗМЗ-5234.
  • ПАЗ-32053 РАП — вариант бензинового автобуса с белорусскими комплектующими. КПП: ГАЗ мех., 4-ст ^[8]
  • ПАЗ-32053-04 — вариант с дизельным двигателем ЯМЗ-5342.
  • ПАЗ-32053-05 — вариант с дизельным двигателем Cummins ISF 3.8.
  • ПАЗ-32053-07 — вариант с дизельным двигателем ММЗ 245.9.
  • ПАЗ-32053-07 РАП — вариант дизельного автобуса с белорусскими комплектующими. КПП: СААЗ мех., 5-ст ^[9]
  • ПАЗ-32053-08 — вариант с карбюраторным двигателем ЗМЗ 52342.10, отвечающим экологическим нормам Евро-4
  • ПАЗ-32053-20 — грузо-пассажирский автобус для перевозки строительных бригад и оборудования.
  • ПАЗ-32053-27 — грузо-пассажирский с дизельным двигателем ММЗ 245.7.
  • ПАЗ-32053-50П — автобус с одной автоматической дверью для пригородных маршрутов с улучшенным салоном.
  • ПАЗ-32053-57 — пригородный с дизельным двигателем ММЗ 245.7.
  • ПАЗ-32053-60 — автобус в северном исполнении.
  • ПАЗ-32053-67 — северный с дизельным двигателем ММЗ 245.7.
  • ПАЗ-32053-70 — школьный автобус.
  • ПАЗ-32053-77 — школьный с дизельным двигателем ММЗ 245.7.
  • ПАЗ-320538-70 — школьный в северном исполнении.
  • ПАЗ-32053-80 — ритуальный автобус.
• ПАЗ-32054 — автобус с двумя автоматическими дверями для городских маршрутов с пневматической тормозной системой с АБС. Является заменой ПАЗ-32051. Технически схож с 32053. Выпускался также с 2001 по 2016 год.
  • ПАЗ-32054 — базовый вариант с бензиновым карбюраторным двигателем ЗМЗ-5234.
  • ПАЗ-32054-03 — вариант с дизельным двигателем Cummins B 3.9 140 CIV-1.
  • ПАЗ-32054-04 — вариант с дизельным двигателем ЯМЗ-5342.
  • ПАЗ-32054-05 — вариант с дизельным двигателем Cummins ISF 3.8.
  • ПАЗ-32054-07 — вариант с дизельным двигателем ММЗ 245.9.
  • ПАЗ-32054-08 — вариант с карбюраторным двигателем ЗМЗ 52342.10, отвечающим экологическим нормам Евро-4
• ПАЗ-320530 — автобусов с одной автоматической дверью для пригородных маршрутов, пришедший на замену моделям 32053, отвечающий экологическим нормам Евро-5, выпускается с 2017 года.
• ПАЗ-320540 — автобус с двумя автоматическими дверями для городских маршрутов, пришедший на замену моделям 32054, технически схож с 320530, отвечает экологическим нормам Евро-5, выпускается с 2017 года.
• ПАЗ-320570 — школьный автобус, отвечающий экологическим нормам Евро-5, пришедший с 2017 года на замену устаревшим модификациям.
  • ПАЗ-320570-02 — вариант с инжекторным бензиновым двигателем ЗМЗ-5245.
  • ПАЗ-320570-04 — вариант с дизельным двигателем ЯМЗ-534.
• ПАЗ-3798 — изотермический фургон.
• ПАЗ-3975 — передвижная лаборатория для комплексного обследования спортсменов на местах проведения соревнований. Модель была разработана по заказу Госкомспорта СССР в 1987 году.
• ПАЗ-3206 — полноприводная модификация. Предназначен для работы в удаленной местности через труднопроходимые районы.

Технические характеристики

Технические характеристики
Кузов	Несущий, вагонной компоновки
Колёсная формула	4 × 2
Общее число мест	41
Число мест для сидения	25
Максимальная скорость, км/ч	90
Контрольный расход топлива при 60 км/ч, л/100 км	19
Ёмкость топливного бака, л	105
Тормозная система	пневматическая, двухконтурная с ABS
Длина, мм	7000
Ширина, мм	2530
Высота, мм	2880
База, мм	3600
Полная масса, кг	7610
Комплектуется двигателями	ЗМЗ-5234. 10, ЯМЗ 534, ММЗ 245.7
Вентиляция	3 люка в крыше, форточки на боковых окнах
Рулевой механизм	МАЗ-64229 с гидроусилителем руля

Литература

• Автобус ПАЗ-672. Техописание, эксплуатация и ТО — 1984. — 353 стр.
• Автобус ПАЗ-3205-07 (дв. Д-245). экспл. и обслуживание — 1999. — 146 стр.
• Автобус ПАЗ-3205. Техописание и эксплуатация — 1998. — 245 стр.
• Автобус ПАЗ-3205. Технология техобслуживания — 1996. — 54 стр.
• Автобус ПАЗ-32053-07. Эксплуатация и ремонт — 2000. — 320 стр.

В игровой и сувенирной индустрии

В апреле 2013 года производитель SSM (Start Scale Models) предложил масштабные (1/43) модели автобуса ПАЗ-3205 бело-голубого цвета и ПАЗ-32051 бело-оранжевого цвета. Также модель ПАЗ-32051 в масштабе 1:48 была выпущена китайской фирмой «Технопарк». Фирма «Автотайм» подготовила к выпуску модель ПАЗ-32053.

Галерея

Память

• В ноябре 2013 года в Подольске был установлен памятник автобусу ПАЗ-3205^[10]

Примечания

Ссылки

3205 — это… Что такое ПАЗ-3205?

ПАЗ-3205
Завод-изготовитель	ПАЗ Павловский автобус
Выпускался, гг	1989—настоящее время
Экземпляры:	более 100 000
Полная масса, т	8,060—8,185
Макс. скорость, км/ч	80—90
Класс автобуса	высокопольный малый
Вместимость, чел.
Мест для сидения	21—25
Номинальная вместимость (5 чел/м²)	36
Габариты
Длина, мм	6 925
Ширина, мм	2 500
Высота по крыше, мм	2 960
База, мм	3 600
Просвет, мм	264
Салон
Количество дверей для пассажиров	1 2
Формула дверей	2 2+1 2+2
Двигатель
Модель двигателя	ЗМЗ-672. 11
Система питания	карбюратор
Тип топлива	бензин
Количество цилиндров	8
Расположение цилиндров	V-образное
Мощность, л.с.	120
Объём, см3	4250
Расход топлива при 60 км/ч, л/100 км	18—20,5
Трансмиссия
Тип коробки передач	механическая
Количество передач	4
ПАЗ-3205 на Викискладе

ПАЗ 3205. Вид сбоку

ПАЗ-3205 — советский и российский высокопольный автобус малого класса производства завода «Павловский автобус», является базовой моделью завода.

История

Разрабатывался путём создания десятков опытных образцов в течение почти 15 лет. Первая опытная партия автобусов для испытаний была изготовлена в 1979 году, конвейерная сборка была начата в 1984 году. Окончательный вариант автобуса был утверждён в 1986 году. Серийный выпуск начался 1 декабря 1989 года, когда на конвейере полностью прекратили выпуск предыдущей модели ПАЗ-672М. 4 июня 2001 года на заводе отмечался выпуск 100-тысячного автобуса данной модели. В 2008 году проведена модернизация производства, что позволило проводить сертификацию для регулярного использования на загруженных маршрутах, значительно возрос ресурс службы кузова (с 5 до 10 лет), в салон устанавливаются более эффективный отопитель и более комфортные сиденья.^[1]

Модификации

Выпускается в большом количестве модификаций, основными из которых являются:

• ПАЗ-32053 — автобус с одной автоматической дверью для пригородных маршрутов
• ПАЗ-32053-50П — автобус с одной автоматической дверью для пригородных маршрутов с улучшенным салоном
• ПАЗ-32054 — автобус с двумя автоматическими дверями для городских маршрутов с карбюраторным двигателем ЗМЗ-5234. 10
• ПАЗ-32054-03 — автобус с двумя автоматическими дверями для городских маршрутов с дизельным двигателем Cummins B 3.9 140 CIV-1
• ПАЗ-32054-07 — автобус с двумя автоматическими дверями для городских маршрутов с дизельным двигателем ММЗ 245.7
• ПАЗ-32053-20 — грузопассажирский автобус для перевозки строительных бригад и оборудования
• ПАЗ-32053-80 — ритуальный автобус
• ПАЗ-32053-70 — школьный автобус

Технические характеристики

Технические характеристики
Кузов	Несущий, вагонной компоновки
Колёсная формула	4×2
Общее число мест	36
Число мест для сидения	21-25
Максимальная скорость, км/ч	80-90
Контрольный расход топлива при 60 км/ч, л/100 км	18-20,5
Ёмкость топливного бака, л	105
Тормозная система	пневматическая, двухконтурная с ABS
Длина, мм	6 925
Ширина, мм	2 500
Высота, мм	2 960
База, мм	3 600
Полная масса, кг	8 060 — 8 185
Комплектуется двигателями	ЗМЗ-5234.10, Cummins B 3.9 140 CIV-1, ММЗ 245.7
Вентиляция	3 люка в крыше, форточки на боковых окнах
Рулевой механизм	МАЗ-64229 с гидроусилителем руля

Литература

• Автобус ПАЗ-672 тех. описание, эксплуатация и Т. О. 353с. 1984
• Автобус ПАЗ-3205-07 (дв. Д-245) экспл. и обслуживание 146с. 1999
• Автобус ПАЗ-3205 тех. описание и эксплуатация 245с. 1998
• Автобус ПАЗ-3205 технология тех. обслуживания 54с. 1996

Примечания

Avtobus Paz — bagno.

site

автобус паз 3205354 технические характеристики фото

паз 3206 википедия

паз 4234 дизельный автобус технические характеристики

паз 32053 паз 32053 07 паз 4234

паз 32054

паз 672 википедия

паз 32053 паз 32053 07 паз 4234

автобусы паз предложено выдворить с российских дорог Qutoru

новые автобусы паз вектор межгород яркамп

автобус паз 32053 модернизированная версия популярной модели

новый автобус паз 32054 от официального дилера в наличии

автобус паз 320302 08 вектор 71 купить в москве цены в

заз сила

павловский автобусный завод

я купил автобус паз 672 от кузницы тест драйва

автобус паз 32053 04 дизель описание и характеристики цена купить в массавто

автобус паз

обзор популярного советского автобуса паз 672

купить автобус паз в беларуси новый автобус паз по выгодной

городской автобус паз 4234 04 ямз

транспорт в россии автобус паз векторtransport In Russia Vector

автобус паз 4234 удлиненный 3050 мест

новый автобус паз 320402 14 на газу метан Cng яркамп

услуги автобус паз вахта перевозки пассажирские в

павловский автобусный завод

автобус паз фото и технические характеристики автобусов

автобусы паз характеристики описания технические данные

автобусы паз

цены на автобусы паз в украине снижены до 10 авто новости

автобус паз 320435 04 вектор Next для инвалидов продажа цена в ростове на дону автобусы от ооо компания сим авто гростов на дону грузовики

паз 4230 аврора википедия

первые автобусы паз нового поколения замечены на дорогах

автобус паз 3205

капитальный кузовной ремонт автобуса паз 3205 перечень

паз 4234 технические характеристики устройство и модели

чудо вездеходы ссср шестиколесный автобус паз 3201 который

автобус паз 32054

автобус паз 3205354 технические характеристики фото

автобус паз 32054 цена фото где купить орел Flagmaru 4391480

автобус паз 320402 05

автобус паз вектор в междугородном исполнении

отзывы о автобус паз 3205

автобус паз купить в волгоградской области на Avito

автобус паз 672 северная линия

Autoria фото автобуса Paz картинки и фотогалерея

изображение автобус паз 3205 уфа россия

автобус паз 32051 каропкару стендовые модели военная

паз автобус

богдан

громкий автобус паз в томске часть 2

школьный автобус паз 32053 70

автобус паз 32053 80 от официального дилера в поволжье

неактивно

автобус паз 32053 70 школьный купить в москве цены в

автобус паз 32053 модернизированная версия популярной модели

автобус паз 4234 описание и характеристики цена купить в массавто

запчасти паз каталог выгодные цены продажа запчастей

обзор автобуса паз 3205 автоновости

автобус паз 32053 2007 в москве 212308924

автобус паз 320435 04 вектор некст доступная среда

автобус паз 32054

автобусы паз продажа цена купить новый автобус паз в

паз 32053 паз 32053 07 паз 4234

создать мем автобус паз автобус паз автобус паз паз

Unimax самый таинственный автобус завода паз машина

автобус паз 3205354 технические характеристики фото

купить паз 320402 автобусы в москве от компании зао мро техинком 35014598

паз пассажирский автобус 33025 бесплатная векторная

школьный автобус паз 32053 70 паз 32053 70 2019

паз 4234 характеристики и цена фотографии и обзор

на трассе в почепском районе сгорел автобус паз брянские

автобус паз 32053 описание и характеристики цена купить в массавто

автобус паз 4230 02 05 аврора

автобус паз 320402 04 вектор 75 25 мест купить в москве

коллекционная масштабная модель 143 автобус паз 672м санитарный советский автобус

автобус паз 4234 цена фото где купить червень Flagmaby 2003333

автобус паз 652 и его модификации авто ссср

фото первый автобус паз павлово россия турпром

автобус паз 672 1154 19691989 паз672 Bus Paz

автобус паз 4234 2012 г в обмен

файлшкольный автобус паз 3206 приморский край село

автобус паз 32054

автобусы паз купить автобус паз бу объявления на Olxkz

продается автобус паз 3205 паз 3205 2001 автобусы в

автобус паз 320530 22

паз 320412 технические характеристики устройство автобуса

автобус паз 32053 обзор автомобилей

продаю паз 672 на Rst автобус паз 672 после реставрации

автобус паз на заказ25 45 мест воронеж объявление 163321

городской автобус паз вектор некст в аренду

новый авто Paz 32053 2019 в автосалоне алматы

автобус паз очередное то 2 пробег 126ткм Community

автобус паз 4234 2013г 30 местный Buspoint

автобус паз 4234 технические характеристики 4234 04 05

автобус паз 32053 паз 32053 2016 автобусы в самаре

автобус паз 320435 04 вектор Next доступная среда

на украинский рынок вернулся автобус паз 32054

власти нижегородской области подарят автобус паз лучшему

автобус паз 32053 2006 гв купить на торгах по банкротству

автобус паз 3205 2012 г в

история создания, модификации, основные сведения, базовые и технические характеристики, параметры двигателя и шасси, особенности и преимущества

Автобус ПАЗ-3205. Фото Википедия

ПАЗ-3205 — советский и российский высокопольный автобус малого класса производства завода «Павловский автобус», является базовой и классической моделью завода с 1989 года, отличается большим количеством модификаций, некоторые выпускаются и в настоящее время.

История создания

Разрабатывался путём создания десятков опытных образцов в течение почти 15 лет. Основой послужил разрабатываемый в 1972—1977 годах и подготовленный к серийному производству с 1979 года, но так и не запущенный в производство автобус ПАЗ-3203. Первая опытная партия автобусов для испытаний была изготовлена в 1979 году, конвейерная сборка была начата в 1984 году. Окончательный вариант автобуса был утверждён в 1986 году.

Массовый выпуск начался 1 декабря 1989 года, когда на конвейере полностью прекратили выпуск предыдущей модели ПАЗ-672М. 4 июня 2001 года на заводе отмечался выпуск 100-тысячного автобуса данной модели. В 2008 году проведена модернизация производства, что позволило проводить сертификацию для регулярного использования на загруженных маршрутах, значительно возрос ресурс службы кузова (с 5 до 10 лет), в салон устанавливаются более эффективный отопитель и более комфортные сиденья. В 2014 году было освоено производство рестайлинговой версии.

Автобус ПАЗ-3205 в северном исполнении. Фото Википедия

Выпуск исходных модификаций ПАЗ-3205 и ПАЗ-32051 прекращён с 2003 года. С 2001 года начат запуск обновлённых модификаций ПАЗ-32053 и ПАЗ-32054. Важным отличием является установка пневматической тормозной системы взамен гидравлической. В 2014 года для модификаций автобуса ПАЗ-32053, ПАЗ-32054, ПАЗ-4234 появился рестайлинг.

С вступлением в силу экологических требований Евро-5 и освоением производства заволжским моторным заводом инжекторных двигателей ЗМЗ-5245 с 2017 года начат выпуск модификаций ПАЗ-320530 и ПАЗ-320540. На этих модификациях начала осуществляться заводская установка газобаллонного оборудования для работы на сжиженном нефтяном газе или компримированном природном газе.

Модификации

Модель представлена большим количеством модификаций:

Пригородный автобус ПАЗ-32053/54. Фото ГАЗ

ПАЗ-3205 — исходный базовый автобус с одной автоматической дверью, разными типами двигателей и пневмогидравлической тормозной системой. Выпускался с 1989 по 2003 год в различных модификациях:

• ПАЗ-3205-10 — автобус, предназначенный для работе на сжатом газе, опытный экземпляр которого был выпущен в 1997 году. Газовые баллоны у этой машины спрятаны под специальным кожухом на крыше, установленном на месте третьего люка. Автобус так и остался опытным.
• ПАЗ-3205-20 — грузопассажирский вариант автобуса ПАЗ-3205, выпускающийся в нескольких вариантах с разным объёмом грузового отсека, который расположен в задней части кузова. Количество посадочных мест — 16. Задняя аварийная дверь в таких автобусах отсутствует — её функции выполняет дверь грузового отсека в задней панели. Объём грузового отсека может варьировать от 5,3 до 15 м³.
• ПАЗ-3205-30 — автобус для инвалидов, оборудованный гидроподъёмником и креплениями для колясок. Был разработан в 1998 году и изначально носил индекс ПАЗ-3208.
• ПАЗ-3205-40 — самоходное шасси на базе узлов и агрегатов автобуса ПАЗ-3205. В 70-80-е годы XX века Советский Союз осуществлял значительные объёмы поставок самоходных шасси на базе автобуса ПАЗ-672 на Кубу, где заказчик монтировал на него свои кузова. В связи с прекращением выпуска 672-й модели планировалось продолжить поставки шасси уже на базе ПАЗ-3205. Однако изменение политической обстановки не дало этим планам осуществиться — на Кубу было отправлено лишь незначительное число шасси ПАЗ-3205-40 перед распадом СССР.
• ПАЗ-3205-50 — вариант «люкс», разработанный в начале 1990-х годов. Первые опытные автобусы имели индекс ПАЗ-3205Т. От стандартных автобусов отличается установкой мягких нерегулируемых кресел в салоне на надстройке (подиуме), наличием багажных полок над сиденьями вдоль окон и багажного отсека объёмом около 2 м³ в задней части салона.
• ПАЗ-3205-60 — северный вариант автобуса был разработан ещё в восьмидесятые годы XX века, а первый опытный образец, называвшийся тогда ПАЗ-320501, появился в 1984 году. От базовой модели он отличается улучшенной термоизоляцией, двойным остеклением, полностью отгороженной от салона кабиной водителя. Система отопления калориферная — от радиатора и 3 отопителей, подключенных к системе охлаждения двигателя.
• ПАЗ-3205-70 — изначально этот индекс был присвоен дизельному автобусу ПАЗ-3205, который появился в 1995 году. Однако вскоре его поменяли на ПАЗ-3205-07, а под индексом ПАЗ-3205-70 ныне выпускается школьный автобус. От базовой модели он отличается четырьмя ступеньками, из которых нижняя — выдвижная, сиденьями с полумягкой высокой спинкой, ремнями безопасности на каждом сиденье, кнопкой сигнала водителю возле каждого места. Также автобус оборудован полками для ранцев школьников, предусмотрено место для двух инвалидных колясок в сложенном состоянии. По периметру кузова нанесена светоотражающая полоса, а на крыше установлен мегафон.
• ПАЗ-3205-70 РАП – вариант школьного автобуса с белорусскими комплектующими. КПП: ГАЗ мех., 4-ст (бензин) или СААЗ мех., 5-ст. (дизель).

Грузопассажирский автобус ПАЗ-32053-20. Фото Мега-Сервис-НН

ПАЗ-32051 — автобус с двумя автоматическими дверями для пригородных маршрутов (часто ставился на городские) и пневмогидравлической тормозной системой (расположение сидений в салоне у однодверных и двухдверных модификаций различается). Технически близок к исходной модели 3205. Выпускался с 1989 по 2003 год.

ПАЗ-32052 — опытный с одной широкой автоматической дверью для городских маршрутов; в серию не пошёл.

ПАЗ-32053 — автобус с одной автоматической дверью для пригородных маршрутов и пневматической тормозной системой с ABS, следующее поколение, сменившее ПАЗ-3205. Выпускался с 2001 по 2016 год в различных модификациях:

• ПАЗ-32053 — базовый вариант с бензиновым карбюраторным двигателем ЗМЗ-5234.
• ПАЗ-32053 РАП — вариант бензинового автобуса с белорусскими комплектующими. КПП: ГАЗ мех., 4-ст.
• ПАЗ-32053-04 — вариант с дизельным двигателем ЯМЗ-5342.
• ПАЗ-32053-05 — вариант с дизельным двигателем Cummins ISF 3.8.
• ПАЗ-32053-07 — вариант с дизельным двигателем ММЗ 245.9.
• ПАЗ-32053-07 РАП — вариант дизельного автобуса с белорусскими комплектующими. КПП: СААЗ мех., 5-ст.
• ПАЗ-32053-08 — вариант с карбюраторным двигателем ЗМЗ 52342.10, отвечающим экологическим нормам Евро-4
• ПАЗ-32053-20 — грузопассажирский автобус для перевозки строительных бригад и оборудования.
• ПАЗ-32053-27 — грузопассажирский с дизельным двигателем ММЗ 245.7.
• ПАЗ-32053-50П — автобус с одной автоматической дверью для пригородных маршрутов с улучшенным салоном.
• ПАЗ-32053-57 — пригородный с дизельным двигателем ММЗ 245.7.
• ПАЗ-32053-60 — автобус в северном исполнении.
• ПАЗ-32053-67 — северный с дизельным двигателем ММЗ 245.7.
• ПАЗ-32053-70 — школьный автобус.
• ПАЗ-32053-77 — школьный с дизельным двигателем ММЗ 245.7.
• ПАЗ-320538-70 — школьный в северном исполнении.
• ПАЗ-32053-80 — ритуальный автобус.

Школьный автобус ПАЗ-32053-70. Фото ГАЗ

ПАЗ-32054 — автобус с двумя автоматическими дверями для городских маршрутов с пневматической тормозной системой с АБС. Является заменой ПАЗ-32051. Технически схож с 32053. Выпускался также с 2001 по 2016 год.

• ПАЗ-32054 — базовый вариант с бензиновым карбюраторным двигателем ЗМЗ-5234.
• ПАЗ-32054-03 — вариант с дизельным двигателем Cummins B 3.9 140 CIV-1.
• ПАЗ-32054-04 — вариант с дизельным двигателем ЯМЗ-5342.
• ПАЗ-32054-05 — вариант с дизельным двигателем Cummins ISF 3.8.
• ПАЗ-32054-07 — вариант с дизельным двигателем ММЗ 245.9.
• ПАЗ-32054-08 — вариант с карбюраторным двигателем ЗМЗ 52342.10, отвечающим экологическим нормам Евро-4

ПАЗ-320530 — автобус с одной автоматической дверью для пригородных маршрутов, соответствующий экологическим нормам Евро-5, выпускается с 2017 года взамен устаревших модификаций.

• ПАЗ-320530-02 — вариант с инжекторным бензиновым двигателем ЗМЗ-5245.
• ПАЗ-320530-04 — вариант с дизельным двигателем ЯМЗ-5344.
• ПАЗ-320530-12 — вариант с инжекторным двигателем ЗМЗ-5245 с установленным ГБО для работы на компримированныом природном газе (CNG).
• ПАЗ-320530-22 — вариант с инжекторным двигателем ЗМЗ-5245 с установленным ГБО для работы на сжиженном нефтяном газе (LPG).

ПАЗ-320540 — автобус с двумя автоматическими дверями для городских маршрутов, технически схожий с 320530, соответствующий экологическим нормам Евро-5, выпускается с 2017 года взамен устаревших модификаций.

• ПАЗ-320540-02 — вариант с инжекторным бензиновым двигателем ЗМЗ-5245.
• ПАЗ-320540-04 — вариант с дизельным двигателем ЯМЗ-5344.
• ПАЗ-320540-12 — вариант с инжекторным двигателем ЗМЗ-5245 с установленным ГБО для работы на компримированныом природном газе (CNG).
• ПАЗ-320540-22 — вариант с инжекторным двигателем ЗМЗ-5245 с установленным ГБО для работы на сжиженном нефтяном газе (LPG).

Автобусы ПАЗ-3206. Фото ЯрКамп

ПАЗ-320570 — школьный автобус, отвечающий экологическим нормам Евро-5, выпускается с 2017 года взамен устаревших модификаций.

• ПАЗ-320570-02 — вариант с инжекторным бензиновым двигателем ЗМЗ-5245.
• ПАЗ-320570-04 — вариант с дизельным двигателем ЯМЗ-5344.

ПАЗ-3798 — изотермический фургон.

ПАЗ-3975 — передвижная лаборатория для комплексного обследования спортсменов на местах проведения соревнований. Модель была разработана по заказу Госкомспорта СССР в 1987 году.

ПАЗ-3206 — полноприводная модификация. Предназначен для работы в удаленной местности через труднопроходимые районы.

Основные сведения, характеристики

1. Производитель/изготовитель, где выпускается/производится техника. «Павловский автобус» — советский и российский производитель автобусов малого и среднего классов. Расположен в городе Павлово Нижегородской области. Входит в группу ГАЗ. Производство автобусов с 2005 года осуществляет ООО «ПАЗ» — 100%-я дочка ПАО «Павловский автобус»
2. Назначение. Автобус сельского сообщения.
3. Класс. Малый.
4. Тип кузова. Несущий, вагонной компоновки.
5. Ресурс кузова. 5/10 лет.

Базовые характеристики

• Габариты кузова, мм. Длина / Ширина / Высота. 7000 / 2500 /2900.
• Высота потолка в салоне, мм. 3600.
• Количество дверей. Автоматическая дверь для пассажиров + дверь, открываемая вручную, для водителя + аварийный выход.
• Общее количество мест, в том числе посадочных. Максимально 50, в том числе посадочных 21-28.
• Тип сидений. Мягкие одно- и двухместные.

Технические характеристики

Автобус ПАЗ-3205. Фото Википедия

Тип топлива. Бензин или дизель.

Емкость топливного бака, л. 105.

Снаряженная и технически допустимая масса, кг. 4720 и 8060.

Минимальный радиус разворота, м. 8,5.

Рулевой механизм. МАЗ-64229 с гидроусилителем руля.

Тормозная система. Рабочая тормозная система — двухконтурная, с пневмогидравлическим приводом, барабанными механизмами (диаметр 380 мм, ширина накладок 100 мм), разжим — кулачковый. Стояночный тормоз — трансмиссионный — барабанный, привод — механический. Запасной тормоз — один из контуров рабочей тормозной системы. Давление в пневмоприводе тормозов 5,2-5,5 кгс/см . Имеется предохранитель против замерзания конденсата.

Характеристики шасси

Колесная формула. 4х2.

Колесная база, мм. 3600.

Клиренс/дорожный просвет, мм. 264.

Тип сцепления. Однодисковое, сухое.

Шины. 8,25R20.

Антиблокировочная система тормозов (ABS). Отсутствует.

Дополнительные характеристики

Вентиляция. Естественная, три люка в крыше, форточки на боковых окнах.

Система отопления. Воздушная, использующая тепло системы охлаждения двигателя.

Характеристики двигателя/силового агрегата

Параметры	ЗМЗ-672-11	ЗМЗ-5234	ЗМЗ-5245.10	ММЗ Д-245.7
Тип	Бензиновый двигатель	Бензиновый двигатель	Бензиновый двигатель	Дизельный двигатель
Количество и расположение цилиндров	8V	8V	8V	4R
Нормы экологической безопасности	–	Евро-0-4	Евро-4-5	Евро-1-5
Рабочий объем, куб.см.	4250	4670	4670	4750
Мощность двигателя, л.с.	120 при 3200-3400 об/мин	130 при 3200 об/мин.	134 (98,7 кВт ), при 3600 об/мин	129 при 2400 об/мин
Макс. крутящий момент, Н/м	284,5 при 2000-2500 об/мин	314 при 2000 об/мин	308при 2600 об/мин	455 при 1600 об/мин
Контрольный расход топлива при 60 км/ч, л/100 км.	20,5	32	32	25
Максимальная скорость, км/ч	80	90	90	90

Особенности/преимущества

Недостаточная комфортабельность этих автобусов компенсируется рядом плюсов, благодаря которым детище Павловского автобусного завода широко используется на дорогах России в течение нескольких десятилетий:

• Широкий модельный ряд, позволяющий выбрать модификацию, которая оптимально соответствует планируемому назначению, загрузке, маршрутам, особенностям климата.
• Возможность заказать индивидуальную комплектацию автомобиля, предназначенного для оказания аварийной помощи, лабораторных услуг, обслуживания различных групп населения.
• Простота и удобство конструкции, возможность использования в сложных дорожных условиях.
• Возможность осуществления ремонта силами водителя. В то время как современные автобусы импортного производства, укомплектованные электронными блоками и другими технически передовыми приспособлениями, можно отремонтировать только в условиях специализированных сервисов.
• Высокая надежность, благодаря которой эта машина эффективно эксплуатируется на городских, поселковых, сельских дорогах, для обслуживания промышленных и сельскохозяйственных предприятий.

Где купить

Купить ПАЗ-3205 возможно только на вторичном рынке. Во всемирной сети присутствует большое количество объявлений о продаже б/у транспорта. Если посетителей сайта интересует покупка новых моделей, то следует обратить на те модификации, которые продолжают выпускаться. С перечнем компаний, предлагающих ПАЗики, возможно ознакомиться в отдельном разделе нашего сайта. Кроме этого, предприятия предоставляют услуги аренды и лизинга транспортных средств, а также их переоборудования и ремонта.

Рубрики: Автобусы малого класса, Бескапотные автобусы, Высокопольные автобусы, Одиночные автобусы, ПАЗ

ПАЗ-672 | ru-memorials | Яндекс Дзен

Автобус ПАЗ-672М установлен на постаменте в городе Гуково на улице Магистральная у местного Пассажирского автотранспортного предприятия (ПАТП).

Историю этого экземпляра и дату установки я не нашёл.
ПАТП основано в 1954 году.
Автобусы этой модификации (ПАЗ-672М) производились с 1982 по 1989 годы.
В 2011 году этот памятник уже существовал, был потрёпанным, но относительно целым.
Предположу, что появился он в первом десятилетии XXI-го века, а скорее всего в 2004 или 2009 годах (к юбилею ПАТП).

ПАЗ-672 начал проектироваться в 1957 году.

Он должен был заменить устаревшую предыдущую модель ПАЗ-652, сделанную на базе ГАЗ-51 и являвшуюся вагонным вариантом капотного автобуса ГЗА-651.

ГЗА-651. Фото: Pjotr Mahhonin, WikipediaПАЗ-652. Фото: FORTEPAN / Nagy Gyula, Wikipedia

Новая модель использовала шасси грузовика следующего поколения — ГАЗ-53.

Номинальная вместимость ПАЗ-672 определялась в 45 человек (23 сидя), но в часы пик легко могла быть превышена, чуть не в два раза — «всем надо ехать» 🙂

По разным причинам, в основном организационного толка, запуск в производство ПАЗ-672 произошёл только через 10 лет в 1967 году.

Последний ПАЗ-672М покинул ворота завода в 1989 году, сменившись на конвейере Павловского Автобусного Завода «квадратным» ПАЗ-3205.

ПАЗ-32053. Фото: Ilya Plekhanov, Wikipedia.

Всего было выпущено 288688 автобусов, шасси и фургонов на его базе.

При помощи этих автобусов были связаны между собой множество городов, райцентров, сёл, деревень и аулов на огромной территории Советского Союза.

Для многих жителей страны ПАЗик ассоциировался с поездкой «в центр», «на базар» или к родственникам в соседнее село.

В процессе производства в конструкцию регулярно вносились изменения, поэтому явно выделить поколение или чётко назвать принадлежность машин к определённой модификации без документов или таблички — сложно.

Например, эта машина несёт общие признаки модификации ПАЗ-672М, в части блока габаритных фонарей и поворотников, объединённых вместе.

В то же самое время у неё два топливных бака, которые, по найденной мной информации, устанавливались на «горную» и «тропическую экспортную» версии ПАЗ-672Г и ПАЗ-672Ю, соответственно.
Основной бак на 105 литров устанавливался слева и он есть на всех автобусах этого типа.
А запасной — справа.
И на большинстве автобусов его нет.

Однако, на модификациях «Г» и «Ю» отсутствовало остекление в скатах крыши.

Это забавные овальные окошки из затемнённого стекла, которые на этом экземпляре утрачены почти полностью.

Лючок дополнительного бензобака хорошо виден в середине центральной панели кузова.

Заодно можно заметить, что задней правой двери у этого автобуса нет.

Но её наличие/отсутствие не говорит о какой-то определённой модификации.

Такие варианты кузова встречались в общем потоке конвейера и относились к комплектации конкретной машины.

На месте задней правой двери размещали ещё два посадочных места.

Всего у ПАЗ-672 могло быть до четырёх дверей: водительская (слева), одна или две пассажирские (справа) и грузовая/эвакуационная (сзади).

В оригинале, задняя грузовая дверь появилась по требованию военных — для погрузки носилок с ранеными.

В связи с чем, пассажирский салон был легкоразборным и «милитаризация» автобуса выполнялась за половину дня при помощи пары человек с ключами, которые снимали/переставляли сиденья.

По этой же схеме, автотранспортными предприятиями или частными владельцами некоторые ПАЗики переоборудовались в «ритуальные», в таком случае сиденья ставились вдоль бортов, на полу перед грузовой дверью устанавливали специальную тележку на рельсовом ходу, которая использовалась для погрузки и выгрузки гроба.

На современных автобусах ПАЗ грузовая дверь никуда не делась, кстати.

ПАЗ-32053. Фото: Ilya Plekhanov, Wikipedia.

Когда-то в этом автобусе стоял карбюраторный, восьмицилиндровый, 115-сильный двигатель ЗМЗ-672, объёмом 4.25 литра.

Интересная особенность компоновки автобусов ПАЗ-672 — возможность обслуживания мотора не покидая салона.

В дождливую и снежную погоду неплохое преимущество над капотной компоновкой или заднемоторной.

Минусы оттуда же — при малейших проблемах (трещинах/неплотностях) с глушителем выхлопные газы шли в салон.

Ну и неизбывный запах бензина, который на стоянках испарялся в карбюраторе и через воздухозаборник двигателя попадал в подкапотное пространство, которое находится в салоне.

В детстве я много накатал на подобных автобусах, да и сейчас они ещё встречаются на дорогах б.СССР.

ПАЗ 5272 — подборка материалов, цен, ссылок, фотографий и видео | Автобусы

Категория: Автобусы

ПАЗ 5272 — подборка материалов, цен, ссылок, фотографий и видео про автомобиль

Сколько стоит ПАЗ 5272?

Средняя цена ПАЗ 5272 по России: цена временно отсутствует.**На основе анализа информации с сайта «Яндекс авто»

Фотографии автомобиля ПАЗ 5272:

Описание: ПАЗ 5272 Источник: http://interdalnoboy.com	Описание: Теги: ПАЗ 5272 Источник: http://www.omnibus.ru	Описание: Городской автобус ПАЗ-5272 Источник: http://kamaznsk.ru
Описание: ПАЗ 5272 (ПАЗ-КАМАЗ) Городской Источник: http://www.avtobusy.ru	Описание: ПАЗ-5269/ПАЗ-5271/ПАЗ-5272 Источник: http://denisovets.ru	Описание: Теги: ПАЗ 5297 Источник: http://www.omnibus.ru

Ссылки на материалы про автомобиль ПАЗ 5272:

ПАЗ 5272 — газета о пассажирском транспорте

ОАО «Павловский автобус» представил на общий суд городской автобус ПАЗ— 5272. Его кузов был разработан еще в 1998 году для шасси КамАЗ-5297, …

Ссылка: http://www.omnibus.ru/photos/paz/5272/ПАЗ-3237 — Википедия

Первый образец принципиально отличался от серийных, он был внешне унифицирован с автобусом большого класса ПАЗ—5272. Серийные ПАЗики …

Ссылка: http://ru.wikipedia.org/wiki/ПАЗ-3237ПАЗ—5272 сгорел на автовокзале г. Копейска — YouTube

20 фев 2011 … ПАЗ—5272 сгорел на автовокзале г. Копейска. Канал пользователя Antifactor. SubscribeSubscribedUnsubscribe 40 …

Ссылка: http://www.youtube.com/watch?v=ju9VXAKWEIUПавловский автобус — Википедия

Запрос «ПАЗ» перенаправляется сюда; см. также другие значения. … НефАЗ — производство больших автобусов ПАЗ—5272 и других большими сериями …

Ссылка: http://ru.wikipedia.org/wiki/Павловский_автобусПАЗ — 4230 — Группа ГАЗ

Свою историю ООО «Павловский автобусный завод» начинал как завод по … и междугородных автобусов большого и среднего класса ПАЗ – 5272 и ПАЗ …

Ссылка: http://gazgroup.ru/about/factories/autobus/paz/history/PAZ — каталог новых автомобилей ПАЗ: характеристики, цены …

Модельный ряд автомобилей PAZ: цены, модели, фото, видео ПАЗ. … НефАЗ, производство больших автобусов ПАЗ—5272 и других большими сериями …

Ссылка: http://avto-russia.ru/autos/paz/

Видео про автомобиль ПАЗ 5272:

ПАЗ-5272 сгорел на автовокзале г. Копейска

ПАЗ-5272 сгорел на автовокзале г. Копейска

Паз-3201_Лужба.Сентябрь 2010.

ГАЗелист заснул и влетел в ПАЗ-межгород. (новости)

Уфа 50лет СССР.СГОРЕЛ ПАЗ

Сегодня днем в районе остановки «Спортивная» сгорел пассажирский автобус «ПАЗ»

Автобус паз 32053 руководство по эксплуатации — ЫАНИНО-1

Павлово: ООО ПАЗ 2007. 103 с. Общие сведения. Особо важные предупреждения и правила техники . . . ТАРИФНО-КВАЛИФИКАЦИОННАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕЛЬДШЕРА-ЛАБОРАНТА . . . Элементов крови на всех . . . Образец благодарности сотруднику за работу

Указания по разборке, сборке, регулировке и ремонту узлов и систем автобусов с использованием готовых запасных частей и агрегатов приведены пооперационно и подробно иллюстрированы цветными фотографиями и рисунками.

Российская компания «Группа ГАЗ», которая входит в диверсифицированную промышленную группу «Базовый Элемент» — одну из. В этот праздник пожелания наши будут просты и понятны: желаем ровных дорог и низких цен.

• Павлово: ООО ПАЗ 2007. 103 с. Общие сведения. Особо важные предупреждения и правила техники . . .
• С 2006 года ПАЗ участвует в национальном проекте «Образование» производством специальных . . .
• Предлагаем вашему вниманию руководство по эксплуатации, техническому обслуживанию и . . .

Руководство по эксплуатации, т/о и ремонту Рецензии и отзывы на книгу Автобусы ПАЗ-3205, -32053−07 и их модификации. Руководство по эксплуатации, техническому обслуживанию и ремонту Где купить эту книгу? В обычном магазине или через Интернет? Заказывайте в «Лабиринте»! У нас Вы можете, а получить быстрее, чем где бы то ни было. ГАЗ» представила на 12-й Международной специализированной выставке «Коммерческий Автотранспорт’2013″ (Comtrans’2013) пять моделей автобусов. Дело в том, что эти прикладные пособия всегда прекрасно оформлены, легко читаются и усваиваются, по ним можно практиковаться даже начинающим водителям. Книга предназначена для водителей и инженерно-технических работников автотранспортных предприятий, центров и станций технического обслуживания. Междугородный автобус ГОЛАЗ-5251 „Вояж“ признан победителем в номинации „Автобус года“ тринадцатого ежегодного конкурса „Лучший коммерческий автомобиль года в России“, который проводится в рамках выставки Comtrans’2013. Указания по разборке, сборке, регулировке и ремонту узлов и систем автобусов с использованием готовых запасных частей и агрегатов приведены пооперационно и подробно Структурно все ремонтные работы разделены по системам и агрегатам, на которых они проводятся (начиная с двигателя и заканчивая кузовом). В настоящее время завод выпускает автобус ПАЗ-32053 и его модификации, новые модели ПАЗ-3204
и низкопольный городской автобус ПАЗ-3237, изделия кузовной арматуры и автозапчасти.

В мероприятии принимали участие директор ООО ТСЦ „Русский автобус“, представители Департамента образования и школ Смоленской области. Бортовые автомобили Газель незаменимы в работе предприятий занятых в сфере обслуживания, для коммунальных служб и небольших частных компаний. Москве следующих моделей автобусов ПАЗ: ПАЗ 3204, ПАЗ32054, ПАЗ 32054—07, автобус ПАЗ 32053, ПАЗ 32053—07, ПАЗ 32053—20, ПАЗ 32053—70, автобус ПАЗ32053—77, ПАЗ 32053—80, ПАЗ 3206, ПАЗ 3237, автобус ПАЗ Real, ПАЗ 4234, ПАЗ 4234—50П, автобус ПАЗ4234—70 автобус паз 32053 руководство по эксплуатации

Павлово: ООО ПАЗ 2007. 103 с. Общие сведения. Особо важные предупреждения и правила техники . . .

Павловский автобус википедия

В приложениях содержатся необходимые для эксплуатации, обслуживания и ремонта, горюче-смазочных материалах и эксплуатационных жидкостях, применяемых подшипниках качения, манжетах и лампах накаливания. Входящий в «Группу ГАЗ» Павловский автобусный завод анонсирует снижение цены на свою продукцию — автобусы автобус паз 32053 руководство по эксплуатации . Серия технических справочников «Ремонт без проблем» от солидного издательства «Третий Рим» — одна из наиболее востребованных всеми пользователями. Тягачи под маркой КАМАЗ получили широкое распространение в РФ и странах дальнего и ближнего зарубежья. Сегодня модельный ряд автомобилей КАМАЗ состоит из: самосвалов КАМАЗ, бортовых тягачей КАМАЗ, седельных тягачей КАМАЗ, а также специальной технике на базе автомобилей шасси КАМАЗ, а также автомобиль КАМАЗ 4308 — линейка среднетоннажных грузовиков, которые обладают низким расходом топлива и малой погрузочной высотой.

Вы руководитель предприятия и вам необходим корпоративный транспорт — Ваш вариант ПАЗ-32053. Российская компания «Группа ГАЗ», которая входит в диверсифицированную промышленную группу «Базовый Элемент» — одну из. ПАЗ-652 был модернизирован с присвоением ему модели ПАЗ-652Б и выпускался заводом до ноября 1968 г. ПАЗ-672М, ПАЗ-672С, ПАЗ-672Г, ПАЗ-672У, ПАЗ-672Ю, ПАЗ-3201,
ПАЗ-3201С и др. Предлагаем вашему вниманию руководство по эксплуатации, техническому обслуживанию и ремонту автобусов ПАЗ-3205, -32053−07 и их модификаций. Алексей Гордеев провел рабочую встречу с ВРИО руководителя департамента транспорта и автомобильных дорог Воронежской области. Подраздел автомобили ГАЗ представляет самые популярные моделиавтомобилей Горьковского завода: Газель, ГАЗ-3302, ГАЗ-33021, Соболь, ГАЗ-2217, Валдай, ГАЗ-33104, Волга, ГАЗ-31105, Баргузин, а также грузовые автомобили ГАЗ-3307, ГАЗ-3308, ГАЗ-3309 и спецтехнику. Указания по разборке, сборке, регулировке и ремонту узлов и систем автобусов с использованием готовых запасных частей и агрегатов приведены пооперационно и подробно Структурно все ремонтные работы разделены по системам и агрегатам, на которых они проводятся (начиная с двигателя и заканчивая кузовом).

Руководство по эксплуатации, т/о и ремонту» Аннотация к книге «Автобусы ПАЗ-3205, -32053−07 и их модификации. Цены на автобусы ПАЗ, ЛиАЗ, КАВЗ, ГолАЗ всегда можно уточнить у специалистов департамента по продаже автобусов ПАЗ

Автобус паз 32053 руководство по эксплуатации — Автобусы паз-3205 — 32053-07 и их модификации

С каталогом запасных частей Nissan Almera G11 с 2013 г автобус паз 32053 руководство по эксплуатации .  ЛИАЗ 52922, ЛиАЗ-5293, ЛИАЗ 6212, ЛИАЗ 62132, автобус ЛИАЗ 5256. Иллюстрированное руководство Toyota Corolla E160: Руководство по эксплуатации, техническому обслуживанию и ремонту Great Wall Hover НЗ. ГАЗ» представила на Международном автотранспортном фестивале в Коломне перспективные модели автобусов. Руководство по эксплуатации, техническому обслуживанию и ремонту Lada Kalina II. Вы руководитель предприятия и вам необходим корпоративный транспорт — Ваш вариант ПАЗ-32053: характеристика на кассира для награждения образец. Тягачи под маркой КАМАЗ получили широкое распространение в РФ и странах дальнего и ближнего зарубежья. В этот праздник пожелания наши будут просты и понятны: желаем ровных дорог и низких цен. Руководство по эксплуатации, техническому обслуживанию и ремонту Mitsubishi Pajero Sport c 2008 г. По этому номеру мы узнаем вас и расскажем о ваших скидках и персональных спецпредложениях! Откроется окно подтверждения авторизации,
после этого вас автоматически вернут в Лабиринт Введите Ваш логин в ЖЖ, и цена товаров пересчитается согласно величине Вашей скидки Введите e-mail или мобильный телефон, который Вы указывали при оформлении заказа. Автомобильные фургоны ГАЗель и Соболь предназначены для перевозок различных грузов с максимальным обеспечением их сохранности и комфортом водителя. Модернизация базовой модели и расширение модельного ряда, ведется
в соответствии с времени и потребительскими предпочтениями основных клиентов — транспортников. ГАЗ» перевела на Ликинский автобусный завод (ЛиАЗ) производство междугородных и туристических автобусов, которые ранее. С 1 декабря 1989 года завод полностью перешел на производство авто­бусов ПАЗ-3205. В отдельном разделе приведены технологические карты технического обслуживания автобусов с указанием используемых приборов, инструментов, приспособлений и материалов. Структурно все ремонтные работы разделены по системам и агрегатам, на которых они проводятся (начиная с двигателя и заканчивая кузовом). Российская компания «Группа ГАЗ», которая входит в диверсифицированную промышленную группу «Базовый Элемент» — одну из. Это относится и к мастерам сервисных автомобильных служб, желающих обогатить свои знания и умения новыми сведениями и решать даже сложные ремонтные задачи быстро и эффективно. Руководство по эксплуатации, техническому обслуживанию и ремонту Nissan X-Trail: Руководство по эксплуатации, техническому обслуживанию и ремонту Chevrolet Aveo с 2011 г.

 Олимпийские автобусы уже уехали из Сочи, отправившись на автобазы, расположенные в Подмосковье, Казани и Петербурге. ПАЗ-672М, ПАЗ-672С, ПАЗ-672Г, ПАЗ-672У, ПАЗ-672Ю, ПАЗ-3201,
ПАЗ-3201С и др.

В приложениях содержатся необходимые для эксплуатации, обслуживания и ремонта сведения о моментах затяжки резьбовых соединений, горюче-смазочных материалах и эксплуатационных жидкостях, применяемых подшипниках качения, манжетах и лампах накаливания

Rusbus ru — автобусы паз автобус паз 32053 руководство по эксплуатации

Автобус паз 32053 руководство по эксплуатации: Оценка: 81 / 100 Всего: 26 оценок.

Связанный с болезнью Альцгеймера белок β-амилоида ингибирует вирус гриппа А и модулирует взаимодействие вирусов с фагоцитами

Abstract

Накопление β-амилоида (βA) является ключевым патогенетическим фактором болезни Альцгеймера; однако нормальная функция βA неизвестна. Недавние исследования показали, что βA может подавлять рост бактерий и грибков. В этой статье мы показываем, что βA также ингибирует репликацию сезонных и пандемических штаммов вируса гриппа A (IAV) h4N2 и h2N1 in vitro.Фрагмент из 42 аминокислот βA (βA42) обладал большей активностью, чем фрагмент из 40 аминокислот. Прямая инкубация вируса с βA42 была необходима для достижения оптимального ингибирования. Использование количественных ПЦР-анализов было показано, что βA42 снижает захват вируса эпителиальными клетками через 45 минут и снижает вирусный супернатант через 24 часа после заражения. βA42 вызывал агрегацию частиц IAV, что было обнаружено с помощью тестов на пропускание света, электронной и конфокальной микроскопии. βA42 сам по себе не стимулировал продукцию нейтрофилов H ₂ O ₂ или образование внеклеточных ловушек, но он усиливал оба ответа, стимулированные IAV.Кроме того, βA42 увеличивает поглощение IAV нейтрофилами. βA42 снижает синтез вирусного белка в моноцитах и ​​снижает продукцию интерлейкина-6, индуцированную IAV, этими клетками. Таким образом, мы впервые демонстрируем, что βA обладает противовирусной активностью и модулирует вирусные взаимодействия с фагоцитами.

Образец цитирования: White MR, Kandel R, Tripathi S, Condon D, Qi L, Taubenberger J, et al. (2014) Связанный с болезнью Альцгеймера β-амилоидный белок ингибирует вирус гриппа А и модулирует вирусные взаимодействия с фагоцитами.PLoS ONE 9 (7): e101364. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101364

Редактор: Надес Паланияр, Больница для больных детей и Университет Торонто, Канада

Поступила: 7 февраля 2014 г .; Одобрена: 5 июня 2014 г .; Опубликован: 2 июля 2014 г.

Это статья в открытом доступе, свободная от всех авторских прав, и ее можно свободно воспроизводить, распространять, передавать, изменять, строить или иным образом использовать в любых законных целях.Работа сделана доступной по лицензии Creative Commons CC0 как общественное достояние.

Финансирование: Финансирование поступило от Национальных институтов здравоохранения № AI-83222 (KLH) и HL 069031 (KLH), а также от внутренних фондов NIH (JKT). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Кеван Хартсхорн в настоящее время является членом редакционного совета PLOS One. Это не влияет на соблюдение авторами редакционных правил и критериев PLOS ONE.

Введение

Накопление βA, как полагают, в значительной степени способствует патогенезу болезни Альцгеймера, хотя фактическая физиологическая функция и причина накопления βA в головном мозге неизвестны. βA представляет собой фрагмент более крупного белка-предшественника β-амилоида (APP), который представляет собой трансмембранный белок, который может расщепляться различными протеазами на различные фрагменты, включая внеклеточные и внутриклеточные фрагменты, а также фрагменты βA42 и βA40, которые частично состоят из внеклеточный и частично трансмембранный домен APP.βA40 более распространен, чем βA42, но βA42 является более амилоидогенным видом [1] — [3]. Было показано, что βA вызывает нейротоксичность, и клинические испытания были сосредоточены на снижении его концентрации для лечения болезни Альцгеймера. Структура βA напоминает структуру антимикробных пептидов, таких как протегрин, и, как и протегрин, он может образовывать мембранные каналы [4]. Важно отметить, что недавние исследования продемонстрировали антибактериальную и противогрибковую активность пептидов βA [5], [6]. Имеются данные о том, что эта антибактериальная и противогрибковая активность опосредована способностью пептидов βA образовывать поры мембран.Это означает, что βA может играть роль во врожденной защите от инфекции.

Накопление

βA в головном мозге было продемонстрировано при деменции, связанной с ВИЧ, и недавние открытия предполагают, что это является результатом индуцированного ВИЧ нарушения протеолиза βA [7]. Энцефалит, вызванный вирусом простого герпеса (HSV), связан с накоплением βA в пораженных участках головного мозга, а инфицирование HSV клеточных культур in vitro приводит к накоплению βA [8]. Интересно, что лечение противовирусными препаратами уменьшало накопление βA в культурах клеток, инфицированных вирусом простого герпеса.Эти данные свидетельствуют о том, что вирусы, поражающие мозг, могут быть триггерами для накопления βA. Триггеры производства βA и полное понимание того, какие клетки продуцируют βA in vivo, не ясны. βA был обнаружен в плазме, спинномозговой жидкости и культуральной среде смешанных культур клеток головного мозга в раннем исследовании [9]. Если βA действительно функционирует как врожденный защитный белок, можно ожидать, что он будет вырабатываться во время инфекционных или воспалительных состояний (как предполагают данные о HSV).

Противомикробные пептиды также часто действуют как «аллармины», запуская набор и активацию иммунных клеток [10].Пептиды βA также обладают провоспалительным действием, вызывая активацию глиальных клеток и макрофагов, и считается, что это связано с повреждением нейронов [11]. Было обнаружено, что активация глиальных клеток βA опосредуется TLR2 [12]. Эти фагоцитарные клетки могут также играть роль в клиренсе пептидов βA посредством фагоцитоза и ферментативной деградации белка.

В этой статье мы используем вирус гриппа A (IAV) в качестве модельной системы для тестирования противовирусных эффектов пептидов βA. Мы также изучаем, как пептиды изменяют взаимодействия IAV с нейтрофилами и моноцитами.Мы демонстрируем, что пептиды βA обладают противовирусным и иммуномодулирующим действием, аналогичным другим антимикробным пептидам (например, дефенсинам). Эти исследования должны открыть путь для дополнительных исследований воздействия пептидов βA на другие вирусы и фагоциты.

Материалы и методы

Заявление об этике

Забор крови для выделения нейтрофилов и моноцитов был проведен с информированного согласия, одобренного Институтом наблюдательного совета Медицинской школы Бостонского университета.Экспертный совет учреждения специально одобрил это исследование, а также утвердил форму согласия на исследование. Доноры крови были здоровыми добровольцами, и все они подписывали письменное согласие перед каждой сдачей крови.

Препараты для вирусов

Филиппины штамм 82 / h4N2 (Phil82) был любезно предоставлен доктором Э. Марго Андерс (Мельбурнский университет, Мельбурн, Австралия) и выращен в хориоаллантоисной жидкости десятидневных куриных яиц и очищен на прерывистом градиенте сахарозы, как и ранее. описан [13].Aichi68 h4N2 был получен из АТСС, а PR-8 любезно предоставлен Джоном Абрамсоном (Университет Уэйк-Форест), эти штаммы были приготовлены в яйцах аналогичным образом. Вирусы диализовали против PBS для удаления сахарозы, разделяли на аликвоты и хранили при -80 ° C до тех пор, пока они не потребовались. После размораживания вирусные запасы содержали ~ 5 × 10 ⁸ единиц образования инфекционных очагов / мл. Пандемический штамм h2N1 A / California / 2009 (Cal09) и сезонный штамм h2N1 A / New York / 2001 (NY01) были получены методом обратной генетики, как описано [14].

βA Препараты

βA42 и βA40 были получены от AnaSpec, Fremont, CA. βA42, полученный альтернативным способом (гексафтор-2-пропанол, HFIP), был приобретен в Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA, USA. LL-37 был получен от Abigent Inc. Пептид WRW4 был получен от Phoenix Pharmaceuticals, Burlingame, CA.

Анализ ингибирования гемагглютинации (НА)

Ингибирование

HA измеряли путем серийного разбавления βA в круглодонных 96-луночных планшетах (планшеты Serocluster U-Vinyl; Costar, Cambridge, MA) с использованием фосфатно-солевого буфера (PBS) в качестве разбавителя и эритроцитов типа O человека, как описано.

Флуоресцентный анализ инфекционности IAV

Монослои

клеток MDCK получали в 96-луночных планшетах и ​​выращивали до конфлюэнтности. Затем эти слои инфицировали разбавленными препаратами IAV в течение 45 мин. при 37 ° C в PBS. Клетки MDCK тестировали на присутствие инфицированных IAV клеток после 7 часов добавления вируса с использованием моноклональных антител, направленных против вирусного нуклеопротеина гриппа A (предоставленного доктором Нэнси Кокс, CDC, Атланта, Джорджия), как описано ранее. IAV предварительно инкубировали в течение 30 мин.при 37 ° C с различными концентрациями βA или контрольного буфера с последующим добавлением этих вирусных образцов к клеткам MDCK. В некоторых анализах использовали клетки эпителиальных клеток бронхов и трахеи человека (HBTE) или небольшие эпителиальные клетки дыхательных путей. Эти клетки были приобретены из Американской коллекции типовых культур (Манассас, Вирджиния) и размножены в недифференцированном состоянии в стандартных колбах для тканевых культур. Для экспериментов по нейтрализации множественность инфекции (MOI или отношение вирусных частиц к эпителиальным клеткам) составляла 0.1.

Анализ лактатдегидрогеназы (ЛДГ)

Анализ LDH проводили на клетках MDCK, инфицированных Phil82 IAV и βA42 или обработанных одним βA42. Контроли включали неинфицированные клетки и клетки, инфицированные IAV, без добавления какого-либо пептида. Анализ выполняли в соответствии с инструкциями производителя (Clontech, CA). Вкратце, анализ включает положительный и отрицательный контроли и представляет собой ELISA. Процент цитотоксичности получают из значений OD по формуле: OD490 _{положительный контроль} — OD490 _{отрицательный контроль} ÷ OD490 _{положительный контроль} × OD490 образца.

Измерение вирусной РНК

РНК

для вирусного белка М измеряли с помощью количественной ПЦР в реальном времени, как описано ранее [15]. Клетки MDCK инфицировали штаммами вируса IAV, инкубируемыми в течение 30 мин при 37 ° C с различными дозами βA42 или без них. Экстракцию РНК проводили через 45 минут и 24 часа после заражения с использованием набора для выделения вирусной РНК Magmax (Applied Biosytems, Карлсбад, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Для этих экспериментов мы использовали MOI, равный 1, поскольку концентрация, использованная в анализах нейтрализации, была слишком низкой для надежной регистрации с помощью анализа ПЦР после 45 минут заражения.Для экстракции использовали как лизированные клетки, так и клеточный супернатант. Вирусную РНК также экстрагировали из различных концентраций вируса с известным FFC / мл, который использовали в качестве стандартной серии. РНК подвергали обратной транскрипции с использованием реагентов обратной транскрипции TaqMan (Applied Biosytems, Карлсбад, Калифорния). Реакционная смесь и условия цикла соответствовали инструкциям производителя. Для ПЦР в реальном времени использовали праймеры, специфичные для белка M IAV (Forward AGA CCA ATC CTG TCA CCT CTGA и Reverse: CTG CAG TCC TCG CTC ACT).Праймеры и меченные TaqMan зонды с нефлуоресцентными фрагментами, связывающими малую бороздку (MGB), были разработаны вручную с использованием программного обеспечения Primer Express версии 3.0 (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния), а также были синтезированы Applied Biosystems. Последовательности для анализа проверяли на специфичность с помощью нуклеотидного BLAST. Эксперимент проводили в системе ПЦР 7500 в реальном времени (Applied Biosytems, Карлсбад, Калифорния) с использованием объема 20 мкл, содержащего 2 мкл кДНК матрицы, 0,9 мкМ праймера 0.25 мкМ меченного красителем 6-FAM зонда TaqMan MGB (6-FAM-ATT TGT GTT CAC GCT CAC CGT G-MGB) и 1 × универсальный мастер-микс для ПЦР TaqMan (Applied Biosytems, Карлсбад, Калифорния). Термоциклирование продолжалось при 50 ° C в течение 2 минут, 95 ° C в течение 10 минут, затем 40 циклов при 95 ° C в течение 15 секунд, 60 ° C в течение 1 минуты и 72 ° C в течение 30 секунд. Для расчета FFC / мл на основе значений порога цикла (Ct) мы сначала построили стандартную кривую, используя известные значения FFC / мл Log ₁₀ и соответствующие значения Ct. Значения Ct образцов были преобразованы в log 10 значений FFC / мл (x) с использованием формулы y = mx + c, где y — значение Ct, m — наклон, а c — точка пересечения.Наклон и пересечение были рассчитаны по стандартной кривой с помощью Micosoft Excel. Log ₁₀ значений FFC / мл были преобразованы в FFC / мл путем выполнения анти-логарифма (значение 10∧log ₁₀ ).

Измерение агрегации вирусов с помощью βA и электронной микроскопии

Вирусную агрегацию, вызванную βA, измеряли путем оценки поглощения света при 350 нМ суспензиями IAV. Это было сделано с использованием спектрофотометра Perkin Elmer Lambda 35 UV / Vis. Кроме того, вирусную агрегацию оценивали с помощью электронной микроскопии (ЭМ), как описано [16].Вкратце, βA42 инкубировали с Aichi68 IAV при 37 ° C в течение 30 минут, и на каждую медную сетку помещали образец объемом 4 мкл. После удаления несвязавшегося вируса сетку фиксировали 4 мкл 2,5% глутарового альдегида в течение 5 минут. Образцы окрашивали 1% фосфовольфраматом натрия (pH 7,3, Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури) в течение 10 секунд, и избыток красителя удаляли. Затем сетки сушили на воздухе и хранили в ящике для сеток до исследования с помощью электронного микроскопа Phillips 300 (Махва, Нью-Джерси).

Конфокальная микроскопия

Для этих экспериментов Aichi68 IAV был помечен Alexa Fluor 594.Набор для маркировки карбоновых кислот и сукцинимидилового эфира Alexa Fluor 594 был приобретен у компании Molecular Probes, и маркировка была проведена с использованием рекомендаций производителя с некоторыми изменениями. Вкратце, концентрированный исходный вирус инкубировали с Alexa Fluor в буфере с бикарбонатом натрия (pH 8,3) в течение одного часа при комнатной температуре. Затем препарат диализовали в течение ночи против PBS при 4 ° C. После этой процедуры не наблюдалось снижения титра вирусной гемагглютинации. Клетки MDCK предварительно инкубировали с меченым вирусом в течение 45 мин.с последующей промывкой и фиксацией 1% параформальдегидом. Перед этим IAV либо предварительно инкубировали с контрольным буфером, либо с βA в течение 30 минут при 37 ° C таким же образом, как и в анализе очага инфекции. Агглютинин зародышей пшеницы (WGA) -Oregon Green 488 (4 мкг / мл) и DAPI 350 использовали для окрашивания клеточной мембраны и ядра соответственно. Конфокальные снимки были сделаны на Zeiss LSM510 (LSEB) с разрешением 100 ×.

Препарат человеческих нейтрофилов и моноцитов

нейтрофилов от здоровых добровольцев были выделены до> 95% чистоты с использованием преципитации декстраном с последующим градиентным разделением фиколл-пак для разделения мононуклеарных клеток (наслоение выше фиколл-пак) и нейтрофилов (ниже фиколл-пак).Нейтрофилы дополнительно очищали гипотоническим лизисом для удаления любых загрязняющих эритроцитов, как описано ранее. При окрашивании трипановым синим было определено, что жизнеспособность клеток составляет> 98%. Выделенные нейтрофилы ресуспендировали в соответствующих концентрациях в контрольном буфере (PBS) и использовали в течение 2 часов. Мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC) отбирали из слоя выше Ficoll-Paque и несколько раз промывали в PBS. Моноциты выделяли из препаратов PBMC путем отрицательной селекции с использованием магнитных шариков с использованием набора для выделения моноцитов Miltenyi (номер по каталогу 130-091-153).

Измерение поглощения ВМА нейтрофилами и моноцитами

Флуоресцеинизотиоцианат (FITC)-меченый IAV (штамм Phil82) был приготовлен, и поглощение вируса нейтрофилами или моноцитами было измерено с помощью проточной цитометрии, как описано [17]. Вкратце, IAV обрабатывали различными дозами пептидов βA в течение 30 минут при 37 ° C. Затем его инкубировали с клетками в течение 45 минут при 37 ° C в присутствии контрольного буфера. К этим образцам добавляли трипановый синий (0,2 мг / мл) для гашения внеклеточной флуоресценции.После отмывки нейтрофилы фиксировали с помощью 1% параформальдегида и нейтрофилов, а флуоресценцию, связанную с моноцитами, измеряли с помощью проточной цитометрии. Измеряли среднюю флуоресценцию клеток (> 2000 клеток на образец). Для экспериментов с нейтрофилами и моноцитами (например, захват вируса, образование NET, продукция h3O2 и выработка цитокинов, MOI составлял ~ 40).

Оценка образования внеклеточной ловушки нейтрофилов (NET)

Для исследования NETs нейтрофилы ресуспендировали в PBS с добавлением Ca ²⁺ и Mg ²⁺ и позволяли им прилипать к 96-луночным планшетам, покрытым поли-L-лизином, или к чашкам для культивирования со стеклянным дном (MatTek corporation, Ashland, MA. ) в течение 1 часа в инкубаторе CO ₂ .Через 1 час незакрепленные клетки удаляли, а прикрепленные клетки инкубировали в течение 3 часов в инкубаторе CO ₂ с вирусом Phil82 после предварительной инкубации вируса (30 минут, 37 ° C) с βA42. Для количественной оценки образования сеток Sytox green (Life Technologies) добавляли к образцам на 96-луночном планшете после 3-часового инкубационного периода, и планшет считывали на флуоресцентном ридере для планшетов POLARstar OPTIMA (BMG Labtech, Durham NC). Сразу после считывания планшета планшет также сфотографировали на флуоресцентном микроскопе.

Анализ продукции фактора некроза опухоли альфа (TNFα) и ИЛ-6 моноцитами человека

Моноциты периферической крови человека выделяли разделением магнитных шариков, как описано выше, и инфицировали MOI ∼50 Phil82 IAV в течение 45 мин при 37 ° C. Вирус использовали либо отдельно, либо после 45 мин инкубации с различными концентрациями βA. После этого клетки осаждали, промывали PBS и затем культивировали в течение 18 часов при 37 ° C в RPMI с 10% аутологичной сывороткой в ​​инкубаторе CO ₂ .Через 18 часов супернатант собирали и анализировали на TNFα, используя метод сэндвич-ELISA (номер по каталогу MTNFAI; Endogen), следуя инструкциям производителя. ELISA на IL-6 выполняли с использованием набора от Abcam (Кембридж, Массачусетс, США).

Измерение нейтрофилов H

₂ O ₂ производство

H ₂ O _{2 Продукцию} измеряли путем оценки снижения флуоресценции скополетина, как описано ранее. Измерения проводили с использованием флуоресцентного ридера для планшетов POLARstar OPTIMA (BMG Labtech, Дарем, Северная Каролина).

Статистика

Статистические сравнения были выполнены с использованием парного двустороннего теста Стьюдента t или ANOVA с апостериорным тестом (Тьюки). ANOVA использовался для множественных сравнений с одним контролем.

Результаты

Нейтрализация штаммов ИАВ препаратами βА

Как показано на рисунке 1A, пептиды βA42 и βA40 значительно ингибировали инфекционность сезонного штамма h4N2 IAV (Phil82) для инфицирования клеток HTBE. Для экспериментов по нейтрализации мы использовали MOI 0.1, чтобы включить подсчет инфицированных клеток. Зашифрованная версия βA42 не проявляла активности в этом анализе. βA42 обладал значительно большей противовирусной активностью, чем βA40. Как показано на рисунке 1, панель B, βA40 и 42 также ингибировали пандемический штамм h2N1 с 2009 года (Cal09). И снова эффект βA42 был значительно больше, чем эффект βA40. BA42 также снижает инфекционность IAV для эпителиальных клеток мелких дыхательных путей (например, 16 мкг / мл BA42 снижает инфекционность Phil82 до 29 ± 12% от контроля, а Cal09 до 47 ± 15% от контроля; n = 6; p <0.01 по сравнению с вирусным контролем в обоих случаях; данные не показаны).

Рисунок 1. Вирусонейтрализующая активность βA42 и 40 для сезонных штаммов h4N2 и пандемического h2N1 IAV.

Аликвоты

штаммов вирусов Phil82 h4N2 (панель A) или Cal09 h2N1 (панель B) инкубировали с указанными концентрациями βA42 или 40 или скремблированной версией βA42, а затем эти образцы использовали для заражения монослоев клеток HBTE и тестировали на инфекционные очаги через 7 часов с использованием антинуклеопротеидных антител и флуоресцентной детекции.* указывает на значительное снижение инфекционности по сравнению с контролем (p <0,05; n = 4 эксперимента) ** указывает на p <0,02 по сравнению с βA40, скремблированным βA42 и контролем (анализ ANOVA) # указывает на повышенную инфекционность по сравнению с контролем.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101364.g001

Мы использовали клетки MDCK для дополнительного сравнения эффектов BA42 на инфекционность нескольких различных штаммов h4N2 и h2N1 (рис. 2A и B). Интересно, что βA42 обладал значительно большей нейтрализующей активностью против пандемического штамма h4N2 Aichi68, чем против сезонного штамма h4N2 Phil82 (рисунок 2A).Активность βA42 против Cal09 была равна или превышала его активность против сезонного штамма NY01 h2N1 или адаптированного мышиного штамма PR-8 h2N1. Обратите внимание, однако, что противовирусная активность βA42 для Cal09 была несколько ниже в клетках MDCK (рисунок 2C), чем в клетках HTBE (рисунок 1). Мы также протестировали активность дополнительного препарата βA42 против штаммов Phil82 и Cal09. Этот белок βA42 был приготовлен с использованием HFIP, чтобы избежать самоагрегации белка во время очистки. Как показано на фиг. 2C, препарат βA42 HFIP ингибировал оба штамма IAV.

Рисунок 2. Вирусонейтрализующая активность препаратов βA42 для различных штаммов IAV.

Эксперименты проводили, как на фиг. 1, за исключением того, что клетки MDCK использовали вместо клеток HTBE. Панель A показывает ингибирование двух штаммов h4N2, как указано. Панель B показывает ингибирование трех штаммов h2N1. На панели C показаны эффекты другого коммерчески доступного препарата βA42 (называемого βA42 HFIP) против штаммов Phil82 и Cal09. Панель D показывает влияние βA42 на инфицирование клеток A549 IAV Aichi68 и сравнивает эффекты предварительной инкубации вируса с βA42, как на панели A («предварительная инкубация с IAV»), с предварительной инкубацией клеток с βA42.В последнем случае βA42 либо оставался в клеточной среде при добавлении вируса («без промывки»), либо смывался перед добавлением вируса («промывка»). Хотя в настройке «без отмывки» инфекционность была значительно снижена, этот эффект был значительно меньше, чем при предварительной инкубации вируса с βA42 (p <0,01). Наконец, на панели D также показан эффект предварительной инкубации клеток с IAV при 4 ° C для обеспечения связывания с последующим добавлением βA42 и повышением температуры до 37 ° C («βA42 при 4 ° C»). * указывает на значительное снижение вирусной инфекционности по сравнению с контролем (только вирус) (p <0.01). ** указывает, где штамм Aichi68 подавлялся значительно больше, чем штамм Phil82 (панель A). Показанные результаты представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 4 или более экспериментов.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101364.g002

Противовирусный эффект βA42 также наблюдался с клетками A549, как показано на вирусе Aichi68 h4N2 (рисунок 2D; «Вирус + βA42»). Во всех описанных до сих пор экспериментах вирусы предварительно инкубировали с βA42 перед добавлением смеси к клеткам. На рисунке 2D мы также протестировали эффекты добавления βA42 к клеткам перед добавлением вируса.ΒA42 либо оставляли в среде при добавлении вируса («без промывки»), либо смывали перед добавлением вируса («промывка»). Как показано на рисунке 2D, смывание βA42 полностью устраняет противовирусный эффект, в то время как оставление βA42 в среде приводит к частичному ингибированию, значительно уменьшенному по сравнению с экспериментами, в которых вирус и βA42 предварительно инкубировали вместе. Это говорит о том, что противовирусный эффект βA42 в значительной степени опосредован его прямым взаимодействием с вирусом. Мы также протестировали инкубацию клеток с вирусом в течение 45 при 4 ° C с последующим добавлением βA42 и затем повышением температуры до 37 ° C («BA42 при 4 ° C»).При использовании этого метода не наблюдалось явного ингибирования инфекции. Это также предполагает, что взаимодействие βA42 со свободным вирусом (до связывания вируса с клетками) было критическим.

Чтобы убедиться, что наблюдаемая противовирусная активность βA42 не является артефактом повреждения клеток, вызванного пептидом, мы выполнили анализ ЛДГ на клетках MDCK, обработанных одним βA42 (при 20 и 40 мкг / мл) или βA42 при тех же концентрациях в наличие Phil82 IAV. Условия для этих экспериментов были такими же, как и для тестов на инфекционный очаг.В анализе используются положительный и отрицательный контроль для определения% клеточной цитотоксичности. Один βA42 или в присутствии вируса не увеличивал цитотоксичность значительно по сравнению с необработанными клетками MDCK, и все обработанные клетки обладали цитотоксичностью ≤1% (данные не показаны; проведено 4 отдельных эксперимента).

Для дальнейшего изучения механизма противовирусной активности βA42 мы провели количественные ПЦР-анализы для вирусного М-белка, чтобы определить, снижает ли пептид захват вируса эпителиальными клетками через 45 мин после заражения.Для этих экспериментов мы использовали MOI, равный 1, поскольку концентрация, использованная в анализах нейтрализации, была слишком низкой для надежной регистрации с помощью анализа ПЦР после 45 минут заражения. Как показано на фиг. 3A, βA42 действительно значительно снизил количество вирусной РНК, захваченной клетками MDCK, при одновременном увеличении количества вируса, остающегося в супернатанте. Это открытие указывает на то, что механизм противовирусной активности βA42 включает, по крайней мере, частично сниженное поглощение эпителиальными клетками. Мы также проверили, уменьшалась ли вирусная РНК, присутствующая в клетках и супернатантах клеток, βA42 через 20 часов после заражения.На рис. 3В показано сильное снижение клеточной или надосадочной вирусной РНК в это время в образцах, где вирус был предварительно обработан βA42.

Рисунок 3. Влияние βA42 на интернализацию вируса и репликацию вируса в клетках MDCK, как определено с помощью количественной ОТ-ПЦР.

На панелях A Phil82 IAV предварительно инкубировали с указанными концентрациями βA42 с последующей инкубацией этих образцов в течение 45 минут с клетками MDCK, как показано на рисунке 1. Затем собирали клеточный супернатант и осадок клеток и экстрагировали вирусную РНК. с последующим анализом ПЦР для определения количества вируса, присутствующего в клетках и супернатанте.βA42 значительно снизил количество вируса, поглощаемого клетками после 45 минут заражения. Наблюдалась тенденция к увеличению количества вируса в супернатанте после 45 минут инфицирования, но это не было значительным. Панель B показывает результаты анализов клеток и супернатанта после 24 часов инфицирования. βA42 значительно снизил количество вируса как в клетке, так и в супернатанте в это время. * означает p <0,05 по сравнению с контролем. Результаты представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для трех экспериментов.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pone.0101364.g003

Ранее мы сообщали, что HNP, ретроциклины и LL-37 не подавляют активность вирусной гемагглютинации, несмотря на то, что все эти пептиды вызывают вирусную нейтрализацию. Точно так же пептиды βA не ингибировали активность HA штамма Phil82 (данные не показаны).

Вирусная агрегация в ответ на пептиды βA

Некоторые другие врожденные вирусные ингибиторы, такие как дефенсины нейтрофилов человека (HNP), коллины и фиколины, вызывают агрегацию вирусов.Как показано на фиг. 4, βA42 вызывал значительную дозозависимую агрегацию IAV h4N2 (штамм Aichi68), что оценивалось с помощью анализа на пропускание света. Рисунок 5 демонстрирует агрегаты, образованные βA42, с помощью конфокальной микроскопии. В панели управления вирус (красный цвет) практически не виден. В образцах, обработанных βA42, присутствуют отчетливые видимые агрегаты. Агрегаты также были продемонстрированы с помощью электронной микроскопии (нижние панели рис. 5).

Рисунок 4. Вирусная агрегация, индуцированная βA42.

Агрегацию штамма вируса Aichi68 h4N2 оценивали на основании увеличения светопоглощения при 350 (n = 5; p <0,02) при концентрации βA42 16 мкг / мл по сравнению с пропусканием света через контрольный вирусный препарат.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101364.g004

Рис. 5. Конфокальная и электронная микроскопия, демонстрирующие вирусные агрегаты, образованные βA42.

Aichi68 IAV, меченный Alexafluor 594, инкубировали с контрольным буфером или βA42 в указанных концентрациях.После этого образцы вируса +/- βA42 добавляли к монослоям клеток MDCK, как описано в разделе «Методы». Вирус имеет красный цвет, ядра клеток были окрашены Dapi 350 и выглядят синими, а клеточные мембраны были помечены WGA-Oregon Green 488. Верхние изображения показывают те же поля, что и ниже, но средние изображения показывают только длину волны вируса. Агрегаты также наблюдались с помощью электронной микроскопии (нижний ряд изображений). Результаты представляют три подобных эксперимента. Снимки были сделаны с увеличением 100 ×.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101364.g005

Влияние пептидов βA на взаимодействия нейтрофилов с IAV

Для экспериментов с нейтрофилами и моноцитами мы использовали значительно более высокие концентрации IAV (т.е. MOI ~ 40), при которых вирус действует как агонист фагоцитов, как описано ранее [18]. Наша цель состояла в том, чтобы определить, модулируют ли пептиды βA эту агонистическую активность. Один только IAV запускает респираторный импульсный ответ нейтрофилов человека, и этот ответ усиливается при предварительной инкубации IAV с коллинами.Мы тестировали различные препараты только βA, и они не вызывали реакции нейтрофилов H ₂ O ₂ (данные не показаны). Предварительная инкубация Phil82 IAV с βA42 приводила к значительному увеличению IAV-индуцированного ответа (фигура 6A). βA42 HFIP вызвал аналогичное значительное увеличение продукции H ₂ O ₂ (данные не показаны). Напротив, скремблированные βA42 (панель A) и βA40 (панель B) не вызывали значительного увеличения продукции H ₂ O ₂ по сравнению с продукцией, индуцированной только IAV.Предварительная инкубация IAV с βA42 привела к значительному увеличению поглощения нейтрофилами IAV (фигура 7A). Предварительная инкубация IAV с βA42 также увеличивала продукцию NET в ответ на вирус (фигура 7B). Было показано, что βA42 связывается с рецепторами формилпептидов на глиальных клетках, что приводит к клеточным ответам [19]. В связи с этим мы проверили влияние блокатора рецепторов формилпептида на образование NET. Этот блокатор, WRW4, не влиял на образование NET в ответ на IAV или IAV + βA42 (фигура 7B).Мы протестировали два агониста рецептора формилпептида, fMLP и WKYVM, и ни один из них не индуцировал образование NET (данные не показаны). На фиг. 8 показаны флуоресцентные микрофотографии, указывающие на усиление индуцированного IAV образования NET, когда штаммы IAV Phil82 или Aichi68 были предварительно инкубированы с βA42. Один только βA42 не вызывал какого-либо увеличения NET-ответа по сравнению с одним буфером.

Рисунок 6. Нейтрофилы H ₂ O ₂ ответы только на IAV или на IAV, обработанные βA42 или βA40.

Человеческие нейтрофилы обрабатывали одним буфером (PBS), только IAV (Phil82) или IAV, которые были предварительно обработаны βA42 или скремблированным βA42 (панель A) или βA40 (панель B) (все в концентрации 16 мкг / мл).βA42 вызывал значительное увеличение ответа H ₂ O ₂ по сравнению с одним IAV или IAV, предварительно обработанным скремблированным пептидом βA40 (обозначено **). Обратите внимание, что последние два белка не увеличивали ответ по сравнению с одним IAV. Результаты представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 5 экспериментов (каждый с отдельным донором нейтрофилов).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101364.g006

Рис. 7. βA42 увеличивает поглощение нейтрофилами IAV и индуцированное IAV образование NET.

На панели А нейтрофилы обрабатывали только FITC-меченным Phil82 IAV или вирусом, предварительно инкубированным с указанными пептидами. βA42 и βA42 HFIP значительно увеличивали захват вируса нейтрофилами (обозначено * для обоих; n = 4; p <0,03 по сравнению с контролем). Показанные количества βA представляют собой те количества, которые первоначально инкубировали с IAV до разбавления, которое произошло, когда эти образцы были добавлены к нейтрофилам. Например, где 50 мкг / мл показано на фиг. 7A или 9B, конечная концентрация с клетками составляла 14 мкг / мл.Скремблированный пептид и βA40 не увеличивали захват вируса. Панель B показывает образование NET в ответ на контрольный буфер, только IAV, только βA42 или IAV, предварительно инкубированный с 16 или 32 мкг / мл βA42. Флуоресценцию Sytox-зеленого измеряли флуорометром для считывания показаний планшета после 30 мин обработки при 37 ° C. Показанные результаты представляют собой среднее значение ± стандартная ошибка среднего для 5 экспериментов с использованием отдельных доноров нейтрофилов. Белые столбцы - результат воздействия стимулов в контрольных ячейках. Черные столбцы представляют собой результаты, полученные для клеток, предварительно обработанных пептидом WRW4, который ингибирует ответы, опосредованные рецепторами формилпептида.* означает p <0,01 по сравнению с контрольным буфером. ** означает p <0,01 по сравнению с одним только IAV. Пептид WRW4 не снижал реакции на какой-либо стимул.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101364.g007

Рис. 8. Флуоресцентные микрофотографии образования NET в ответ на IAV и / или βA42.

Панель A: Результаты представляют 4 эксперимента с использованием различных доноров нейтрофилов. Цифры слева показывают зеленую флуоресценцию Sytox, а цифры справа на этой панели показывают те же поля под фазово-контрастной микроскопией, чтобы проиллюстрировать, сколько нейтрофилов присутствовало.Эти фотографии были сделаны в 40 раз и увеличены, чтобы соответствовать размеру клеток на панели B. Панель B представляет другую серию из 3 экспериментов с использованием штаммов вирусов Phil82 или Aichi68 в соответствии с указанной фазой и показывает зеленую флуоресценцию Sytox, полученную при 100-кратном увеличении.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101364.g008

Влияние βA на взаимодействия моноцитов с IAV

βA42 значительно снижал процент моноцитов, экспрессирующих вирусный нуклеопротеин, через 18 часов после заражения (фигура 9A).Интересно, что предварительная инкубация с βA42 привела к увеличению поглощения флуоресцентно меченного IAV моноцитами после 45 мин инкубации (фигура 9B). Phil82 IAV индуцировал устойчивую продукцию TNF и IL-6 после 18 часов инфекции, как сообщалось ранее. Средняя продукция TNF из неинфицированного контроля, IAV-инфицированных клеток и клеток, подвергшихся воздействию 20 мкг / мл одного βA42, составляла: 6 ± 2, 52 ± 14 и 4 ± 2 нг / мл, соответственно (p <0,001 для обработанных IAV по сравнению с контроль; n = 8). Аналогичным образом, уровни IL-6 для контрольных, инфицированных IAV или обработанных βA42 клеток составляли: 16 ± 3, 36 ± 6 и 20 ± 4 нг / мл (p <0.01 для IAV-инфицированных по сравнению с контролем; п = 4). Моноциты, обработанные одним βA42, не производили значительно больше TNF или IL-6, чем контроли в этих экспериментах. Предварительная инкубация вируса с βA42 не изменяла индуцированную IAV продукцию TNF, но значительно снижала ответ IL-6 (фигура 9C; результаты выражены в% от вирусного контроля).

Рисунок 9. Влияние βA42 на взаимодействия IAV с моноцитами: синтез вирусного белка (панель A), захват вируса (панель B) и индуцированное вирусом образование цитокинов (панель C).

Прилипшие моноциты периферической крови инфицировали только Phil82 IAV или Phil82 IAV, обработанными указанными дозами βA42. На панели А наличие вирусного нуклеопротеина в клетках проверяли, как показано на фиг.1, после 24 часов инкубации. * означает значительное снижение по сравнению с одним вирусом (p <0,03; n = 4 отдельных донора крови). На панели B была проверена способность моноцитов поглощать флуоресцентно меченый IAV после 45-минутной инкубации. Повышенное поглощение (p <0,05; n = 4) обозначено *.На панели C моноциты инкубировали с пептидом IAV +/- в течение 24 часов, а затем с помощью ELISA измеряли высвобождение TNF или IL-6 в супернатант. Один только IAV стимулировал повышенную продукцию цитокинов клетками (см. Раздел «Результаты»). Продукция IL-6 была значительно снижена при предварительной инкубации вируса с βA42 (p <0,02; n = 4; обозначено *). Продукция TNF не снижалась под действием βA42 (n = 8).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0101364.g009

Обсуждение

Мы впервые продемонстрировали, что пептиды βA обладают противовирусной активностью.Пептиды βA обладали противовирусной активностью не только в клетках MDCK, но и в более физиологических моделях клеток (первичные трахеобронхиальные клетки или клетки небольших дыхательных путей). Противовирусная активность βA42 оказалась несколько выше в клетках HTBE, чем в клетках MDCK. Противовирусная активность βA42 была значительно выше, чем βA40. Это согласуется с выводами Soscia et al. О том, что βA42 обладает большей антибактериальной и противогрибковой активностью, чем βA40 [6]. Примечательно, что пептиды также ингибировали пандемический штамм Cal09 h2N1, который не ингибируется некоторыми другими врожденными ингибиторами, включая колтины, MBL и SP-D или пентраксин [16], [20].Используя количественные ПЦР-анализы, мы показываем, что βA42 снижает поглощение IAV эпителиальными клетками, что, по крайней мере, частично объясняет его противовирусную активность. Мы также показали, что βA42 снижает как клеточную, так и надосадочную вирусную РНК через 24 часа после заражения. Кроме того, мы показываем, что для достижения оптимального ингибирования критически важно предварительно инкубировать вирус с βA42. Следовательно, пептид, по-видимому, в основном действует на сам вирус, а не на клетку, достигая нейтрализации. В соответствии с ранее полученными данными, полученными с использованием дефенсинов, ретроциклинов и LL-37, пептиды βA не ингибируют HA-активность IAV [15], [21].Наши результаты также предполагают, что способность βA42 вызывать вирусную агрегацию может частично объяснять вирусное ингибирование. В частности, предварительная инкубация эпителиальных клеток с вирусом при 4 ° C (позволяющая связывание вируса, но не интернализацию) с последующим добавлением βA42 не вызывала ингибирования инфекционности.

Открытие того, что βA42 способен индуцировать вирусную агрегацию, представляет интерес и может отражать потенциал самоагрегации этого пептида [1]. Мы предложили аналогичный механизм способности HNP и ретроциклинов вызывать агрегацию вирусов [21], [22].Напротив, LL-37 не вызывает агрегации вирусов и подавляет инфекционность на этапе после интернализации вируса в клетке [15]. Механизм противовирусной активности пептидов βA включает снижение захвата вируса эпителиальными клетками, возможно, в результате вирусной агрегации. Мы не можем исключить возможность того, что пептиды βA также изменяют вирусные мембраны, снижая инфекционность. Будущие исследования с более чувствительными методами ЭМ могут прояснить это.

Противомикробные пептиды обладают множеством иммуномодулирующих эффектов, и недавние исследования показывают, что пептиды βA обладают аналогичными эффектами.Мы показываем, что βA42 увеличивает поглощение нейтрофилами IAV, а также увеличивает респираторную реакцию нейтрофилов на вирус. Было показано, что другие типы амилоидных фибрилл индуцируют образование NET [23], и теперь мы показываем, что βA42 индуцирует NET, но только в присутствии вируса. Поскольку сообщалось, что βA42 опосредует некоторые из своих эффектов на глиальные клетки через рецепторы формилпептидов [12], которые также присутствуют на нейтрофилах [24], мы проверили, может ли блокатор этих рецепторов изменить усиленное образование NET, вызванное βA42.Этот блокатор не имел никакого эффекта в этом анализе, поэтому не представляется, что этот эффект βA42 опосредуется рецепторами формилпептида. Интересно, что βA42 значительно увеличивал поглощение IAV моноцитами после 45 минут инкубации, но продукция вирусного белка снижалась через 20 часов. Это указывает на то, что вирус, захваченный в присутствии βA42, не реплицируется в клетках. На основании этих данных βA42, по-видимому, помогает фагоцитам очищать вирус от вируса. βA42 снижает индуцированную IAV продукцию IL-6, но не продукцию TNF этими клетками.Дальнейшие исследования иммуномодулирующих эффектов пептидов βA или их взаимодействия с другими молекулами врожденного иммунитета будут представлять большой интерес [25].

Пептиды

βA были обнаружены в низкой концентрации в сыворотке крови человека и в высокой концентрации в ткани мозга пациентов с болезнью Альцгеймера. Неясно, происходит ли местная продукция пептидов βA во время воспаления в других частях тела. Поскольку IAV преимущественно реплицируется в дыхательных путях, необходимо, чтобы значительные количества βA присутствовали в жидкостях слизистой дыхательных путей или легких, чтобы участвовать в подавлении вируса.Штаммы птиц (например, H5N1) могут вызывать прямую инфекцию мозга у мышей, хотя инфицирование ЦНС во время гриппа человека встречается крайне редко [26]. Кроме того, хорошо задокументированы неврологические последствия инфекции IAV (например, энцефалит, возникший в результате пандемии 1918 года). Не установлено, связаны ли такие последствия с накоплением βA в головном мозге. В любом случае наши результаты могут иметь большее отношение к другим вирусам, поражающим ЦНС, включая ВИЧ и ВПГ. Деменция, связанная с ВИЧ, связана с накоплением βA в головном мозге [7].Сообщалось также о сильной связи инфекции HSV с производством и накоплением βA [27]. Цитомегаловирусная инфекция также связана с болезнью Альцгеймера [28]. Большой интерес представляют дальнейшие исследования противовирусной активности βA против этих вирусов. Также было бы очень интересно определить, вызывает ли IAV повышенную продукцию βA в различных типах клеток. Наши исследования показывают, что βA обладает как противовирусной активностью, так и сильным иммуномодулирующим действием с использованием IAV в качестве модельной системы, и расширение этих исследований на другие вирусы, в том числе связанные с болезнью Альцгеймера или инфекцией мозга, будет представлять большой интерес.

Вклад авторов

Эксперимент задумал и спроектировал: MRW RK KLH. Проведены эксперименты: MRW ST DC LQ. Проанализированы данные: MRW RK KLH. Предоставленные реагенты / материалы / инструменты анализа: LQ JT. Написал статью: MRW RK KLH.

Ссылки

1. 1. Дальгрен К.Н., Манелли А.М., Стайн В.Б. мл., Бейкер Л.К., Крафт Г.А. и др. (2002) Олигомерные и фибриллярные виды пептидов бета-амилоида по-разному влияют на жизнеспособность нейронов. J Biol Chem 277: 32046–32053.
2. 2. Masters CL, Selkoe DJ (2012) Биохимия амилоидного бета-белка и амилоидных отложений при болезни Альцгеймера. Cold Spring Harb Perspect Med 2: a006262.
3. 3. Selkoe DJ (2008) Биохимия и молекулярная биология амилоидного бета-белка и механизм болезни Альцгеймера. Handb Clin Neurol 89: 245–260.
4. 4. Jang H, Ma B, Lal R, Nussinov R (2008) Модели токсичных каналов бета-листов протегрина-1 предполагают общий мотив организации субъединиц, общий с каналами токсичных бета-амилоидных ионов альцгеймера.Biophys J 95: 4631–4642.
5. 5. Папаредди П., Моргелин М., Вальс Б., Шмидтхен А., Мальмстен М. (2012) Антимикробная активность пептидов, полученных из белка-предшественника человеческого ss-амилоида. J Pept Sci 18: 183–191.
6. 6. Soscia SJ, Kirby JE, Washicosky KJ, Tucker SM, Ingelsson M и др. (2010) Амилоидный бета-белок, связанный с болезнью Альцгеймера, представляет собой антимикробный пептид. PLoS One 5: e9505.
7. 7. Zhang J, Liu J, Katafiasz B, Fox H, Xiong H (2011) Повреждение аксонов, вызванное gp120 ВИЧ-1, обнаруженное по накоплению белка-предшественника бета-амилоида в мозолистом теле взрослой крысы.J Neuroimmune Pharmacol 6: 650–657.
8. 8. Возняк М.А., Ицхаки Р.Ф., Шипли С.Дж., Добсон С.Б. (2007) Инфекция вируса простого герпеса вызывает накопление бета-амилоида в клетках и активацию секретазы. Neurosci Lett 429: 95–100.
9. 9. Зеуберт П., Виго-Пелфри С., Эш Ф., Ли М., Дови Х. и др. (1992) Выделение и количественное определение растворимого бета-пептида Альцгеймера из биологических жидкостей. Nature 359: 325–327.
10. 10. Oppenheim JJ, Yang D (2005) Alarmins: хемотаксические активаторы иммунных ответов.Curr Opin Immunol 17: 359–365.
11. 11. Jana M, Palencia CA, Pahan K (2008) Фибриллярные бета-амилоидные пептиды активируют микроглию через TLR2: последствия для болезни Альцгеймера. J Immunol 181: 7254-7262.
12. 12. Ричард К.Л., Филали М., Префонтейн П., Ривест С. (2008) Толл-подобный рецептор 2 действует как естественный врожденный иммунный рецептор, очищая бета-амилоид 1-42 и задерживая снижение когнитивных функций на мышиной модели болезни Альцгеймера. J Neurosci 28: 5784–5793.
13. 13.Хартсхорн К.Л., Колламер М., Ауэрбах М., Майерс Дж. Б., Павлоцкий Н. и др. (1988) Влияние вируса гриппа А на метаболизм кальция нейтрофилов человека. J Immunol 141: 1295–1301.
14. 14. Ци Л., Каш Дж. К., Дуган В. Г., Джаггер Б. В., Лау Ю. Ф. и др. (2011) Способность гемагглютининов вируса пандемического гриппа вызывать патологию нижних дыхательных путей связана со снижением связывания с сурфактантным белком D. Вирусология 412: 426–434.
15. 15. Tripathi S, Tecle T, Verma A, Crouch E, White M и др.(2013) Кателицидин человека LL-37 ингибирует вирусы гриппа A по механизму, отличному от сурфактантного протеина D или дефенсинов. J Gen Virol 94: 40–49.
16. 16. Verma A, White M, Vathipadiekal V, Tripathi S, Mbianda J и др. (2012) Человеческий H-фиколин подавляет репликацию вирусов сезонного и пандемического гриппа А. J Immunol 189: 2478–2487.
17. 17. Tecle T, White MR, Gantz D, Crouch EC, Hartshorn KL (2007) Дефенсины нейтрофилов человека увеличивают поглощение нейтрофилами вируса гриппа A и бактерий и изменяют индуцированные вирусом респираторные взрывы.J Immunol 178: 8046–8052.
18. 18. Hartshorn KL, Collamer M, White MR, Schwartz JH, Tauber AI (1990) Характеристика активации нейтрофилов человека вирусом гриппа А. Кровь 75: 218–226.
19. 19. Словик А., Меррес Дж., Эльфген А., Янсен С., Мор Ф. и др. (2012) Вовлечение рецепторов формилпептида в рецептор конечных продуктов гликирования (RAGE) — и индуцированная амилоидом бета 1-42 передача сигнала в глиальных клетках. Mol Neurodegener 7: 55
20. 20.Работа ER, Дэн Ю.М., Тейт, доктор медицины, Боттацци Б., Крауч Е.К. и др. (2010) Пандемические вирусы гриппа h2N1 устойчивы к противовирусной активности белков врожденного иммунитета суперсемейств коллектинов и пентраксинов. J Immunol 185: 4284–4291.
21. 21. Doss M, White MR, Tecle T, Gantz D, Crouch EC, et al. (2009) Взаимодействие альфа-, бета- и тета-дефенсинов с вирусом гриппа A и сурфактантным белком D. J Immunol 182: 7878–7887.
22. 22. Hartshorn KL, White MR, Tecle T, Holmskov U, Crouch EC (2006) Врожденная защита от вируса гриппа A: активность дефенсинов нейтрофилов человека и взаимодействия дефенсинов с сурфактантным белком D.J Immunol 176: 6962–6972.
23. 23. Azevedo EP, Guimaraes-Costa AB, Torezani GS, Braga CA, Palhano FL, et al. (2012) Амилоидные фибриллы запускают высвобождение внеклеточных ловушек нейтрофилов (NET), вызывая фрагментацию фибрилл с помощью NET-связанной эластазы. J Biol Chem 287: 37206–37218.
24. 24. Lee RM, White MR, Hartshorn KL (2006) Вирусы гриппа a повышают экспрессию и функцию толл-подобного рецептора 2 нейтрофилов. Scand J Immunol 63: 81–89.
25. 25.Ларви М., Шуп Т., Чанг В.С., Чигвеше Л., Хартсхорн К. и др. (2012) Лектин, связывающий маннозу, связывается с бета-амилоидным белком и модулирует воспаление. J Biomed Biotechnol 2012: 929803.
26. 26. Шинья К., Макино А., Танака Х, Хатта М., Ватанабе Т. и др. (2011) Системное распространение вируса гриппа A H5N1 у хорьков и хомяков после прямой внутрижелудочной инокуляции. J Virol 85: 4673–4678.
27. 27. Де Кьяра Дж., Маркоччи М.Э., Чивителли Л., Арньяни Р., Пьячентини Р. и др.(2010) Процессинг APP, индуцированный вирусом простого герпеса типа 1 (HSV-1), дает несколько фрагментов APP в нейрональных клетках человека и крысы. PLoS One 5: e13989.
28. 28. Лурайн Н.С., Хэнсон Б.А., Мартинсон Дж., Леурганс С.Е., Ландей А.Л. и др. (2013) Вирусологические и иммунологические характеристики цитомегаловирусной инфекции человека, ассоциированной с болезнью Альцгеймера. J Infect Dis 208: 564–572.

Термодинамический выбор стерических узоров застежек в амилоидном перекрестном β-ости

Образец цитирования: Park J, Kahng B, Hwang W. (2009) Термодинамический выбор стерических узоров застежек в амилоидном кресте- позвоночника.PLoS Comput Biol 5 (9): e1000492. https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000492

Редактор: Рут Нусинов, Национальный институт рака, Соединенные Штаты Америки и Тель-Авивский университет, Израиль

Поступила: 13 октября 2008 г .; Одобрена: 28 июля 2009 г .; Опубликовано: 4 сентября 2009 г.

Авторские права: © 2009 Park et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была частично поддержана SNU-ORA и Программой грантов на оказание международной помощи при поездках Техасского университета A&M (IRTAG). Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили об отсутствии конкурирующих интересов.

Введение

Амилоидные фибриллы являются отличительным признаком нескольких нейродегенеративных заболеваний, включая болезни Альцгеймера, Паркинсона и прионные заболевания [1].В отличие от других четвертичных структур белков [2], амилоидные фибриллы разделяют независимый от последовательности структурный мотив, известный как перекрестный β шип; отдельные нити из составляющих белков образуют β -лист, который проходит перпендикулярно оси фибрилл [3]. Амилоидный фибриллогенез представляет собой многоэтапный процесс агрегации белков, и накопленные данные свидетельствуют о токсичности префибриллярных олигомеров [4]. Тем не менее, нельзя отрицать патологические роли фибриллярных видов.Было высказано предположение, что амилоидные протофибриллы, а также олигомеры приводят к гибели нейрональных клеток [5] — [8]. Прерывание образования фибрилл предотвращало повреждение клеток [9], и β -листовые диффузные олигомерные разновидности A β , главного компонента амилоидных фибрилл при болезни Альцгеймера, обладают цитотоксичностью, которая имеет структурное сходство со зрелыми фибриллами [10] . В случае системного амилоидоза большое количество отложений амилоида само по себе может быть симптоматическим [11]. Недавние открытия предполагают еще большую биологическую роль амилоидных фибрилл: амилоидные фибриллы в сперме ускоряют распространение ВИЧ-инфекции [12]; Функциональный амилоид млекопитающих, состоящий из белка Pmel17, способствует образованию меланина [13].Более того, пептиды, сконструированные de novo , самособираются в амилоидоподобные β -листовые филаменты, и гидрогели, состоящие из этих филаментов, обладают большим потенциалом для создания трехмерного каркаса клеточных культур [14], [15].

Амилоидные фибриллы могут быть образованы широким спектром белковых последовательностей, частичная денатурация которых является обычным предшественником образования фибрилл [16]. Эволюция, по-видимому, имеет ограниченные белковые последовательности в ограниченном диапазоне физико-химических свойств, i.е. в гидрофобности и чистых электростатических зарядах, чтобы предотвратить неправильную укладку и агрегацию белков [17]. Молекулярный полиморфизм — еще одна особенность амилоидного фибриллогенеза, когда данный пептид или белок может самособираться в структуры филаментов, которые различаются атомистическим порядком, а также морфологией филаментов [18]. В то время как выбор структуры волокна зависит от условий роста, которыми может быть чисто механическое перемешивание, после того, как стабильное волокно сформировано, оно продолжает расти, сохраняя атомистический порядок, даже если условия роста меняются [19], [20].

Механизм отбора для перекрестной β структуры амилоидных фибрилл еще предстоит выяснить. Предыдущие экспериментальные подходы, такие как дифракция рентгеновских лучей на волокне [21], твердотельный ядерный магнитный резонанс (ЯМР) [22], [23], атомно-силовая микроскопия (AFM) [24] и электронная микроскопия (EM) [25] внесли большой вклад в понимание молекулярных структур амилоидных фибрилл, а также общей морфологии фибрилл. Совсем недавно рентгеновская дифракция микрокристаллов амилоида позволила однозначно определить атомистические структуры с высоким разрешением перекрестного β шипа [26], [27].Эти результаты свидетельствуют о том, что перекрестные β шипы имеют общую структурную особенность, называемую «стерической застежкой-молнией», где боковые цепи от двух β -листов образуют плотно пересекающуюся дегидратированную поверхность раздела, так что полученный β -лист бислой образует фундаментальный строительный блок фибриллярных агрегатов.

Хотя эти эксперименты важны для описания супрамолекулярных структур амилоидных фибрилл, остается фундаментальный вопрос относительно того, как эти структуры образуются.Знание пути сборки и структурных свойств этих фибрилл было бы полезно для разработки терапевтических стратегий против амилоидозов, а также для разработки биоматериалов, основанных на самосборке пептидов в β -листовых фибрилл. Компьютерное моделирование сыграло важную роль в решении этих вопросов. Кинетика сборки β--листовых олигомерных разновидностей характеризовалась начальным гидрофобным коллапсом с последующей реорганизацией мономеров с образованием водородных связей основной цепи [28], [29].Рассчитан потенциал средней силы димеров пептидов [30], [31]. Пятна, склонные к агрегации в амилоидогенном белке, были идентифицированы путем разделения белка на сегменты и проведения моделирования для каждого из них [32]. Также изучалась относительная стабильность олигомеров, а также зрелых филаментов [33], [34]. Совсем недавно были изучены различные способы взаимодействия между двумя β -листами, образованными амилоидными полипептидами островков человека [35].

Свойства рентгеновских структур высокого разрешения перекрестных β игл [26], [27] также были исследованы с помощью расчетов.Молекулярно-динамическое (МД) моделирование изолированных двухслойных филаментов из β -листов показало стабильность стерической молнии, в то время как филамент развивал спиральное закручивание [36]. Стабильность спонтанно образующихся олигомеров, а также олигомерных сегментов филамента была проверена [37] — [39]. Тщательный структурный анализ различных олигомерных видов β -листов выявил возможный механизм токсичности через открытые цепи без застежки-молнии [40]. Квантово-механический, а также классический электростатический расчет ab initio показал, что энергетика образования β -листа кооперативна до длины трех пептидов [41].В дополнение к моделированию доступных структур, метод моделирования, основанный на знаниях, использующий кристаллографические структуры, был разработан для идентификации фибриллообразующих сегментов белков [42], а симметрия филаментов была использована для предсказания детальной конформации двухслойной конформации β -листов [43]. Возможные способы связывания типичных амилоидных маркеров, конго красного и тиофлавина-Т, на этих фибриллах также были изучены с помощью вычислений [44], [45].

Несмотря на эти успехи в структурной характеристике, остается основной вопрос, касающийся механизма выбора для стерических рисунков застежки-молнии.Для данной пептидной последовательности существует несколько способов конструирования β -листов и их укладки [46], [47]. 13 доступных кристаллических структур перекрестного β позвоночника («стерическая застежка-молния») подразделяются на 8 различных паттернов в зависимости от: 1) относительного направления последовательных пептидов в каждом слое, 2) выбора лицевой стороны стержня . β -лист, образующий дегидратированный интерфейс, и 3) симметрия между соседними слоями β -листа [27]. Тем не менее, неясно, как данный пептид в этом исследовании закончился определенным двухслойным паттерном.Хотя ожидается, что кристаллическая структура соответствует минимуму свободной энергии среди возможных рисунков филаментов, на сегодняшний день не существует количественных исследований, демонстрирующих это.

Молекулярный полиморфизм в амилоидных фибриллах, как упомянуто выше, еще больше усложняет картину, где такие факторы, как механическое перемешивание [19] или различная ионная сила [22], [48], могут приводить к различным супрамолекулярным структурам (обзор в [18]). В связи с этим один из нас обнаружил, что на ранних стадиях сборки кинетический захват может преобладать над минимизацией свободной энергии, поскольку время конформационной релаксации для кинетически захваченных олигомеров больше, чем время диффузионного столкновения с другими мономерами и олигомерами, что подтверждает возможность эта кинетически захваченная структура может распространяться на уровень филамента [28].Действительно, существуют две структуры нитей для пептида NNQQ, Protein Data Bank (PDB) IDs 2ONX и 2OLX, где их условия кристаллизации различаются только содержанием резервуарного раствора. Было высказано предположение, что полиморфизм возможен, если существует несколько структур нитей с аналогичной термодинамической стабильностью [18]. Однако нет количественных исследований, подтверждающих эту картину. Также неясно, является ли аналогичная стабильность между множественными возможными структурами филаментов требованием для полиморфизма, или же структура филамента может быть выбрана чисто кинетическим механизмом, даже если она не является наиболее стабильной (с барьером свободной энергии с наиболее стабильным одна достаточно большая, где: постоянная Больцмана, T : температура).Таким образом, кажется, что, хотя амилоидный фибриллогенез является в значительной степени независимым от последовательности явлением, для данной пептидной последовательности выбор конкретной стерической модели застежки-молнии включает сложные взаимодействия между аминокислотными боковыми цепями, а также водородными связями основной цепи. Таким образом, желателен комплексный метод, который разъясняет механизм структурного отбора и стабилизирующую роль отдельных остатков в филаменте.

Для решения этих проблем мы внедрили методы расчета энергий связывания белок-белок [49] — [51] в схему компьютерного моделирования и моделирования, которая вычисляет свободную энергию связывания () мономера, включаемого в заданный стерический образец застежки-молнии. .Он использует явное моделирование воды для создания координатной траектории, а затем использует метод молекулярной механики / обобщенной площади поверхности Борна [52] и анализ нормального режима (NMA) [53] для вычисления различных энергетических членов в. Мы построили серию стерических паттернов застежек-молний для данного пептида и рассчитали для каждого из них.

Наши результаты количественно подтверждают качественный аргумент, предложенный ранее: конфигурация минимальной свободной энергии соответствует естественному пространственному узору застежки-молнии, обнаруженному в рентгеновской кристаллографии, и молекулярный полиморфизм возможен, когда существуют аналогичные стабильные узоры филаментов.Более того, детальная характеристика отдельных энергетических терминов позволила идентифицировать ключевые взаимодействия, управляющие формированием бислоя: ван-дер-Ваальс (Леннард-Джонс) и гидрофобные взаимодействия вносят наибольший вклад в выбор и стабилизацию стерических моделей застежек-молний. Было идентифицировано, что ключевые остатки в данной пептидной последовательности, вносящие наибольший вклад, находятся в дегидратированной границе раздела между двумя β -листами, что свидетельствует о важности плотной упаковки боковой цепи на границе раздела.После формирования листа β комплементарность формы является основным фактором, определяющим двухслойный узор. Но мы обнаружили, что формирование типа β -листа более подвержено влиянию кинетических факторов. В частности, для коротких пептидов заряженные боковые цепи меняют предпочтение с параллельных β -листов на антипараллельные, что не обязательно является энергетически благоприятным для образования стерической молнии. Поскольку наиболее стабильные узоры филаментов, идентифицированные с помощью нашего метода, хорошо согласуются с соответствующими рентгеновскими структурами, в дополнение к подробным характеристикам энергетики, наш анализ открывает возможность прогнозирования перекрестной структуры шипов β и полиморфизма, образованного короткими пептидами в атомистическая точность.

Результаты

Мы протестировали пять различных пептидных последовательностей: 1) GNNQQNY из дрожжевого приона Sup35, 2) NNQQ, более короткое производное GNNQQNY, 3) VEALYL из инсулина, 4) KLVFFAE из сегмента 16–22 остатков A β пептид и 5) STVIIE, de novo , сконструированный сегмент, образующий амилоидные филаменты [54] (Таблица 1). Рентгеновские структуры существуют для первых трех с идентификаторами PDB: 1YJP (GNNQQNY), 2ONX и 2OLX (NNQQ) и 2OMQ (VEALYL) [26], [27]. Для филамента KLVFFAE существует твердотельная структура ЯМР [22].С другой стороны, нет доступных экспериментов, определяющих атомистическую структуру нити STVIIE, в то время как моделирование указывает на предпочтение антипараллельного β -листа [54]. Нити, изготовленные из этих пептидов, включают как параллельные, так и антипараллельные β -листы, и они имеют разные стерические узоры «застежки-молнии». Таким образом, они покрывают хороший спектр филаментных структур. Мы применили к этим системам процедуру, представленную на рис. Отметим, что мы не использовали рентгеновские структуры для моделирования и моделирования, но явный расчет свободной энергии связи позволил нам выбрать наиболее стабильные β -листовые двухслойные структуры среди протестированных, которые достаточно точно соответствовали рентгеновским структурам. .

Рисунок 1. Обзор процедуры моделирования и анализа.

Исходя из пептидного мономера, мы сконструировали кандидатные β -листовые двухслойные структуры. Моделирование молекулярной динамики (МД) как мономера, так и бислоев было выполнено сначала в неявном растворителе для релаксации исходных структур, а затем в явной воде для создания точной траектории. Первые 1,1 нс явного моделирования воды были фазой нагрева и уравновешивания. Оставшийся производственный цикл при 300 К продолжительностью от 2 до 6 нс был использован для расчета ΔG _bind с помощью обобщенной модели сольватации Борна (Великобритания) [52] и анализа нормального режима (NMA) [53].Длительные подготовительные циклы в неявном растворителе и уравновешивание в течение 1 нс в явной воде привели большинство двухслойных структур в довольно стабильные состояния, так что профиль ΔG _bind не сильно отличался на протяжении всего производственного цикла, что было более заметным. для нативных структур (см. рис. S1 и S4 – S8).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000492.g001

Для расчета свободной энергии мы рассматриваем только состояния до и после ассоциации [49] — [51], а не учитываем координаты реакции, участвующие в ассоциации. процесс.Этот подход вычислительно эффективен и полезен для изучения макромолекулярных сборок по сравнению с другими более дорогостоящими методами [55]. Этот метод сочетает явное моделирование воды для создания точных структур и обобщенную модель Борна с простой моделью континуального растворителя SWitching (GBSW) [52] для эффективной начальной релаксации структуры и расчета свободной энергии сольватации по координатной траектории явной воды. моделирование (рис. 1; см. Методы). Энтропийный вклад колебательных мод молекулы был рассчитан с помощью NMA [56].

Возможные двухлистные узоры

GNNQQNY и NNQQ образуют параллельные β -листы, в то время как VEALYL, KLVFFAE и STVIIE образуют антипараллельные β -листы. Поскольку эксперименты показали, что двухслойный слой из β -листов с дегидратированной границей раздела между двумя листами является основным строительным блоком нитевидных агрегатов [26], [27], мы рассмотрели возможные двухслойные структуры, образованные двумя идентичными β -листами.

В случае параллельных β -листовых бислоев мы построили десять возможных паттернов (рис.2). Схемы именования этих нитей: F / B (передняя / задняя): боковые цепи с четным (передним) или нечетным (задним) номерами, скрытые в бислое, P / A (параллельные / антиблокировочные). -параллельно): относительное направление между пептидами в двух листах. 1 / 2 : два варианта регистрации боковой цепи в стерической застежке-молнии. FFP и BBP не имели 1 или 2 из-за симметрии вращения относительно оси нити.

Рис. 2. Десять возможных двухслойных шаблонов β -листов параллельных β -листов.

(A) GNNQQNY и (B) NNQQ. Ось филамента вертикальна, а верхний / нижний слои представлены темными / светлыми стрелками, где каждая стрелка представляет один пептид. Вверху слева на (A): вид сбоку одного пептида GNNQQNY с четными / нечетными боковыми цепями желтого / красного цвета, который определяет переднюю / заднюю грани параллельного β -листа. Внизу справа на (A): релаксация BBA1 после MD (аксиальный вид; см. Рис. 5).

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000492.g002

Точно так же мы построили девять кандидатов двухслойных паттернов, образованных двумя идентичными антипараллельными β -листами (рис. 3 и 4). Для одного антипараллельного листа β есть две возможности: либо сторона листа β , состоящая полностью из четных или нечетных остатков ( Areg ), либо они чередуются и появляются на обеих сторонах ( Ainv ) [28]. VEALYL (KLVFFAE) имеет два возможных паттерна Areg (Ainv) со сравнимым количеством водородных связей основной цепи между соседними пептидами в пределах β -листа, который мы различаем по 1 и 2 (рис.3). Итак, существует шаблонов β -листов для Ainv, Areg1 и Areg2 для VEALYL и Ainv1, Ainv2 и Areg для KLVFFAE. При формировании бислоя рисунок Ainv может быть либо симметричным ( P ), либо антисимметричным ( A ) относительно поворота на 180 ° вдоль оси нити. Кроме того, как и в параллельном β -листе, существует два варианта реестра боковой цепи в дегидратированном интерфейсе бислоя AinvP: 1 и 2 .

Рисунок 3. Реестр пептидов на одном листе β , рассматриваемом в данном исследовании.

Шаблон параллельной регистрации (Preg) максимизирует количество водородных связей основной цепи (зеленые линии) в (A) и (B). Имеется сопоставимое количество водородных связей основной цепи в антипараллельных β -листах, показанных на (C) и (D). Цветовые коды такие же, как на рис. 2.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000492.g003

Одна потенциальная проблема с конструированием β -листовых двухслойных филаментов заключается в ориентации боковых цепей. Как только пептид находился внутри β -листа, его боковые цепи не могли легко вращаться при моделировании при 300 К, особенно те, которые находятся в дегидратированной поверхности раздела.Это затрудняет поиск правильной ориентации боковых цепей. Например, в структуре 1YJP GNNQQNY есть боковые водородные связи через N2, Q4 и N6 в дегидратированной границе раздела. Однако при более высокой температуре боковые цепи легко поворачиваются, чтобы найти свою нативную ориентацию. Мы проверили это, построив небольшой бислой BBA1, состоящий из 2 пептидов GNNQQNY на каждом листе, и выполнили моделирование 2,5 нс в неявном растворителе при 350 К при периодическом граничном условии (PBC; см. Методы).Боковые цепи, скрытые внутри бислоя, легко вращались, образуя надлежащие водородные связи. Поскольку амилоидогенные пептиды обычно имеют полярные боковые цепи, поэтому желательно сначала выполнить быстрый прогон высокотемпературной релаксации для небольшого двухслойного слоя β и построить более крупные системы с использованием релаксированной структуры.

Обратите внимание, что 10 параллельных и 9 антипараллельных β -листовых двухслойных шаблонов, которые мы рассмотрели, не полностью включают все возможности. Однако они представляют собой основные наборы вероятных β -листовых бислоев с точки зрения упаковки боковых цепей и водородных связей основной цепи.Эти шаблоны охватывают восемь классов моделей стерических застежек-молний, ​​предложенных Sawaya и др. [27] (Таблица S1).

Конфигурация минимальной свободной энергии GNNQQNY соответствует рентгеновской структуре

После конструирования бислоя пептиды находились в расширенных конформациях, которые впоследствии релаксировали во время МД-моделирования (, например, , рис. 2A, внизу; рис. 5. Во время производственного цикла GNNQQNY в течение 4 нс почти все структуры сохраняли целостность β -листы и дегидратированные границы раздела: межслоевое расстояние колебалось не более чем на 0.25 Å, за исключением FBA2, листы которого разделены, и FBP1, который показал значительные колебания (фиг. 6A). Для тех, у кого было небольшое среднеквадратическое отклонение (RMSD) атомов от структуры в начале производственного цикла (рис. 6B), RMSD достигло примерно стабильных значений примерно через 1 нс, что в большинстве случаев было менее 1,5 Å. . Напротив, в предыдущих моделях менее стабильные конфигурации β -листов легко разрушались в течение нескольких наносекунд [33], [37]. Это моделирование проводилось при 330 К, а цикл уравновешивания был коротким, 50 пс.С другой стороны, наши симуляции проводились при 300 K, и перед производственным циклом мы выполнили 2 нс MD в неявном растворителе GBSW, а затем 1 нс уравновешивание в явной воде, чтобы позволить боковым цепям в бислое собрать столько же насколько возможно. PBC обеспечивает дополнительную стабильность, предотвращая воздействие реактивного водорода и кислорода основной цепи [40]. Тем не менее, мы наблюдали, что ненативные двухслойные структуры имеют более высокую свободную энергию связывания, чем нативная конформация.

Рис. 6. Целостность двухслойных образцов β -листов во время производственного цикла.

(A) Расстояние между β -листами в бислое. (B) RMSD атомов C _α из первого снимка. Во время моделирования не диссоциировала ни одна нить, за исключением FBA2. Расстояние между β -листами определялось расстоянием между плоскостью аппроксимации методом наименьших квадратов, охватываемой атомами C _α в одном слое, и центром масс C _α атомов в другом слое. .

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1000492.g006

В первом наборе моделирования мы зафиксировали межпептидное расстояние ( d ; Таблица 1) в ходе моделирования, наложив PBC (см. Методы). Среди возможных паттернов BBA1 имел наименьшее значение, при этом разница от следующего наименьшего значения составляла 1,11 ккал / моль (; K. Свободная энергия измерялась в расчете на пептид) (фиг. 7A, светлые кружки). BBA1 соответствует рентгеновской структуре; хотя изначально он был построен из плоских β -листов (рис.2A, внизу), RMSD тяжелых атомов из 1YJP было довольно небольшим, в среднем 1,18 Å. Водородные связи между полярными боковыми цепями на сухой границе раздела (N2, Q4 и N6) также наблюдались, как и в 1YJP. Единственное существенное различие заключалось в ориентации боковой цепи N3 (фиг. 8A, стрелки). В 1YJP он указывает на Q5 для образования водородной связи боковой цепи. Однако N3 и Q5 подвергаются воздействию воды и будут оставаться сольватированными по отдельности, поэтому водородная связь N3-Q5, вероятно, является артефактом кристаллизации в 1YJP. Фактически, даже когда мы наложили водородную связь боковой цепи N3-Q5 в исходную структуру, она разорвалась, и боковая цепь N3 повернулась в другую сторону во время моделирования.

Рис. 7. Профили свободной энергии параллельных β -листов (GNNQQNY и NNQQ).

(A) Открытый / сплошной круг: расчет на основе MD с / без PBC на оси нити накала. Открытый край в корпусе без PBC повышает общий уровень энергии. (B) В случае, когда межпептидное расстояние d было отрегулировано, мы использовали динамику CPT для поддержания постоянного давления, в то время как осевая длина симуляционного бокса колебалась. Планки погрешностей на всех графиках обозначают стандартные отклонения.Значения отдельных энергетических терминов приведены в таблицах 2 и S2.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000492.g007

Рис. 8. Сравнение между структурами PDB (прозрачная трубка) и кандидатами, похожими на нативные (каркас).

Снимки через 2 нс производственного цикла использовались для сравнения с рентгеновскими кристаллографическими координатами. (A) GNNQQNY, (B) VEALYL и (C) NNQQ.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000492.g008

Чтобы проверить надежность выбора BBA1, мы провели дополнительные тесты.Профиль, усредненный локально за интервалы в 1 нс, показал устойчивую тенденцию (рис. S1A). Хотя менее стабильные или ненативные паттерны имели немного больше вариаций в локальном усреднении с течением времени, большинство паттернов сохраняли свои структурные состояния, и выбор BBA1 ясен с начала производственного цикла (см. Рис. S4). Вероятно, это связано с длительным первоначальным подготовительным моделированием и применением упомянутой выше PBC.

Мы также повторили моделирование для наиболее и умеренно стабильных паттернов (BBA1 и FFA1) с размером системы 20 пептидов вместо 12, что не привело к существенной разнице (таблица 2).Среди других пептидов, которые мы тестировали, хотя относительную стабильность между несколькими образцами нельзя было отличить, использование 12 пептидов дало в целом удовлетворительный результат. Обратите внимание, что вычислительные затраты резко возрастают с увеличением размера системы, поскольку существует несколько шаблонов для тестирования данного пептида, и NMA также имеет сильную зависимость от размера.

Чтобы проверить эффект спирального скручивания [36], а также обнаженного края, мы выполнили дополнительное моделирование методом МД двухслойных кандидатов β -листов без PBC вдоль оси нити.Все бислои не диссоциируют и не развивают кривизну, хотя небольшой размер системы затрудняет определение их шага спирали. BBA1 все еще оставался наиболее стабильным (рис. 7A, закрашенные кружки). Вариация энергии из-за изменений спирального закручивания меньше, чем у различных супрамолекулярных паттернов упаковки [46], поэтому плоская двухслойная структура под PBC может использоваться для различения относительной стабильности среди возможных паттернов. Также обратите внимание, что разница в свободной энергии между BBA1 и остальными больше без PBC (рис.7A), что указывает на то, что менее стабильные структуры больше страдают от краевого эффекта.

Полиморфизм бислоев NNQQ-листа

В отличие от 1YJP, который имеет один доминирующий минимум энергии, при наличии нескольких минимумов с аналогичной стабильностью возможен молекулярный полиморфизм. В качестве теста мы применили настоящий подход к пептиду NNQQ, который имеет две рентгеновские структуры, различающиеся паттернами упаковки β -листов с четкими гранями, образующими дегидратированные интерфейсы, и различным межпептидным расстоянием, d [27].Построение β -листовых бислоев (рис. 2B), моделирование методом МД и расчет проводились по той же процедуре, что и для GNNQQNY. Паттерны-кандидаты были протестированы под PBC в двух различных наборах моделирования с межпептидными расстояниями в пределах β -листа, Å (2ONX) или 4,92 Å (2OLX) (обратите внимание, что d не изменяется под жестким PBC; см. Методы).

Когда Å, FFA1 был наиболее стабильным образцом, хотя нативным образцом был FBA1 с небольшой разницей в 0,66 ккал / моль.(Рис. 7B и Таблица S2). Это можно объяснить взаимодействием двух двухслойных слоев β -листов. В случае 1YJP обезвоженная стерическая застежка-молния образуется только между β -листами в шаблоне BBA1, в то время как снаружи находятся молекулы кристаллической воды. Однако как в 2OLX, так и в 2ONX кристаллическая вода отсутствует, и обе стороны двухслойного слоя β -листа образуют дополнительную стерическую поверхность раздела «застежка-молния» с соседними листами. В случае FBA1 он может повторяться, создавая ламинированный кристалл.Но когда две нити FFA1 накладываются друг на друга, они должны образовывать BB-узор между ними; BBP, BBA1 или BBA2 (рис. S2). Наш расчет показывает, что BBA2 является наиболее стабильным среди BB-паттернов. Поэтому, а не по отдельности, среднее значение для FFA1 и BBA2 следует сравнивать со средним значением для FBA1, где первое среднее значение на 0,48 ккал / моль выше. Хотя это согласуется с выбором FBA1 в 2ONX, разница в энергии уже, чем тепловая энергия при 300 К (ккал / моль).

При Å тремя наиболее стабильными образцами были FFA1 (-5.23 ккал / моль), FBA1 (ккал / моль) и BBA1 (-4,35 ккал / моль). Нативными образцами являются BBA1 и FBA1, среднее значение которых всего на 0,44 ккал / моль (0,73) выше, чем у FBA1. Такая неопределенность предположительно связана с симметричной последовательностью NNQQ, которая имеет одинаковые боковые цепи в одинаковом порядке на обеих сторонах. В соответствии с нашим результатом, ab initio расчет показал аналогичную стабильность двух кристаллических решеток [57].

Дополнительное моделирование подтверждает вышеуказанный результат.Чтобы позволить системе выбрать межпептидное расстояние d вместо его фиксации путем наложения жесткого ПБЦ, мы использовали динамику постоянной температуры и давления (CPT), где размеры симуляционного бокса были параллельны и перпендикулярны оси филамента. контролируемый, чтобы поддерживать давление на уровне 1 атм, в то время как PBC все еще поддерживался. Усредненные за 2 нс производственный цикл, значения d соответствовали значениям для кристаллических структур: Å ( см, Å), Å и Å ( см., Å). Первой и второй низшими конфигурациями были FFA1 и FBA1, соответственно, что соответствовало результатам с жесткой PBC (рис. 7B). FBA1 имел значение ниже среднего между FFA1 и BBA1 на 0,88 ккал / моль, что опять же сравнимо с. Для случая, когда паттерны FF и BB чередуются (рис. S2), мы обнаруживаем, что FFA1 более стабильна, чем BBA1. Таким образом, бислой FFA1 может формироваться первым, который впоследствии складывается, образуя BB-интерфейс.

Как и в случае GNNQQNY, наиболее стабильные β -листовые двухслойные структуры NNQQ точно следовали таковым для соответствующих рентгеновских структур.RMSD тяжелых атомов между структурой FBA1 в конце производственного цикла и 2ONX составлял 2,07 Å (жесткий PBC) и 1,85 Å (CPT), а RMSD между 2OLX и BBA1 и FFA1 в среднем составлял 1,89 Å (жесткий PBC). и 2,0 Å (CPT) (рис. 8C).

Собственные антипараллельные узоры волокон VEALYL

Наш подход оказался эффективным также при расчете антипараллельных волокон β -листов. Из девяти рассмотренных паттернов-кандидатов (Рис. 4A) наиболее стабильной конфигурацией для VEALYL был нативный AinvP2, со вторым самым низким Areg1BB на 1.00 ккал / моль (фиг. 9A; таблица S3). Как объяснено в Обсуждении, выбор Ainv вместо шаблона Areg также может быть вызван электростатикой на ранних стадиях сборки, поскольку отрицательно заряженные боковые цепи E2 находятся дальше друг от друга в листе Ainv. Тяжелые атомы филамента AinvP2 имели RMSD 2,73 Å от 2OMQ (рис. 8B). RMSD между другими образцами волокон и 2OMQ были значительно больше, , например. , AinvP1 имеет 6,04 Å, а Areg1BB — 9,10 Å. Кроме того, RMSD изначально расширенной структуры AinvP2 до MD составлял в среднем 3.25 Å от 2OMQ, что позволяет предположить, что структура AinvP2 действительно приблизилась к рентгеновской структуре после MD, в достаточной степени отличимой от других структур. Как и в GNNQQNY, расчет интервалов более 1 нс подтвердил, что профиль свободной энергии по разным схемам установился почти с начала производственного цикла (рис. S1 и S5).

Предсказание неизвестных двухлистных структур KLVFFAE и STVIIE

Поскольку мы смогли идентифицировать двухслойные структуры для пептидов с известными кристаллическими структурами, мы применили наш метод к двум пептидам KLVFFAE и STVIIE, атомистические β -листовые двухслойные структуры которых в настоящее время неизвестны.Для KLVFFAE (A) мы протестировали pH 7,0 и 2,0, при которых пептид самособирается в волокна и нанотрубки соответственно [48]. При pH 7,0 наш расчет показал, что AregFF является наиболее стабильной конфигурацией, с разницей 0,81 ккал / моль в следующей самой низкой конфигурации AregBB (фиг. 9B, фиг. 10 и таблица S4). Поскольку разница незначительна, как в случае NNQQ (рис. S2), AregFF и AregBB могут складываться друг с другом, образуя ламинированное волокно. Ранее AregFB был предложен как нативный β -листовой двухслойный паттерн [48], где моделирование проводилось для 0.8 нс и осевой сдвиг d /2 между двумя слоями (см. Методы) не реализован. Их основным критерием выбора двухслойного рисунка было расстояние между слоями, которое соответствовало пику дифракции рентгеновских лучей в волокне 9,9 Å. Если использовать среднее расстояние между атомами в остатках с четным или нечетным номером в качестве межслоевого расстояния, использованного в [48], мы получим в среднем 9,9 Å (AregBB), 10,9 Å (AregFF) и 9,5 Å ( AregFB), где последнее значение меньше, чем из расчетов в [48], возможно, из-за более длительных периодов релаксации и осевого сдвига d / 2 в нашем случае.Хотя наш результат в пользу паттернов AregFF отличается от паттерна AregFB, предложенного в [48], по крайней мере, выбор паттерна Areg согласуется с существующими данными твердотельного ЯМР [22]. Необходимы дальнейшие эксперименты, чтобы прояснить структурный отбор и атомное происхождение пика 9,9 Å.

Однако при соблюдении усредненных значений за интервалы в 1 нс при pH 7,0 энергии Ainv2P1 и Ainv2P2 значительно снизились со временем, почти до самых низких уровней (рис. S7).Чтобы дополнительно проверить, связано ли это с каким-либо эффектом конечного размера, мы провели дополнительное моделирование на Ainv2P1, Ainv2P2 и AregFF, используя 10 пептидов на β -лист, где производственный цикл длился 4 нс. Исходя из этого, Ainv2P1 и Ainv2P2 стали даже более стабильными по сравнению с AregFF (Таблица S4). Как объяснено в Обсуждении, хотя бислой Ainv на самом деле может быть более стабильным, чем образец Areg, последний может быть кинетически выбран на уровне одного листа.

Напротив, при pH 2,0 доминирующим минимумом свободной энергии был Ainv1A (рис.9Б), что хорошо согласуется с результатом [48]. В случае STVIIE кандидатные β -листовые двухслойные конфигурации были аналогичны таковым для VEALYL (фиг. 3C и 4A). Мы обнаружили, что паттерн Areg2FF был самым низким на (фиг. 9C, 10 и таблица S5). Выбор снова был четким, так как следующий по стабильности Areg1BB был на 2,0 ккал / моль выше в.

Обсуждение

Настоящие результаты предполагают, что свободную энергию связывания можно использовать для идентификации фактической двухслойной структуры перекрестного β , в которую собирается пептид.Мы обнаружили, что полиморфизм возможен, когда существуют аналогично стабильные структуры [18]. Однако наши результаты не исключают возможность того, что структура может быть выбрана кинетически на ранних стадиях сборки по сравнению с структурами с меньшим, более чем: если ядро ​​для кинетически захваченной структуры достаточно стабильно, чтобы сохраняться и расти в филаменты [28], любое изначальное предубеждение может привести к его доминированию. Как поясняется ниже, анализ отдельных энергетических составляющих обеспечивает дальнейшее понимание того, как различные взаимодействия могут действовать на различных стадиях структурной эволюции от ранних олигомеров до зрелых фибрилл.

Движущие силы для выбора конструкции

Связывающая свободная энергия () состоит из членов, определенных в формуле. 9, которые можно разделить на несвязанные энергетические (), внутримолекулярные () и энтропийные () вклады. состоит из (1) где и — соответственно энергии гидрофобного и электростатического экранирования. Сравнение энергетических членов показывает, что преобладает над энтропийным вкладом (таблица 2 для GNNQQNY и таблицы S2 – S5 для других пептидов). Это говорит о том, что пептид не становится внутренне напряженным или расслабленным (маленьким), и он теряет лишь небольшое количество колебательной энтропии при включении в двухслойный слой β : двухслойная структура определяется преимущественно несвязанными взаимодействиями.

Затем мы сравнили четыре члена в уравнении. 1 среди кандидатов двухслойных паттернов. Для GNNQQNY и вносит большой вклад в подобный нативному шаблону BBA1 по сравнению с другими, в то время как для BBA1 в и нет особого предпочтения (Таблица 2). Отсутствие заряженных боковых цепей в GNNQQNY объясняет небольшую роль электростатических взаимодействий (). В отличие от типичных амилоидогенных пептидов, GNNQQNY имеет только полярные боковые цепи, так что гидрофильный эффект, опосредованный окружающей оболочкой молекул воды, может играть важную роль в первоначальном превращении этих пептидов в рыхлые агрегаты, как в сборке коллагена [58], [58], [ 59].Однако, поскольку молекулы воды между двумя листами β в конечном итоге вытесняются, гидрофильный эффект, в том числе, не является решающим для определения реестра боковой цепи на границе стерической застежки-молнии. Следовательно, хотя гидрофобные и ван-дер-ваальсовы силы могут не управлять индивидуальными пептидами в начальной агрегации, они должны быть важны в окончательном выборе структуры перекрестного β , где боковые цепи внутри двухслойной упаковки путем установления прямых контактов.

Для VEALYL все три термина, за исключением обычно, отдают предпочтение нативному шаблону AinvP2 (Таблица S3).Антипараллельный обратный лист β (Ainv), возможно, был предпочтительным, поскольку он имеет один заряженный остаток (E2), размещенный поочередно на двух сторонах листа β , что также наблюдалось для KLVFFAE при pH 2,0. . Однако это не жесткое правило, поскольку STVIIE предпочитает Areg2FF. В листе STVIIE β типа Ainv ряды боковых цепей образованы T2 – I5 и V3 – I4. Из-за большого размера боковой цепи Ile по сравнению с таковыми у T2 и V3, обе стороны листа Ainv β являются неровными, что неблагоприятно для формирования стерической молнии.В отличие от этого, шаблон Areg2FF имеет ряд боковых цепей V3 из каждого слоя в ядре плотно сформированного стерического интерфейса «застежка-молния» (см. Ниже). Для NNQQ не было особого предпочтения нативным паттернам ни в одном из четырех энергетических терминов (Таблица S2). Поскольку две стороны параллельного листа NNQQ β имеют идентичные боковые цепи, они почти с равной вероятностью образуют стерические границы раздела молний, ​​а нативные полиморфные узоры (BBA1 + FFA1 и FBA1) предпочтительны только благодаря сумме всех энергетических терминов. .

Энергетика мономерной монослойной иерархии бислоя

Наблюдение, что ван-дер-Ваальсовы и гидрофобные взаимодействия играют главную роль в выборе двухслойного рисунка, подразумевает, что взаимодействия между боковыми цепями, образующими обезвоженную стерическую застежку-молнию, а не между теми, которые подвергаются воздействию воды, являются основными структурными детерминантами. В качестве дополнительного теста мы проанализировали изменения свободной энергии от мономера к одному листу β , а затем к бислою β -листов для нативного образца (рис.11). Хотя сборка от мономера до бислоя, вероятно, происходит несколькими сложными путями, анализ свободной энергии одного β -листа иллюстрирует роль стерической застежки-молнии для стабилизации бислоя. Мы оценили свободную энергию связи монослоя β -листа, игнорируя один слой β -листа в траекториях моделирования двух слоев. Поскольку мы используем модель континуального растворителя для расчета свободной энергии, эффект сольватации правильно учитывается даже для грани, которая изначально находится в двойном слое.Аналогичным образом, в предыдущем исследовании свободная энергия мономера в димере белка оценивалась без учета другого мономера, но полученная свободная энергия была сопоставима с величиной, рассчитанной на основе моделирования изолированного мономера [51]. Напротив, МД-моделирование одного Preg β -листа GNNQQNY (рис. 3) показало сильную тенденцию к скручиванию и стало нестабильным под воздействием PBC. В то время как другие одиночные β -листы могут быть более стабильными, мы не исследовали это дополнительно, поскольку это не было необходимо для наших расчетов, и наше основное внимание было уделено двухслойной нити β -листов как основному строительному блоку предполагаемых амилоидных фибрилл экспериментально [3], [27].

Рис. 11. Изменение свободной энергии, сопровождающее образование естественного бислоя.

По оси ординат в единицах ккал / моль. (A) BBA1 GNNQQNY, (B) FFA1 (d = 4,92Å) NNQQ, (C) AinvP2 VEALYL, (D) AregFF (антипараллельный, черный), Ainv2P2 (антипараллельный, синий) и FFA1 (параллельный, красный) KLVFFAE при pH 7, (E) Areg2FF STVIIE и (F) Ainv1A KLVFFAE при pH 2. Круг: Δ E _vdW , треугольник: Δ G _hp , квадрат : Δ E _intra и обратный треугольник: Δ E _elec + Δ G _screen .

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000492.g011

Для всех протестированных пептидов энергия Ван-дер-Ваальса () была уменьшена больше всего от мономера до одного β -листа, а затем до исходного двухслойный. Вторая — гидрофобная энергия () (рис. 11). С другой стороны, и (полное электростатическое взаимодействие) изменилось незначительно, за исключением KLVFFAE при pH 7,0. Поскольку две заряженные боковые цепи K1 и E7 лежат на одной стороне KLVFFAE, формированию антипараллельного регистра β -листа может способствовать электростатическое взаимодействие, приводящее к паттерну AregFF (Таблица S4).В разделе «Возможность иерархического выбора паттернов в KLVFFAE» мы обсуждаем, как паттерн AregFF может быть кинетически предпочтительнее других потенциально более стабильных паттернов, таких как Ainv.

Важность боковых цепей, формирующих стерический интерфейс «застежка-молния»

Вклад каждого остатка также поддерживает то, что боковые цепи на границе стерической молнии играют большую роль по сравнению с теми, которые подвергаются воздействию воды. Для BBA1 GNNQQNY профиль на основе остатков соответствует его среднему B-фактору в 1YJP (рис.12А). Наибольший вклад вносит Q4, расположенный в центре стерической молнии, за которым следует N2, что свидетельствует об их стабилизирующей роли. Остатки с нечетным номером, обращенные к воде, имеют сравнительно больше. Для G1 он самый высокий, поэтому он играет минимальную стабилизирующую роль. Это согласуется с сходством между 1YJP и структурой без G1 (NNQQNY, PDB ID: 1YJO) [26]. Сходные тенденции наблюдались для NNQQ и KLVFFAE, где боковые цепи между бислоем имели больший вклад в (фиг. 12B и C).

Рис. 12. Вклад остатков в ΔGNB.

(A) BBA1 для GNNQQNY (открытый квадрат и открытый перевернутый треугольник) и GNNAQNY (сплошной квадрат и сплошной перевернутый треугольник), где данные для черного квадрата и красного перевернутого треугольника основаны на энергии мономера, рассчитанной по стандартной процедуре на рис. 1, и моделированием REMD соответственно. Синий сплошной кружок: средний B-фактор каждого остатка в структуре 1YJP. По сравнению с Q4, A4 имеет более высокий Δ G _NB по сравнению с другими остатками.На вставке показано поперечное сечение нити Q4A после моделирования, что указывает на хорошо сформированный стерический интерфейс «застежка-молния». (B) FBA1 (d = 4,85Å) NNQQ. Квадрат (кружок) представляет каждый остаток в верхнем (нижнем) слое β -листа, а N1 отмечен на рисунке, чтобы различать направление пептидов. (C) AregFF из KLVFFAE.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000492.g012

Чтобы лучше понять важность взаимодействий боковых цепей в двухслойном интерфейсе, мы протестировали бислой BBA1, образованный мутантом Q4A (GNNAQNY).При сравнении паттернов, образованных различными пептидами, следует проявлять осторожность, поскольку существует неопределенность в абсолютной величине свободной энергии мономеров. Для ясности, мы выполнили два разных типа моделирования мономера (см. Методы): моделирование мономера за 1,6 нс в явной воде при 300 К, как используется для большинства систем (рис. 1), и молекулярная динамика с обменом репликами (REMD). в неявном растворителе GBSW, с общим временем моделирования 1,6 µ с. В обоих случаях пептиды сохраняли в основном α -спиральную конформацию (методы; см.также рис.S9). Тем не менее, были различия в расчетной энергии мономера, что привело к тому, что образец BBA1 мутанта Q4A имел на меньше, чем у GNNQQNY, на 2,6 ккал / моль, когда использовалось моделирование мономера, как на рис.1, но на выше. на 3,91 ккал / моль, когда REMD использовался для расчета энергии мономера. Как упоминалось выше и дополнительно пояснялось в Методах, из-за неопределенности в вычислении абсолютной величины свободной энергии мономера трудно сделать вывод, образует ли мутант Q4A более или менее стабильный бислой BBA1.Однако, по сравнению с Q4 в GNNQQNY, A4 в GNNAQNY явно имеет пониженный стабилизирующий вклад (повышенная энергия на остаток) по сравнению с другими остатками в пептиде (фиг. 12A), что согласуется с результатом в Ref. [37] о дестабилизирующем действии мутации Q4A. Тем не менее, среднее расстояние между слоями бислоя Q4A составляло 7,56 Å, что было уже, чем у структуры BBA1 GNNQQNY (9,25 Å). Вероятно, это связано с тем, что боковая цепь Ala меньше, чем боковая цепь Gln, что делает мутант Q4A более предпочтительным для образования более плотной стерической «молнии».

В качестве дополнительного теста для GNNQQNY и GNNAQNY мы взяли структуры после производственного цикла, оставили по 4 пептида в каждом слое и выполнили явное моделирование воды при 330 K с уравновешиванием 1 нс с последующим производственным циклом 4 нс без навязывания КПБ. В обеих нитях разрыва не наблюдалось, что противоречит результату [5]. [37], где мутантный бислой Q4A того же размера показал сильную дестабилизацию при 330 К. Это предполагает, что тестирование относительной стабильности среди филаментов-кандидатов с использованием МД моделирования при повышенных температурах не гарантирует, что наиболее стабильный из них выживает дольше всех.Из-за конечного (и обычно небольшого) размера системы тепловое разрушение является случайным событием, поэтому даже самая стабильная модель может сломаться раньше, чем менее стабильная, что особенно важно, когда разница в стабильности небольшая. И наоборот, как широко наблюдается в настоящем исследовании, менее стабильные волокна могут не сломаться за конечное время моделирования. Для более надежного теста стабильности необходимо статистическое среднее значение по большому количеству симуляций для данного двухслойного рисунка, что потребовало бы больших вычислительных затрат.Наш подход, с другой стороны, использует одну траекторию моделирования для каждой модели и дает вклады в свободную энергию от отдельных остатков. Хотя он не может точно предсказать, предотвратит ли данная точечная мутация образование фибрилл, он количественно показывает, как мутировавший остаток изменяет свой вклад. Наш результат допускает возможность сборки мутанта Q4A в двухслойный филамент, перекрестно β , независимо от того, является ли мутантный филамент более или менее стабильным по сравнению с исходным бислоем GNNQQNY.Необходимы дальнейшие эксперименты для выяснения амилоидогенной предрасположенности Q4A.

В целом, наш анализ подчеркивает важность формирования плотной стерической границы раздела «молния» при выборе и стабилизации двухслойного рисунка. Благоприятное ван-дер-ваальсово взаимодействие проистекает из тесного взаимодействия боковой цепи внутри листа β , а также между двумя слоями β -листа. Более того, открытая для растворителя площадь поверхности каждого β -листа уменьшается за счет образования стерической границы раздела «молния» [3].Для листов β с разными боковыми цепями было бы трудно сформировать тугую стерическую застежку-молнию, которая требует комплементарности формы между двумя интерфейсами. Это согласуется с тем фактом, что, хотя амилоидные фибриллы могут образовывать широкий диапазон аминокислотных последовательностей [60], каждая фибрилла состоит из пептидов с одинаковой или подобной последовательностью [61].

Выбор между параллельными или антипараллельными листами

В стерической молнии ряд боковых цепей на листе вдоль нити заполняет канавку, образованную между двумя рядами боковых цепей на противоположном листе.Такая упаковка была бы проще, если бы боковые цепи, образующие ряд, были бы идентичны или похожи по форме, поскольку в этом случае канавка будет представлять собой гладкую поверхность раздела. С точки зрения формирования стерической молнии, таким образом, будет преимуществом параллельный лист β , который также имеет лучшие контакты боковых цепей в ряду боковых цепей по сравнению с антипараллельным листом β , как предлагается. ранее [62]. Напротив, как видно в VEALYL, KLVFFAE и STVIIE, присутствие заряженных боковых цепей способствует антипараллельному β -листу из-за электростатических взаимодействий.Действительно, среди 15 кристаллических структур перекрестных β шипов, опубликованных в [26], [27], [63], 11 являются параллельными β -листами, ни один из которых не имеет заряженных остатков. Среди 4 антипараллельных β -листовых структур LYQLEN и VEALYL имеют заряженные остатки. Остальные 2 антипараллельные β -листовые структуры представляют собой полиморфные формы пептида MVGGVV. Хотя MVGGVV не имеет заряженного остатка, у него нет недостатка в образовании стерической молнии между антипараллельными β -листами, упомянутыми выше: идентичные боковые цепи V2 и V5 могут складываться боком в антипараллельном β — лист и два последовательных глицина обеспечивают достаточно места для расположения боковой цепи, что также может иметь отношение к его полиморфизму.

Возможность иерархического выбора шаблона в KLVFFAE

Как видно из результатов (Таблица S4), KLVFFAE имел два класса двухслойных конфигураций β -листов с самой низкой свободной энергией, которые были сформированы соответственно с помощью монослойных структур Ainv2 и Areg (Рис. 3D). Хотя паттерны Ainv2 могут быть сравнительно стабильными на уровне бислоя, в качестве монослоя Areg составляет 1,84 ккал / моль (6-мер на слой) или 0,78 ккал / моль (10-мер на слой) на ниже, чем на , чем у Ainv2 ( ср., фиг. 11D). Это предположительно связано с благоприятными электростатическими взаимодействиями между заряженными остатками (K1 и E7) в паттерне Арега, что согласуется с предыдущими экспериментальными данными [22], [48]. Это предполагает, что конкретный двухслойный узор β -листов может быть иерархически определен от наиболее предпочтительного монослоя до двухслойного узора.

В качестве дополнительного теста мы рассчитали параллельный паттерн FFA1 ( ср. , рис. 2A), образованный KLVFFAE при pH 7. Можно ясно видеть, что боковые цепи на границе раздела лучше, чем антипараллельные β. -листы (рис.10 в сравнении с рис. S3). Удивительно, но расчетное значение FFA1 составило -39,84 ккал / моль, что на 2,33 ккал / моль на ниже , чем у антипараллельной конфигурации, AregFF. Однако при сравнении монослоев β -листов картина FFA1 на 6,77 ккал / моль выше, чем у AregFF, в основном из-за неблагоприятных электростатических взаимодействий между одинаковыми зарядами в параллельном β -листе (Рис. . 11D). Но когда образуется бислой FFA1, K1 и E7 из противоположных слоев образуют солевые мостики, что приводит к уменьшению электростатического отталкивания.Таким образом, на основе разложения по свободной энергии различных образцов β -листов, можно увидеть, что, хотя параллельные или Ainv-типы β -листов предпочтительны на двухслойном уровне для KLVFFAE при pH 7,0 из-за лучшей стороны При упаковке цепи может существовать кинетический барьер, возникающий из-за сильного электростатического отталкивания на уровне одного листа, что приводит к выбору листа Areg β для образования двухслойного. Однако разница между монослоями Ainv2 и Areg незначительна, особенно при моделировании с 20 пептидами.Таким образом, нельзя исключить возможность молекулярного полиморфизма в KLVFFAE при pH 7,0.

Возможно, что мутантный пептид KLVFFAQ при высоком pH и с многовалентными ионами может собираться в параллельную β -листовую филамент. Поскольку единственный заряженный остаток Lys мутанта нейтрализуется и экранируется, первоначальное электростатическое возбуждение для антипараллельного β -листа может быть подавлено. Однако сильные гидрофобные взаимодействия других остатков могут вызвать коллапс системы на аморфные агрегаты.В таких случаях, уменьшая полярность растворителя, например, , добавляя ацетонитрил, может способствовать формированию β -листов. В любом случае, как только тип β -листа определен, двухслойный узор может быть предсказан с разумной точностью путем их сравнения. Для более длинных пептидов упаковка боковой цепи будет преобладать над электростатическими взаимодействиями, если только она не имеет пропорционально большого количества заряженных остатков. Доступные твердотельные структуры ЯМР амилоидных фибрилл, состоящих из пептидов A β длиной 40 или 42 остатка, действительно параллельны [23], [64] — [66].

Чтобы дополнительно проверить возможность выбора типа β -листа на уровне монослоя, мы рассчитали другие антипараллельные β -листы, KLVFFAE при pH 2,0, VEALYL и STVIIE. Для KLVFFAE при pH 2,0 наиболее стабильным монослоем был Ainv1 с характеристикой ниже, чем у Ainv2 (Areg), на 2,89 (3,61) ккал / моль. Это согласуется с тем, что Ainv1A является наиболее стабильным двухслойным рисунком при pH 2,0 (Таблица S4). Сходным образом, монослой Areg2 STVIIE, образующий наиболее стабильный бислой Areg2FF, имел 1.На 24 ккал / моль ниже, чем в Areg1, который формирует следующий по стабильности бислой Areg1BB (Таблица S5). С другой стороны, монослой Ainv VEALYL (образующий наиболее стабильный бислой; Таблица S3) имел на 1,59 ккал / моль, выше, чем на , чем Areg. Следовательно, хотя обычно наиболее стабильный монослой β -листа может быть использован для образования подобного нативному бислоя, это не является универсальным применимым. Как было обнаружено ранее [28], на структурную эволюцию олигомеров влияют как кинетические, так и энергетические факторы в зависимости от времени конформационной релаксации, а также концентрации пептида.

Роль водородных связей основной цепи

Уже давно предполагается, что водородные связи основной цепи являются основными взаимодействиями при формировании амилоидной перекрестной структуры β [1]. В силовом поле CHARMM энергия водородной связи учитывается суммой электростатических и ван-дер-ваальсовых взаимодействий между частично заряженными донорными и акцепторными атомами водородной связи. Мы разложили, чтобы вычислить энергию водородной связи каждой пары H — O основной цепи, которая в среднем составляет -1.98 ккал / моль для образца BBA1 GNNQQNY и -1,28 ккал / моль для образца AinvP2 VEALYL. Поскольку в нативных конфигурациях GNNQQNY и VEALYL имеется 5–6 водородных связей основной цепи на пептид (рис. 3A), они вносят 24% (18%) GNNQQNY (VEALYL), что действительно является значительной долей. Таким образом, при максимальном увеличении количества водородных связей основной цепи в основном предпочтение отдается листам с регистром β по сравнению с листами без регистра. Однако, поскольку мы сравниваем бислои, образованные регистрируемыми β -листами, которые содержат в основном одинаковое количество водородных связей основной цепи, водородные связи не могут быть основным определяющим фактором для выбора конкретной структуры бислоя.

Заключение

Наш настоящий анализ предполагает тонкие роли, которые играют кинетика и энергия в сборке амилоида. Кинетический захват будет более уместным на ранних стадиях сборки, где определяются основные характеристики, такие как β -листовой тип (параллельный против антипараллельного или Ainv против Areg) [28]. Как только лист β вырастет за пределы размера критического ядра, будет очень трудно изменить каким-либо серьезным образом, например, настроить реестр пептидов внутри листа или переключиться между параллельными и антипараллельными типами.В отличие от изменений, требующих перестройки основной водородной связи основной цепи, выбор типа двухслойного слоя будет происходить на более поздней стадии и в большей степени подлежать энергетическому контролю, поскольку он включает в себя комплементарность формы между двумя гранями, которая обычно не требует образования какой-либо конкретной связи. Отсутствие специфических связей позволит провести конформационный поиск, и оптимальная стерическая упаковка застежки-молнии будет достигнута между двумя небольшими β -листами. Как только такая фибрилла вырастает до большего размера, она будет служить шаблоном для дальнейшего роста, и структурная перестройка на молекулярном уровне маловероятна, как показывают эксперименты [18] — [20].Такой сценарий также согласуется с недавним моделированием агрегации пептида GNNQQNY, где первоначально сформированные параллельные димеры β -листов стабилизируются последующим образованием стерического бислоя «застежка-молния» [67].

Успешное использование свободной энергии связывания на пептид в качестве критерия для выбора стерического рисунка застежки-молнии подтверждает, что двухслойный рисунок определяется энергетически. Молекулярный полиморфизм возможен при наличии двух или более наиболее стабильных паттернов с аналогичными значениями, как это было замечено в NNQQ.Однако наш анализ действителен только тогда, когда данная пептидная последовательность образует бислой β -листов, и он не решает, образует ли пептид перекрестно- β -филамент или нет в определенных буферных условиях, для которых существуют разные подходы. был разработан [42]. Наш подход также не может предсказать необычные перекрестные β структуры, такие как с изгибом (MVGGVV, PDB ID: 2OKZ) [27] или поворотом (NNFGAIL, PDB ID: 3DGJ) [63]. Тем не менее, возможность вычислить свободную энергию связи является значительным достижением, поскольку подробный анализ вклада различных параметров энергии обеспечивает количественное объяснение выбора конкретного стерического рисунка застежки-молнии.Наш подход также может быть полезен для идентификации наиболее вероятной структуры среди множества твердотельных ЯМР-структур [23] или для количественной оценки специфичных для остатков вкладов, которые могут быть терапевтически нацелены на нарушение самосборки.

Методы

Конструирование пептидов

Каждый пептид моделировали в соответствии с экспериментальными условиями, в которых определялись его атомные координаты: GNNQQNY, NNQQ, VEALYL и STVIIE не имели кэпирующего фрагмента на обоих концах [27].Для KLVFFAE N- и C-концы были соответственно ацетилированы и амидированы [4]. Статус протонирования титруемых групп определяли на основании pH соответствующих экспериментов (таблица 1).

Конструкция листов

Тип β -листа и межпептидное расстояние d внутри листа были выбраны, как показано в Таблице 1 и на рис. 3. Два β -листа были собраны вместе, чтобы сформировать двухслойный узор филаментов, с начальным межслоевым расстоянием 10 Å.Затем один слой был сдвинут в осевом направлении на d /2, чтобы максимизировать взаимное расположение боковых цепей между бислоем. Такой сдвиг присутствует в различных рентгеновских структурах [26], [27]. Даже когда мы начали моделирование без осевого сдвига, он появлялся спонтанно после периода нагрева в неявной среде растворителя, независимо от граничного условия, наложенного на ось нити.

Структурная релаксация в неявном растворителе

Для всех симуляций мы использовали CHARMM версии 31 [68] с полностью атомным силовым полем param22.Мы выполнили подготовительное моделирование в среде непрерывного растворителя GBSW, включенной в CHARMM [52], чтобы найти правильную ориентацию боковой цепи. Отсутствие вязкости в GBSW способствует быстрому расслаблению боковых цепей. Первоначально система (либо мономер, либо один из двухслойных паттернов) была релаксирована через 3000 шагов минимизации энергии с использованием принятого базового алгоритма Ньютона-Рафсона (ABNR). Система была нагрета от 0 К до 300 К в течение 60 пс, уравновешивалась при 300 К в течение 1,0 нс, после чего производился цикл 1,0 нс.Расстояние отсечки для несвязанного взаимодействия составляло 24 Å для моделирования GBSW. Окончательный снимок каждого кандидата использовался в качестве начальной структуры для явного моделирования растворителя. Мы наложили PBC на ось филамента, выбрав размер коробки моделирования, параллельный оси филамента, как Nd , где N — количество пептидов на слой.

Явное моделирование молекулярной динамики воды

Окончательная структура, полученная при моделировании неявным растворителем 2,06 нс, была помещена в ромбический ящик, содержащий молекулы воды TIP3, предварительно уравновешенные при 1 атм, 300 К.Удаляли молекулы воды, атомы кислорода которых находились в пределах 2,9 Å от тяжелых атомов бислоя. Расстояние 2,9 Å было выбрано, чтобы гарантировать, что молекула воды не останется внутри бислоя после делеции, тогда как плотность воды поддерживалась постоянным давлением MD. Размер сольватационной коробки был выбран достаточно большим, чтобы предотвратить взаимодействие между нитью и ее изображениями, за исключением случаев, когда PBC применялся в осевом направлении. В этом случае длина ящика была такой же, как и у нити накала.Поперечный размер коробки находился в диапазоне 50–66 Å, в зависимости от тестируемого двухслойного рисунка. После размещения молекул воды система была минимизирована по энергии на 2000 шагов с использованием метода ABNR. Каждую конфигурацию нагревали в течение 100 пс, затем уравновешивали в течение 1,0 нс. Во время уравновешивания скорости были перемасштабированы, когда температура отклонялась от 300 К более чем на ± 5 К. Затем производился цикл от 2,0 до 6,0 нс (таблица 1). При нанесении PBC аксиальная длина нити (т.е. 29,2 Å для системы, состоящей из 12 пептидов GNNQQNY) сохранялась фиксированной, в то время как поперечная площадь симулятора колебалась, чтобы поддерживать постоянное давление в 1 атм.В некоторых случаях моделирование было выполнено с использованием динамики CPT, где осевая длина была скорректирована (таблица 1). Координаты сохранялись каждые 0,5 пс во время производственного цикла. Расстояние отсечки для несвязанного взаимодействия составляло 12 Å для явного моделирования воды. Мы применили аналогичную процедуру для одного пептида, который требуется для расчета.

Расчет свободной энергии связи ()

Мы рассматриваем четыре состояния пептида: в виде мономера или внутри бислоя, либо в вакууме, либо в растворе: (2) — это разность свободной энергии пептида в вакууме как изолированного мономера vs. в бислое; (3) включает ковалентно связанные энергетические термины, связанные с растяжением связей, валентным углом и правильными / неправильными двугранными углами. и — ван-дер-ваальсовы и электростатические энергии в вакууме. , и представляют собой вклады колебательной, поступательной и вращательной энтропии [56]: (4) (5) (6) где — частота нормальной моды i -й, m — масса одного пептида,, h — постоянная Планка, ρ, — числовая плотность (в единицах M), σ, — фактор симметрии молекулы, и — три вращательных момента инерции.Для пептида внутри бислоя и были установлены на ноль. Для удобства ρ было установлено равным 1 М. Хотя это выше, чем типичное экспериментальное значение, ∼1 µ M, другой выбор только сдвигает в целом на постоянный коэффициент, не влияя на выводы настоящей работы. σ было единицей, потому что пептид представляет собой асимметричную молекулу.

— свободная энергия сольватации мономера; (7) где — неполярная «гидрофобная» энергия, пропорциональная доступной для растворителя площади поверхности.- свободная энергия полярной сольватации, аппроксимированная обобщенной моделью сольватации Борна [52]. Для вычисления этих членов использовалась установка GBSW в CHARMM, которая, как известно, воспроизводит результаты, вычисленные с помощью подхода уравнения Пуассона-Больцмана, с погрешностью 2% [52].

Аналогично — свободная энергия сольватации двухслойного состояния; (8) который был снова рассчитан с использованием GBSW.

Вышеупомянутые значения энергии, рассчитанные для бислоя, были разделены на количество пептидов в бислое.Наконец, свободная энергия Гиббса образования бислоя (на пептид) может быть рассчитана как, учитывая уравнение. 2, (9) где и.

После моделирования молекулы воды были удалены, и для каждого кадра были рассчитаны энергетические члены, за исключением энтропийных вкладов, и усреднены по каждому периоду 1 нс. Для расчета мы сделали 10 снимков на каждый период 1 нс, каждый из которых был минимизирован по энергии, а нормальные режимы были рассчитаны с использованием зависящей от расстояния диэлектрической проницаемости (KLVFFAE и STVIIE) или в среде сольватации GBSW.Выбор модели сольватации может измениться при 300 К на ± 2 ккал / моль, но это не влияет на наш вывод относительно относительной стабильности между различными структурами двухслойных структур в данной модели растворителя. Уравнение 4 использовался для расчета колебательной энтропии, которая была усреднена по снимкам для оценки.

Мы оценили стандартное отклонение вычисленного следующим образом. Сначала и (уравнение 1) были усреднены, и соответствующие отклонения, и, были рассчитаны по производственному циклу. Для мономера мы не рассматривали колебания его энергии, поскольку энергия мономера влияет только на общую величину (см. Ниже).Поскольку дисперсия суммы двух независимых случайных величин является суммой индивидуальных дисперсий [69], получаем (10)

Моделирование молекулярной динамики с обменом репликами (REMD)

При моделировании мономер более подвержен конформационным колебаниям, чем β -листовые двухслойные филаменты. Таким образом, следует быть осторожным при интерпретации величины. Колебания свободной энергии мономера могут вызвать общий сдвиг профиля. Таким образом, хотя наш подход эффективен при сравнении относительной стабильности двухслойных паттернов для данного пептида, было бы трудно использовать вычисленные значения для определения амилоидогенности пептида или для сравнения относительной стабильности между двухслойными паттернами, состоящими из разных пептидов.

Для дополнительного сравнения стабильности бислоев GNNQQNY и GNNAQNY мы выполнили REMD [70] для соответствующих мономеров. Мы приготовили 16 копий каждого мономера с температурой моделирования от 275 K до 600 K. Использовалась модель сольватации континуума GBSW. Испытания смены температуры проводились каждые 20 пс в соответствии с критерием Метрополиса и длились 100 нс, с общим временем моделирования 1,6 µ с. За этот период каждая копия посещала самую низкую (самую высокую) температуру не менее 22 (69) раз.был рассчитан путем минимизации энергии 5000 структур REMD при 300 K и выполнения NMA для каждой. По сравнению с явным моделированием воды для мономера, полностью состоящим из атомов, GNNQQNY увеличился только на +0,40 ккал / моль, в то время как для GNNAQNY он уменьшился на -7,65 ккал / моль. Таким образом, когда энергия мономера на основе моделирования REMD вычитается (уравнение 9), увеличивается больше для GNNAQNY, чем для GNNQQNY, что противоположно случаю, когда использовалась энергия мономера из моделирования при постоянной температуре (рис. 1).

Алгоритм DSSP [71] позволил детально охарактеризовать конформацию каждого мономера при 300 К.Наиболее распространенной конформацией GNNQQNY была α -спираль с вероятностью появления 58%. Водородно-связанный виток и π — спираль оказались 13% и 11% соответственно (рис. S9). Однако вышеупомянутые вторичные структуры имеют очень похожую конформацию, как показано на вставке к рис. S9. Это согласуется с соответствующим моделированием МД при постоянной температуре, где α спираль была доминирующей конформацией. Аналогично, GNNAQNY имеет α, -спираль (51%), π -спираль (14%) и водородную связь (11%).

Дополнительная информация

Рисунки S1.

Δ G _{связывает} профилей через последовательные интервалы в 1 нс. Черная сплошная линия показывает Δ G _bind , усредненную за период производства 4 нс. Хотя есть небольшие изменения в Δ G _bind с течением времени, общий профиль устанавливается с начала моделирования. См. Рис. S4-S8 для изменения во времени локально усредненных свободных энергий.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pcbi.1000492.s001

(9,00 МБ TIF)

Рисунки S9.

Распределение вторичной структуры мономеров GNNQQNY и GNNAQNY. После завершения моделирования REMD каждый снимок при 300 K был проанализирован с использованием алгоритма DSSP. Символ i в названии каждой конформации представляет вторичную структуру соответствующей аминокислоты; X: неструктурированный, B: β-мостик, S: изгиб, G: 3-спираль, T: водородный виток, H: α-спираль и I: π-спираль.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000492.s009

(4,28 МБ TIF)

Таблица S4.

Разложение ΔG _{связывает} бислоев KLVFFAE. Наиболее стабильные (возможно, нативные) структуры выделены жирным шрифтом. Выбранные конфигурации при pH 7,0 были дополнительно смоделированы с использованием систем большого размера (20 пептидов), и соответствующие значения энергии указаны в скобках.

https://doi.org/10.1371/journal.pcbi.1000492.s013

(0,02 МБ PDF)

Структура области 53BP1 BRCT, связанной с p53, и ее сравнение со структурой Brca1 BRCT

1. Ву С.Joo1,
2. Филип Д. Джеффри1,
3. Шэрон Б. Кантор3,
4. Майкл С. Финнин1,2,
5. Дэвид М. Ливингстон3, и
6. Павлетич Никола Павлович2,2,4

1. ¹ Программа клеточной биохимии и биофизики и ² Медицинский институт Говарда Хьюза, Мемориальный онкологический центр Слоуна-Кеттеринга, Нью-Йорк, Нью-Йорк 10021, США; ³ Онкологический институт Дана-Фарбер и Гарвардская медицинская школа, Бостон, Массачусетс 02115, США

Аннотация

С-концевые домены Brca1 (BRCT) являются распространенным мотивом межбелкового взаимодействия в белках, участвующих в ответе на повреждение ДНК. и восстановление ДНК.Белок ответа на повреждение ДНК 53BP1 имеет два домена BRCT, которые связываются с ДНК-связывающим доменом р53. В Тандем-BRCT-область 53BP1 гомологична тандемной-BRCT-области Brca1, которая участвует в репарации двухцепочечных разрывов. и гомологичная рекомбинация, которая связывает BACh2, член семейства DEAH-геликазы. Здесь мы сообщаем о структурах комплекс 53BP1-p53 человека и повторы BRCT крысы Brca1. Структура 53BP1 – p53 показывает, что два повтора BRCT расположены тандемно и широко упаковывать через интерфейс, который также включает линкер между повторами.Первый повтор BRCT и линкеры вместе связывают p53 в области, которая перекрывается с ДНК-связывающей поверхностью p53 и включает остатки p53, которые мутировали при раке и важны для связывания ДНК. Сравнение со структурой тандем-BRCT-области Brca1 показывает замечательная консервация расположения повторов и интерфейса повторов между BRCT. Анализ человеческого BRCA1 опухолевого происхождения мутации и консервация идентифицируют потенциальный сайт связывания с белком, который, как мы показываем посредством мутагенеза, участвует в BACh2 привязка.BACh2-связывающая область Brca1 состоит из уникальной вставки в первый повтор BRCT и межповторного линкера. и аналогичен области 53BP1, которая связывает p53.

Мотив С-концевой последовательности Brca1 (BRCT), впервые идентифицированный в продукте гена предрасположенности к раку молочной железы Brca1 как Тандемный повтор из ~ 95 аминокислот обнаруживается в большом количестве белков, участвующих в ответе на повреждение ДНК (Koonin et al.1996; Bork et al. 1997; Callebaut and Mornon 1997), включая Saccharomyces cerevisiae Rad9, Schizosaccharomyces pombe Crb2, ДНК-лигазы III и IV млекопитающих, XRCC1, p53-связывающий белок 1 (53BP1) и Brca1. Более пятидесяти белков бактерий у млекопитающих содержат мотивы BRCT, варьирующиеся от одной до восьми копий (Yamane et al. 1997).

Brca1 участвует в репарации двухцепочечных разрывов (DSB) посредством гомологичной рекомбинации (Moynahan et al.1999, 2001). В ответ на DSB ядерные очаги, содержащие Brca1, рассеиваются и перераспределяются в новые очаги, содержащие Rad51, который является у млекопитающих гомолог белка RecA Escherichia coli , который опосредует рекомбинацию ДНК, PCNA (Scully et al. 1997) и комплекс Rad50 / Mre11 / NBS1 (Zhong et al. 1999; Wang et al. 2000; Wu et al. 2000; Чиба и Парвин 2001). Перераспределение очагов Brca1 сопровождается его гиперфосфорилированием киназами, критическими для повреждения ДНК. ответ, включая банкомат (Cortez et al.1999), hCds1 / CHK2 (Lee et al. 2000) и ATR (Tibbetts et al. 2000).

53BP1, который был впервые идентифицирован как белок, взаимодействующий с p53 в дрожжевом двугибридном скрининге (Iwabuchi et al. 1994), реагирует на повреждение ДНК аналогично Brca1. Как и Brca1, 53BP1 гиперфосфорилируется ATM и колокализуется с комплекс Rad50 / Mre11 / NBS1 в ответ на DSB (Schultz et al. 2000; Anderson et al. 2001; Rappold et al. 2001; Xia et al. 2001).Полная область тандемного повтора BRCT 53BP1 более гомологична соответствующим областям BRCT Brca1, S. pombe, Crb2 и S. cerevisiae Rad9, белкам контрольной точки повреждения ДНК, чем большинству других белков, содержащих домен BRCT, что позволяет предположить, что 53BP1 может поделиться некоторыми функциональное сходство с этими белками в ответе на повреждение ДНК. В подтверждение этого ортолог Xenopus laevis 53BP1 был независимо идентифицирован в ходе скрининга супрессоров митотической катастрофы, возникающей в результате преждевременного проникновения. в митоз, предполагая, что он обладает способностью останавливать или замедлять развитие клеточного цикла (Xia et al.2001).

Функция опухолевого супрессора p53 в ответе на повреждение ДНК хорошо известна. В ответ на различные повреждения ДНК агентов, p53 фосфорилируется ATM и родственными киназами, что приводит к его стабилизации (Caspari 2000; Khanna and Jackson 2001). Действуя как фактор транскрипции, p53 затем активирует программу транскрипции, которая вызывает остановку клеточного цикла или апоптоз. Взаимодействие 53BP1 – p53 опосредуется ДНК-связывающим доменом p53 (остатки 94–292) и тандемными повторами BRCT 53BP1. (остатки 1702–1972).Хотя исследования in vitro показали, что p53 не может связываться с последовательностью ДНК и 53BP1 одновременно (Iwabuchi et al. 1994), 53BP1, как было показано, усиливает трансактивацию p53 в анализе временной трансфекции (Thukral et al. 1994; Datta et al. 1996). P53 связывает 53BP1 в ооцитах X. laevis , но взаимодействие в соматических клетках еще не наблюдалось (Schultz et al. 2000; Xia et al. 2001), что позволяет предположить, что роль комплекса 53BP1-p53 может быть ограничена определенные стадии развития (Xia et al.2001).

Домен BRCT, как было установлено, обеспечивает межбелковые взаимодействия в некоторых др. Белках (Zhang et al. 1998; Aravind 1999). XRCC1 и ДНК-лигаза III связываются друг с другом через свои отдельные домены BRCT, а ДНК-лигаза IV использует свои тандемные домены BRCT. связывать XRCC4 (Grawunder et al. 1998). Было показано, что BRCT-домен Brca1 взаимодействует с CtBP-взаимодействующим белком (CtIP; Li et al. 1999; Yu et al. 1998), а также с членом семейства DEAH-геликазы Brca1-ассоциированной C-концевой геликазой (BACh2; Cantor и другие.2001). Мутации зародышевой линии в BACh2 были идентифицированы в двух случаях семейного рака молочной железы с ранним началом, не вовлекающего человека. BRCA1 мутации, дополнительно подтверждая роль взаимодействия Brca1-BACh2 в ответе на повреждение ДНК (Cantor et al. 2001).

Структуры одного повтора BRCT из белка XRCC1 (Zhang et al. 1998) и тандемных повторов BRCT из человеческого BRCA1 (Williams et al. 2001) показали, что мотив BRCT состоит из четырехцепочечного параллельного β-слоя, окруженного тремя α-спиралями.Однако есть не было структурной информации о том, как один или несколько доменов BRCT функционируют во взаимодействиях белок-белок. Здесь мы представляем структура BRCT-области 53BP1, связанная с ДНК-связывающим доменом p53, структура тандема Brca1-BRCT крысы область и исследования мутагенеза, которые идентифицируют сайт связывания BACh2 на Brca1. Эти структуры в сочетании с мутагенезом данные, обнаруживают поразительное сходство в способе организации тандемных доменов BRCT и в том, как они используются для передачи белок-белковые взаимодействия в 53BP1 и Brca1.

Результаты

Общая структура комплекса 53BP1 BRCT – p53

C-концевой фрагмент из 271 остатка 53BP1, который необходим и достаточен для связывания p53, состоит из N-концевого удлинение (остатки 1702-1727), два повтора BRCT и промежуточный линкер (остатки 1851-1867).Два повтора BRCT и линкерная упаковка вместе, и весь фрагмент 53BP1 принимает глобулярную структуру (Fig. 1A). Повторы BRCT расположены в тандеме и связаны трансляцией на ∼30 Å и поворотом на 30 ° вокруг оси примерно коллинеарно с направлением трансляции, что приводит к винтообразному движению (рис. 1А).

Фигура 1.

Структуры человеческого комплекса 53BP1 – p53 и С-концевой тандемной области BRCT крысы Brca1. ( A ) Схематическое изображение комплекса 53BP1 – p53, показывающее ДНК-связывающий домен p53 (синий), взаимодействующий с C-концом спираль первого повтора BRCT (красный) и межповторного линкера (желтый), но не второго повтора BRCT (зеленый) 53BP1. Красная пунктирная линия указывает на вставку из 30 аминокислот между β1A и α1A, которая не имеет интерпретируемой электронной плотности.( B ) Структура тандемной области BRCT на С-конце Brca1 крысы с первым повторением BRCT, окрашенным в пурпурный цвет, линкер — в желтый цвет и второй повтор BRCT — голубой. Часть линкера и область между β3B и β4B отсутствуют в электронной плотности. и представлены голубыми пунктирными линиями. ( C ) Выравнивание последовательностей первых повторов BRCT и линкеров ( верхний, ) или вторых повторов BRCT ( нижний ) из Brca1 и 53BP1.Элементы вторичной структуры окрашены, как в A и B , с неупорядоченными участками пунктирными линиями. Нумерация остатков Brca1 крысы или BRCA1 человека (в скобках) указана ниже. последовательности. Красные столбцы над последовательностями Brca1 указывают на относительную частоту миссенс-мутаций опухолевого происхождения. из базы данных BIC. Нумерация остатков 53BP1 человека показана под последовательностями 53BP1. Синие точки над последовательностями 53BP1 представляют собой остатки, которые связываются с p53.

Как было показано в предыдущих структурных исследованиях (Cho et al. 1994; Gorina and Pavletich 1996), ДНК-связывающий домен p53 (называемый коровым доменом p53) состоит из β-сэндвич-каркаса, который поддерживает два больших петли (L2 и L3) и α-спираль (спираль h3; рис. 1А). Петля L3, которая стабилизируется тетраэдрически координированным атомом цинка, общим с петлей L2, и спираль h3 образуют ДНК-связывающая поверхность p53.В комплексе 53BP1-p53 C-концевой участок первого повтора BRCT и линкерная область 53BP1 образуют непрерывную поверхность, которая связывает часть ДНК-связывающей поверхности корового домена p53, в основном через контакты к шлейфу L3 и меньшее количество контактов к шлейфу L2 (рис. 1А). При образовании комплекса 53BP1 – p53 в общей сложности погребено 1275 Å ² в основном полярной площади поверхности.

Структура тандемного BRCT 53BP1 демонстрирует замечательное структурное сходство с тандемной BRCT-областью Brca1 (остатки 1589-1817 Brca1 крысы и остатки 1646–1859 BRCA1 человека; Williams et al.2001; Рис. 1C) в том, как расположены два повтора, в деталях интерфейса повторов между BRCT и в том, как линкерная область участвует в интерфейсе (рис. 1А, Б).

Структура области BRCT 53BP1 и интерфейс между тандемными BRCT

Отдельные повторы BRCT 53BP1 имеют такую ​​же общую α / β-кратность, наблюдаемую в структуре одного домена BRCT XRCC1. (Чжан и др.1998), но содержат несколько вставок последовательностей, а также отклонения в положениях элементов вторичной структуры (рис. 1А). BRCT-повторы 53BP1 состоят из четырехцепочечного параллельного β-листа (от β1A до β4A и от β1B до β4B; суффиксы A и B обозначают первый и второй повторы 53BP1 соответственно), фланкированные двумя α-спиралями с одной стороны (α1A, α1B и α3A, α3B) и один на другом (α2A, α2B; рис. 1A). С-концевой участок первого повтора BRCT 53BP1 содержит спираль 3 ₁₀ рядом с его С-концом (α4A в остатках 1843–1847; рис.1А, В).

Положения и ориентации отдельных спиралей в повторах BRCT 53BP1 демонстрируют значительные отклонения от канонической структура, как определено суперпозицией структур BRCT от 53BP1, Brca1 и XRCC1 (Рис. 2A, C). Наиболее расходящимися структурными элементами являются спирали α2A и α1B. Относительно канонической структуры α2A сдвинута на ∼6 Å вдоль своей спиральной оси и наклонен на ∼30 °, а α1B наклонен на ∼11 °.Эти спирали упаковываются в повторы между BRCT. (рис. 1А, 2Б) и их отклонение от канонической структуры критично для упаковки. Петли между вторичной структурой элементы также различаются по размеру и точной структуре (рис. 1C, 2A). Петля между β2 и β3, названная петлей c2 (Zhang et al. 1998), содержит спиральную вставку из пяти остатков (α1‘A) в повторе 1 53BP1 и вставку из восьми остатков в повторе 2 (рис. 1С, 2А).

Фигура 2.

BRCT домены Brca1 крысы имеют такое же тандемное расположение, как и в 53BP1. ( A ) Наложение двух повторов BRCT (красный и зеленый) 53BP1 и одного домена BRCT из XRCC1 (желтый). Расходящийся области среди доменов BRCT расположены внутри петель (например, спираль вставки α1‘A в 53BP1) и также включают ориентации и положения спиралей α1 и α2.( B ) Крупным планом интерфейс повторов между BRCT 53BP1. Боковые цепи от первого повтора BRCT выделены светло-красным цветом, от линкера — светло-желтым, а со второго — светло-зеленым. Спираль α2A первого повтора (красный) вместе со спиралями α1B и α3B второго повтора (зеленый) образуют трехспиральный пучок, который стабилизируется β-шпилькой. линкер (β1L и β2L, окрашены в желтый цвет) и спираль вставки α1‘A.Белые пунктирные линии обозначают взаимодействия водородных связей. ( C ) Наложение тандемных повторов BRCT 53BP1 (серый) и Brca1 крысы с первым повтором BRCT, окрашенным в пурпурный цвет, второй повтор BRCT — голубой, линкер — желтый. ( D ) Крупным планом интерфейс повторов между BRCT крысы Brca1. Боковые цепи от первого повтора — светло-розовые, те от линкера — светло-желтым, а от второго повтора — голубым.Белые пунктирные линии обозначают водород. облигационные взаимодействия. Буква M указывает на миссенс-мутации опухолевого происхождения, которые происходят с высокой частотой (Met 1598, Arg 1645, Ala 1654, Met 1720 и Gly 1733 у крысы).

Интерфейс повторов между BRCT 53BP1 содержит как основные элементы мотива BRCT, так и линкер между повторами.Интерфейс закапывает в общей сложности ∼2400 Å ² , треть из которых вносится линкером (рис. 2B). Центральная часть интерфейса формируется за счет упаковки α2A первого повтора с α1B и α3B второго повторить, аналогично трехспиральным пучкам (рис. 2Б). Три α-спирали вносят восемь гидрофобных остатков на поверхность раздела (рис. 2B). Такое устройство упаковки пучка из трех спиралей было бы невозможно, если бы положения и ориентации α2A и α1B спирали не отклонялись от канонической структуры мотива BRCT (рис.2А, Б). Гидрофобные межфазные контакты окружены сетками водородных связей со стабилизированным зарядом около концов спиралей. (Рис. 2B).

Межповторный линкер принимает структуру β-шпильки (остатки 1851–1860; β1L и β2L, где L обозначает линкерный элемент) за которым следует расширенный сегмент (остатки 1861–1867), оба из которых сильно упакованы с обоими повторами BRCT на меж-BRCT повторить интерфейс (рис.1А, 2Б). Одна сторона шпильки содержит гидрофобные остатки, которые упаковываются с остатками из спиралей α2A и α3B трехспиральной спирали. пучок (рис. 2Б).

Сравнение последовательностей X. laevis 53BP1 человека и показывает, что многие из гидрофобных интерфейсных остатков и все пять аминокислот, которые участвуют в солевых мостиках на трехспиральном пучке и линкерной β-шпильке консервативны (рис.1C, 2B), что согласуется с моделью, согласно которой область с двумя повторами BRCT представляет собой один глобулярный домен. Напротив, одиночный повтор BRCT структура XRCC1 отличается от частей повторов 53BP1, которые образуют интерфейс, тем, что (1) она не показывает никаких отклонения от канонической структуры в спиралях α1 и α2, и (2) он имеет только одну открытую гидрофобную аминокислоту (Met 62) в его спиралях α1, α2 и α3.

Сравнение тандем-BRCT структур 53BP1 и Brca1 крысы

Полные структуры тандем-BRCT 53BP1 и Brca1 крысы могут быть наложены со среднеквадратичным отклонением (RMSD), равным 1.71 Å в положениях 138 из 229 атомов Brca1 Cα (рис. 2C), включая все восемь ядер β-тяжей BRCT и семь из восьми ядерных спиралей (спираль Brca1 α2B разупорядочена в нашем кристаллы; Рис. 1Б, 2С). Наиболее поразительная структурная консервация находится на интерфейсе повторов между BRCT (Fig. 2C). Интерфейсные спирали α2A первого повтора и α1B и α3B второго повтора имеют одинаковые угловые и позиционные отклонения от консенсусной структуры, как у 53BP1, что позволяет им сформировать трехспиральный интерфейс пучка по существу идентичен таковому у 53БП1 (рис.2С). Центральные взаимодействия на границе трехспирального пучка Brca1 крысы включают гидрофобные остатки, которые встречаются в положениях на спиралях, эквивалентных таковым в 53BP1 (рис. 2Б, Г). Три из них консервативны между Brca1 и 53BP1 (Phe 1650, Leu 1651 и Ala 1654 крысы Brca1), а остальные являются консервативно замещенный (рис. 1C, 2B, D). Так же, как и в интерфейсе 53BP1, трехспиральный пучок Brca1 фланкирован взаимодействиями водородных связей со стабилизированным зарядом. возле концов спиралей (рис.2Б, Г). Эти контакты водородных связей (Arg 1645, Asp 1785, Arg 1727 и карбонил основной цепи Ile 1626) находятся в аналогичных местах. положения по сравнению с таковыми в 53BP1, но подробные взаимодействия несколько отличаются из-за вставок поблизости и различия в линкерной области (рис. 2Б, Г).

Межповторный линкер из 23 остатков крысиного Brca1 (остатки 1682–1704) занимает то же положение, что и 53BP1, упаковывая на одной стороне трехспирального пучка и стабилизирующий интерфейс повторов между BRCT (рис.2Б, Г). Как и 53BP1, линкер Brca1 содержит структуру, подобную β-шпильке, которая упаковывается спиралями α2A и α3B, хотя только первый сегмент имеет фи-пси-углы позвоночника β-листа (β1L; Рис. 2B, D). Линкерная шпилька образует непрерывную β-пластинчатую структуру с β3′A – β3 ^″ A (рис. 2D), что соответствует вставке из семи остатков между β3A и α2A Brca1 по сравнению с 53BP1 (рис. 1C). . Присутствие вставки β3′A – β3 «A в Brca1 связано с поворотом шпильки линкера относительно этого из 53БП1.Следуя за линкерной шпилькой, Brca1 имеет спираль (α1L) по сравнению с удлиненным сегментом 53BP1 (Fig. 2B, D).

Структурная консервативность в интерфейсах повторов между BRCT 53BP1 и Brca1 предполагает, что их тандемные области BRCT расходились от общего предкового белка. Хотя возможно, что два тандемных домена BRCT возникли отдельно через конвергентная эволюция, начиная с одного предкового домена BRCT, сходства в контактах BRCT-BRCT, такие как сделанные Arg 1645 из Brca1 и Arg 1811 из 53BP1 (рис.2Б, Г), сделает это менее вероятным. Белки S. pombe Crb2 и S. cerevisiae Rad9 имеют структуру гидрофобных и полярных остатков, характерную для интерфейсов повторов 53BP1 и Brca1 между BRCT. Хотя общий уровень сохранности намного ниже по сравнению с уровнем между Brca1 и 53BP1, особенно во втором BRCT повторы, сохранение в Crb2 и Rad9 нескольких ключевых интерфейсных остатков, таких как аргинины, в положениях, соответствующих к Arg 1645 из Brca1 и Arg 1811 из 53BP1, предполагает, что они могут быть эволюционно связаны с Brca1 и 53BP1 и поддерживают гипотеза о том, что они могут иметь функциональное сходство.

53BP1 – p53 взаимодействия

Взаимодействия 53BP1 – p53 сконцентрированы на петле L3 p53. Петля L3 имеет жесткую форму, которая стабилизируется. за счет связывания цинка, за счет водородных связей в основной цепи и за счет взаимодействия боковой цепи с остальной частью структуры p53 (Cho et al. 1994). Кончик из семи остатков (остатки 243–249) петли L3 связывает непрерывную область 53BP1, состоящую из α3A и α4A. спирали на С-конце первого повтора BRCT и межповторного линкера (рис.3). Взаимодействия основаны в первую очередь на сетях водородных связей, включающих как боковые цепи, так и группы основной цепи, а также на в меньшей степени на контактах Ван-дер-Ваальса (рис. 3). Петля L3 является одним из двух ключевых структурных элементов, составляющих ДНК-связывающую поверхность p53, содержащую аргинин. остаток (Arg 248), который связывается в малой бороздке ДНК (Cho et al. 1994). Другим структурным элементом ДНК-связывающей поверхности р53 является мотив петля-лист-спираль (спираль h3), который не участвует при связывании с 53BP1 (рис.1А, 3).

Рисунок 3.

Стерео интерфейс 53BP1 – p53. Вторичная структура p53 окрашена в синий цвет, за исключением петли L3, которая имеет голубой цвет. Боковые цепи p53, первого повтора BRCT и линкера 53BP1 окрашены в голубой, светло-красный и светло-желтый цвета соответственно. Водородные связи обозначены белыми пунктирными линиями.

Сети водородных связей 53BP1 – p53 сосредоточены на Arg 248 и Arg 249 p53. Водородные связи Arg 248 с боковой цепью Asp 1861 от β-шпильки межповторного линкера и с карбонильной группой основной цепи Leu 1847 в начале линкер (рис. 3). Боковая цепь Arg 248 стабилизирована внутримолекулярной водородной связью с группой OD1 Asn 247 (L3), у которой группа ND2 водородные связи с карбонильной группой остова Leu 1847 из спирали α4A 53BP1 (рис.3). Сеть водородных связей с центром Arg 249 включает группу OD1 Asn 1845 и карбонил основной цепи Arg 1844, оба от спирали α4A 53BP1 (рис. 3). В структурах комплекса p53-ДНК и изолированного p53 Arg 249 играет важную роль в стабилизации структуры. петли L3 за счет водородной связи с карбонильными группами основной цепи Gly 245 и Met 246 и с боковой цепью Glu 171 из петли L2 (Cho et al.1994). В комплексе 53BP1 – p53 водородные связи между Arg 249 и карбонильными группами основной цепи сохраняются, но водородные связи связи с Glu 171 разрушаются, а группы Nh2 и Nh3 Arg 249 теперь взаимодействуют с 53BP1 вместо этого (Рис. 3). Боковая цепь Glu 171 смещена из своего положения в мономерном р53 и разупорядочена в кристаллах.

Ван-дер-Ваальсовы контакты образованы боковой цепью Met 243 и Cα Gly 244, которые вклиниваются между спиралями α3A и α4A. 53BP1 и контактируют с боковыми цепями Val 1829 и Tyr 1846 (рис.3). Эти остатки p53 плотно упаковываются с 53BP1, позволяя амиду основной цепи Gly 244 p53 образовывать водородную связь с основная карбонильная группа Asn 1845 (рис. 3). Контакты петли L3 дополняются несколькими дополнительными контактами от соседней петли L2 до α3A и линкера (рис. 3).

Остатки 53BP1, которые связываются с p53, либо консервативны (Val 1829, Tyr 1846 и Asn 1845), либо консервативно замещены (Asp 1861 — Glu) в X.laevis 53BP1 (рис. 1С). Остатки, которые составляют α3A, α4A и часть β-шпильки линкера, также являются высококонсервативными (рис. 1C), что указывает на то, что эти структурные элементы будут принимать очень похожую структуру в X. laevis 53BP1. Относительно общей ~ 68% идентичности между областями X. laevis и BRCT человека 53BP1, высокая консервативность этих остатков подтверждает важную функциональную роль связывания р53. сайт структуры 53БП1.

Значение пути p53

Петля L3 играет центральную роль в супрессорной функции опухоли p53, поскольку три из шести горячих точек мутации (Gly 245, Arg 248 и Arg 249) и ~ 30% миссенс-мутаций, происходящих из опухоли, картируются в этой области (Cho et al. 1994). Кроме того, участок петли L3 соответствует одной из пяти эволюционно консервативных областей р53.Мутация Горячая точка Arg 248, которая устанавливает ключевые контакты как с ДНК, так и с 53BP1, нарушает как связывание ДНК, так и связывание 53BP1 (Thukral et al. 1994). Сходным образом мутации Gly 245 и Arg 249, которые играют центральную роль в структурной целостности петли L3 (Cho et al. 1994), также нарушают связывание как ДНК, так и 53BP1 (Thukral et al. 1994). Участие этих остатков петли L3 как в связывании ДНК, так и в связывании 53BP1 затрудняет оценку вклада, если таковая имеется, то потеря связывания 53BP1 может привести к онкогенезу.Отметим, однако, что Met 243, который является ключевым контактом 53BP1 но не играет роли в связывании ДНК или стабилизации структуры петли L3, также обнаруживается мутация при раке, хотя гораздо более низкая частота (шесть из 3393 миссенс-мутаций в базе данных) по сравнению с остатками, которые контактируют с ДНК. Несмотря на то что нельзя исключить еще одну роль Met 243, это наблюдение предполагает, что потеря связывания 53BP1, но не связывания ДНК может способствовать нарушению регуляции пути ответа на повреждение ДНК p53 в определенных контекстах.

Структура комплекса показывает, что связывание 53BP1 блокирует взаимодействие петли L3 с ДНК (рис. 1А, 3). Это будет препятствовать связыванию ДНК, специфичному для последовательности, из-за недоступности Arg 248 для распознавания A / T-богатая область консенсусной последовательности (Cho et al. 1994). Однако спираль h3 p53 остается доступной в комплексе 53BP1 – p53 (Figs. 1A, 3). В принципе, комплекс 53BP1-p53 все еще может использовать спираль h3 для связывания в большой бороздке ДНК в неспецифической таким образом, если ДНК изгибается от петли L3 или является концом ДНК, который заканчивается перед областью петли L3.В этом гипотетическом модель комплекса 53BP1 – p53 – ДНК, 53BP1 может обеспечивать дополнительные контакты с ДНК.

Картирование сайта связывания BACh2 на Brca1

Чтобы начать исследование, какие части структуры Brca1 BRCT участвуют в межбелковых взаимодействиях, мы сначала исследовали распределение миссенс-мутаций человеческого BRCA1 – BRCT опухолевого происхождения в базе данных информационного ядра рака молочной железы (BIC) (Рисунок.1С). Большинство мутаций отображаются на остатки, которые выполняют стабилизирующие структуру роль (Williams et al. 2001). Четыре из пяти наиболее часто мутируемых остатков находятся на интерфейсе повторов между BRCT, а пятый — в гидрофобном ядро первого повтора BRCT (Figs. 1C, 2D; Williams et al. 2001). Эти наблюдения показывают, что целостность и точная структура интерфейса повторов между BRCT имеют решающее значение для опухолевую супрессорную функцию области Brca1 BRCT.

Хотя большинство мутантных остатков выполняют стабилизирующие структуру роль, существует несколько мутантных остатков, которые либо полностью, либо частично подвергаются воздействию растворителя и, по-видимому, не играют значительной структурной роли в структуре Brca1 крысы. Эти остатки имеют тенденцию группироваться в двух областях молекулярной поверхности Brca1. Первая область (область I) состоит из шпилька вставки β3’A-β3 «A первого повтора BRCT, соседняя шпилька линкера и часть повтора между BRCT интерфейс, который частично подвергается воздействию растворителя.Вторая область (область II) состоит из цепи β3B и петли между β1B и α1B во втором повторе BRCT (рис. 1C). Однако в структуре BRCA1 BRCT человека (Williams et al. 2001) большая часть области II не подвергается воздействию растворителя, потому что она упаковывается со спиралью α2B, которая неупорядочена в структуре BRCT нашей крысы Brca1. Таким образом, область I является наиболее вероятным кандидатом на место связывания с белком.

Белок-связывающая функция для области I также поддерживается ее консервативностью в ортологах Brca1 (рис.1С). Наивысшая степень сохранения близко соответствует структурным элементам, составляющим область I: β3′A-β3 «A шпилька вставки, спираль интерфейса α2A, шпилька линкера и спираль α1L (идентичность> 85% по сравнению с ~ 60% в целом идентичность в тандеме БРКТ; Рис. 1С, 4А).

Рисунок 4.

Мутации, происходящие из опухоли, сохранение последовательности и мутагенез идентифицируют сайт связывания BACh2 в структуре Brca1 крысы.( A ) Составная фигура, показывающая представление молекулярной поверхности (прозрачный серый) и трассу основной цепи (белая спираль) Brca1 BRCT повторяется. Красные пятна на поверхности представляют собой опухолевые мутации из базы данных BIC ( слева, ), а желтые пятна ( справа, ) представляют собой остатки, консервативные в ортологах Brca1 человека, крысы и курицы. Сравнение переднего ( вверху слева ) и заднего ( внизу слева ) видов изображений поверхности, показывающих кластеризацию мутаций.( B ) Область I связывается с BACh2. ³⁵ S-меченный, транслируемый in vitro фрагмент BACh2 (остатки 888–1063; Cantor et al. 2001) был протестирован на связывание с очищенными слитыми белками GST – BRCA1 человека (остатки 1529–1863), несущими точечные мутации на поверхности. остатки в областях I и II. Связывающие активности мутантов рассчитывали относительно связывания BACh2 дикого типа. активность установлена ​​на 1. Данные были усреднены по пяти экспериментам.( C ) Остатки Brca1 в регионе I, которые взаимодействуют с BACh2. Остатки человека с их аминокислотными заменами в мутантах: указаны в скобках. Мутированные поверхностные остатки, для которых связывание BACh2 было снижено, окрашены в желтый цвет; остатки, чьи мутации не дали значительного эффекта, окрашены в зеленый цвет.

Чтобы рассмотреть возможность того, что область I может представлять сайт связывания для BACh2, мы ввели одиночные аминокислотные мутации. в области BRCA1 BRCT человека (остатки 1529–1863) и протестировали способность очищенных мутантных слитых белков GST связывать транслированный in vitro Brca1-взаимодействующий домен BACh2 (остатки 888-1063; Cantor et al.2001). Мы мутировали не только поверхностные остатки, которые мутировали при раке, но и консервативные остатки, подвергшиеся воздействию растворителя. Мы не мутировали остатки, которые могут играть важную роль в стабилизации структуры (Arg 1699, Cys 1643, Gly 1684, и Asp 1685 BRCA1 человека). Мы также мутировали три остатка области II, которые подвергаются действию растворителя в структуре человеческого организма. BRCA1 (Williams et al. 2001), хотя ни один из них не был мутирован при раке.

На фигуре 4B показано, что три мутанта по шпильке β3’A-β3 «A области I имеют значительное снижение связывания BACh2. Glu Мутации 1694 в Lys (Glu 1640 у крысы), Phe 1695 в Leu (Phe 1641 у крысы) и Val 1696 в Leu (Val 1642 у крысы) привели к в ~ 30%, ~ 45% и 50% снижении связывания BACh2, соответственно (фиг. 4B). Эти три остатка определяют почти непрерывную поверхность на Brca1 крысы, состоящую из шпильки β3’A-β3 «A (рис.4С). Мутации Phe 1695 в Leu и Val 1696 в Leu соответствуют мутациям, происходящим из опухоли (рис. 1C), предполагая, что роль этих остатков в связывании BACh2 может быть важной для функции Brca1 по супрессору опухолей. Мутация His 1746 в Asp (His 1692 у крысы) на линкере между β1L и α1L также уменьшала связывание BACh2, но только до скромной степени (рис. 4Б, В). Мутации в области II не оказали существенного влияния на связывание BACh2 (рис.4А, Б). Взятые вместе, эти результаты показывают, что область I является первичным сайтом связывания BACh2 (фиг. 4A, C).

Обсуждение

Мотив BRCT участвует во взаимодействиях белок-белок в нескольких белках, участвующих в репарации и рекомбинации ДНК. Помимо комплексов 53BP1-p53 и Brca1-BACh2, XRCC1 и ДНК-лигаза III участвуют в эксцизионной репарации оснований, было показано, что они взаимодействуют друг с другом через свои С-концевые одиночные мотивы BRCT (Ljungquist et al.1994; Caldecott et al. 1995; Nash et al. 1997). В структуре комплекса 53BP1 – p53 присутствуют как сердцевинный структурный элемент BRCT (спираль α4A), так и уникальный линкерный элемент. опосредуют связывание p53 (рис. 3). Участие линкера между повторами в связывании p53 может помочь объяснить сохранение повтора между BRCT. интерфейс. Поскольку линкерная структура сворачивается на интерфейсе, важная функциональная роль линкера будет отражаться в сохранности и целостности интерфейса.

Поразительно, что структура тандемных повторов BRCT крысы Brca1 показывает не только почти идентичное расположение двух повторов. но также очень похожие контакты между BRCT и аналогичная линкерная структура на интерфейсе (Fig. 2C). Консервация последовательности и мутации, происходящие из опухоли, предполагают, что область I, состоящая из интерфейса повторов между BRCT, линкер и вставка β-шпильки рядом с линкером важны для функции Brca1 и мутации в экспонированных растворителем остатки этой области демонстрируют, что она участвует в связывании BACh2 (рис.4A – C). Интересно, что область I Brca1 перекрывается с областью 53BP1, которая связывает p53 (рис. 1A, B, 4C), выявляя сходство не только в структурах повторов BRCT Brca1 и 53BP1, но и в том, как они функционируют. в белок-белковых взаимодействиях. Хотя оба белка используют схожую область для связывания своих партнеров, структурные детали в их сайтах связывания с белками различаются. Наличие вставной шпильки в Brca1 будет стерически предотвращать р53. от привязки к этому сайту.

Сравнение структур BRCT 53BP1 и Brca1 позволяет предположить, что BRCT-содержащие белки развили специфичность для разных белков не только за счет эволюции различных аминокислот в структурно консервативных частях основного мотива BRCT, но также за счет развивающиеся дивергентные структурные элементы в виде вставок внутри или между повторами BRCT. Это напоминает другие регулярно повторяющиеся мотивы распознавания белков, где отклонение от канонической структуры часто связано с функциональной уникальностью и биологическая специфичность.Напр., В белке с четырьмя анкириновыми повторами p16 ^INK4A дивергентная область второго анкиринового повтора, в которой спираль заменена петлей, играет центральную роль в связывании Cdk6 (Russo et al. 1998).

Сходные структуры тандемных BRCT-областей 53BP1 и Brca1 крысы предполагают, что эти два белка могут быть эволюционно связанных, возможно, отошедших от общего тандемного предкового белка BRCT.Это наблюдение в сочетании с сохранением остатков в интерфейсе между повторами BRCT между 53BP1, Brca1 и генами контрольной точки повреждения ДНК S. pombe Crb2 и S. cerevisiae Rad9 подтверждает предложенную модель, согласно которой эти белки могут иметь сходство в своих клеточных также функционирует (Saka et al. 1997).

Материалы и методы

Экспрессия и очистка белков

ДНК-связывающий домен р53 человека (остатки 94–292) экспрессировали и очищали, как описано ранее (Cho et al.1994). Человеческий 53BP1 (остатки 1702–1972) был сверхэкспрессирован как слитый белок GST в штамме BL21 (DE3) E. coli при комнатной температуре и выделен из растворимого клеточного лизата с помощью аффинной хроматографии на глутатион-сефарозе (Pharmacia). После отщепления от GST тромбином фрагмент белка 53BP1 очищали с помощью анионообменной и гель-фильтрационной хроматографии. Очищенные полипептиды p53 и 53BP1 объединяли и выделяли в виде комплекса из дополнительного раунда гель-фильтрации. хроматография.Очищенный комплекс концентрировали до ~ 13 мг / мл в 50 мМ BTP – HCl (pH 6,8), 200 мМ NaCl и 5 мМ дитиотреитоле. (ДТТ) путем ультрафильтрации. Крысиный Brca1 (остатки 1589–1817), содержащий тандемные повторы BRCT, сверхэкспрессировался как GST слитый белок и очищают, как описано для 53BP1. Очищенный крысиный Brca1 концентрировали до ~ 75 мг / мл в 10 мМ Na-HEPES (pH 7.5), 150 мМ NaCl и 5 мМ DTT путем ультрафильтрации.

Кристаллизация и сбор данных

Кристаллы комплекса 53BP1 – p53 были выращены при 4 ° C методом диффузии паров висячей капли путем смешивания равного объема очищенный белковый комплекс и буфер для кристаллизации, содержащий 50 мМ цитрата натрия (pH 6.0), 125 мМ ацетат аммония, 16% (мас. / Об.) Полиэтиленгликоля (ПЭГ) 4000 и 5 мМ DTT. Наилучшие кристаллы получены в каплях, для которых резервуарный раствор не хватало ацетата аммония. Дифракционные данные собирали при -170 ° C с кристаллами, мгновенно замороженными в кристаллизационном буфере. содержащий 36% (мас. / об.) ПЭГ 4000 и не содержащий DTT. Кристаллы образовались в пространственной группе P2 ₁ 2 ₁ 2 ₁ с a = 73.1, b = 95,0, c = 133,7 Å и содержал два комплекса на асимметричное звено. Данные многоволновой аномальной дифракции (MAD) были собраны на краю цинка при энергиях 9662,5 электронвольт (эВ), 9673,5 эВ и 9823,0 эВ (соответствующих λ1, λ2 и λ3 соответственно, в таблице 1) на линии X4A национального синхротронного источника света в Брукхейвенской национальной лаборатории (NSLS). Кристаллы Brca1 крысы были выращены при 4 ° C с использованием метода диффузии паров висячей капли из кристаллизационного буфера, содержащего 50 мМ трис-HCl (pH 8.5), 150 мМ NaCl, 18% (мас. / Об.) PEG 8000 и 5 мМ DTT. Кристаллы образовались в пространственной группе C2 с a = 84,5, b = 58,7, c = 65,4 Å, β = 111,2 ° и содержали одну молекулу Brca1 на асимметричную единицу. Для экспериментов с множественной изоморфной заменой (MIR) кристаллы вымачивали либо в 1 мМ тимеросале, либо в 2 мМ K ₂ PtCl ₄ в течение 2 часов. Дифракционные данные собирали при -170 ° C с мгновенным замораживанием кристаллов в буфере для кристаллизации, содержащем 20% (мас. / Об.) ПЭГ 8000 и 20% (мас. / Об.) ПЭГ 400 и без DTT.Собственные данные были собраны на канале A1 в Корнеллской школе. Энергетический синхротронный источник (CHESS) и производные данные были собраны на канале X9A NSLS. Все дифракционные данные были обработаны с использованием пакета HKL (Otwinowski, Minor, 1997).

Таблица 1.

Резюме кристаллографического анализа

Определение и уточнение структуры

Для структуры комплекса 53BP1 – p53 начальные фазы были получены из раствора молекулярного замещения корового домена p53. структуры с использованием AMORE (CCP4 1994), и были использованы для определения местоположения двух атомов цинка в асимметричной единице (один цинк на молекулу p53) с использованием дифракционных данных MAD.Фазы MAD, рассчитанные с помощью программы MLPHARE (CCP4), имели средний показатель качества (FOM) Разрешение от 0,48 до 2,7 Å и было улучшено путем модификации плотности с помощью DM (CCP4). Несмотря на наличие всего одного цинка атома на 474 аминокислоты, экспериментальная карта была четко интерпретирована как для p53, так и для 53BP1, включая электронную плотность для большинства боковых цепей. Первоначальная модель 53BP1 была построена с помощью программы O (Jones et al.1991) и был уточнен CNS (Брюнгер и др., 1998). Статистика уточнения представлена ​​в таблице 1. Почти все остатки (99,6%) находятся в разрешенных областях графика Рамачандрана. N-концевой фрагмент (остатки 1702-1713) и область между β1A и α1A (остатки 1741-1769) не имеют интерпретируемой электронной плотности, и мы предполагаем, что они неупорядочены. Остатки 1741-1769 соответствуют вставке из 29 аминокислот, которая не обнаруживается в других повторах BRCT и богата полярными и заряженные остатки.Для области BRCT крысы Brca1 начальные фазы MIR были рассчитаны с помощью MLPHARE. У них был средний FOM От 0,42 до 3,4 Å, и были улучшены за счет разглаживания растворителя и модификации плотности с использованием DM. Модель построена по программе O и был уточнен ЦНС. Пять N-концевых остатков (остатки 1589–1593), часть из трех остатков межповторного линкера области (остатки 1702–1704) и С-конец (остатки 1800–1817) не имеют интерпретируемой электронной плотности, и мы предполагаем беспорядочные.Кроме того, остатки 1757–1775, которые образуют спираль α2B в структуре повторов BRCA1 BRCT человека (Williams et al. 2001) в наших кристаллах неупорядочены. Спираль α2B является наименее консервативным структурным элементом повторов Brca1 BRCT. В статистика уточнения представлена ​​в таблице 1. Все остатки находятся в разрешенных областях графика Рамачандрана.

Анализы связывания BACh2 in vitro

Точечные мутанты BRCA1 человека (остатки 1529–1863) конструировали путем перекрывающегося мутагенеза ПЦР, как описано ранее (Sambrook et al.1989) и в последовательности. Белки дикого типа и мутантные белки были сверхэкспрессированы и изолированы в виде слитых белков GST, как описано для крыса Brca1. Слитые белки GST очищали анионообменной хроматографией (Pharmacia Q-Sepharose Fast-Flow) и хранили. в 50 мМ трис-HCl (pH 8,5), 300 мМ NaCl и 5 мМ DTT при -80 ° C.

Экспрессионная плазмида, кодирующая часть BACh2, взаимодействующую с BRCA1 человека (остатки 888-1063), была создана, как описано ранее (Cantor et al.2001). Продукты BACh2, меченные ³⁵ S, были синтезированы с помощью трансляции in vitro (набор TNT, Promega) и протестированы на связывание со слиянием GST. белки, содержащие BRCA1 человека дикого типа (остатки 1529–1863) или 16 производных, содержащих различные точечные мутации. Слитые белки GST, связанные с гранулами глутатион-сефароза, инкубировали с меченным ³⁵ S BACh2 (888-1063) в течение 2 часов при 4 ° C с перемешиванием в буфере NET-N (20 мМ трис-HCl при pH 8.0, 0,5 М NaCl, 0,5% НП-40, и 1 мМ ЭДТА). После обширной промывки в буфере NET-N образцы обрабатывали на SDS-полиакриламидном геле. Затем гель был высушили и подвергли воздействию сканера Molecular Dynamics Storm Scanner. Активности связывания количественно оценивали с помощью программного обеспечения ImageQuant. (Молекулярная динамика).

Благодарности

Мы благодарим Х.Erdjument-Bromage из лаборатории микрохимии Слоуна-Кеттеринга для N-концевой последовательности и масс-спектроскопии. анализов, сотрудников лаборатории Павлетича и К. Ли за полезные обсуждения, К. Мюррея за административную помощь, сотрудники национального синхротронного источника света X4A и X9A и Корнельского высокоэнергетического синхротронного источника (CHESS) за помощью в сборе данных. Мы также благодарим M. Bennett и R. Wiseman за предоставление кДНК для крысиного Brca1.Этот Работа была поддержана NIH, Медицинским институтом Говарда Хьюза, Фондом Девитта Уоллеса и Фондом Сэмюэля и Мэя. Фонд Рудина. Координаты были депонированы в банке данных белка RCSB. Номера доступа PDB — 1KZY для 53BP1 – p53 и 1L0B для Brac1 крысы.

Расходы на публикацию этой статьи были частично покрыты за счет оплаты страницы. Поэтому эта статья должна быть настоящим помечены как «реклама» в соответствии с разделом 1734 Кодекса США 18 исключительно для того, чтобы указать на этот факт.

Сноски

• №4 Автор, ответственный за переписку.

• ЭЛЕКТРОННАЯ ПОЧТА nikola {at} xray2.mskcc.org; ФАКС (212) 717-3135.

• Статья и публикации находятся по адресу http: // www.genesdev.org/cgi/doi/10.1101/gad.959202.

• • Поступила 01.11.2001 г.
  • Принята к печати 7 января 2002 г.
• Лабораторный пресс Колд-Спринг-Харбор

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Произошла ошибка при настройке вашего пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.

Настройка вашего браузера для приема файлов cookie

Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:

• В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить, хотите ли вы принимать файлы cookie.
• Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
• Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
• Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
• Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.

Что сохраняется в файлах cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.

Страница не найдена | MIT

Перейти к содержанию ↓

• Образование
• Исследовать
• Инновации
• Прием + помощь
• Студенческая жизнь
• Новости
• Выпускников
• О MIT
• Подробнее ↓
  • Прием + помощь
  • Студенческая жизнь
  • Новости
  • Выпускников
  • О MIT

Меню ↓ Поиск Меню Ой, похоже, мы не смогли найти то, что вы искали!
Попробуйте поискать что-нибудь еще! Что вы ищете? Увидеть больше результатов

Предложения или отзывы?

32 регистратора — 32 записи

32 Регистрос
Fundado	1995 (1995)
Fundador	Джоэл Дорн, Роберт Миллер
Difunto	2001 (2001)
Género	Джаз, блюз, ритм-н-блюз, поп
País de origen	носотрос
Localización	Нуэва-Йорк

32 Records fue un sello discográfico establecido en 1995 для продюсера дискотек Джоэля Дорна и известного Роберта Миллера.Su sello de 32 Jazz — это выход из серии альбомов recopilatorios. Fue nombrado por el número deportivo Favorito de Dorn. También lanzó новый материал артистов комо The Jazz Passengers и Estableció 32 дочерних R&B, 32 Blues, 32 Groove и 32 Pop.

32 Records Adquirió las propiedades de los sellos Muse y Landmark, y estableció la вспомогательный 32 Jazz en 1997 con el objetivo de reeditar numerosas grabaciones de jazz. Завершение декады 1990 года, 32 Jazz lanzó una exitosa serie de compilaciones económicas de «Jazz para… «. El primero de ellos, Джаз для дождливого дня , fue lanzado en 1997 junto con Elle . En 1999, se había convertido en el main sello de jazz en las listas de Billboard , antes de que Verve Music Group слилась с участием Verve и GRP на солидном уровне.

В 2000 году, Миллер имеет преобразованный директор и исполнительный директор CDBeat, принадлежащий 32 Records к дочерним компаниям. En marzo de 2000, Dorn renunció a la empresa y formó Label M más tarde ese año.Tras la salida de Dorn, CDBeat anunció que Suspendería 32 Records en marzo de 2001, aunque en junio de 2000 contrató al продюсер Тодд Баркан для восстановления на Дорне. CDBeat, su vez, se convertiría en Spinrocket y luego en ConnectivCorp. Savoy Jazz Adquirió Los derechos de los catálogos Muse y Landmark de 32 Records в октябре 2003 года, после последних событий, ConnectivCorp имеет слияние с Majesco Entertainment.

Парциальная дискография

#	Альбом	Артист	Передние проблемы	нот
32001	Buscando un eco	Кенни Вэнс и лос Planotones	проблема грунтовки
32002	¡Venganza!	Чарльз Мингус	грунтовка lanzamiento no pirateado de este material	2CD
32003	El primer альбом	Комната, полная блюза
32004	Prisioneros del amor	Grupo Robert Miller	грунтовка lanzamiento
32005	Reentrada	Гораций Сильвер
32006	Чистый Моисей	Моуз Эллисон
32007	Torcido индивидуальные	Los pasajeros del jazz	грунтовка lanzamiento
32008	Por el amor de Monk	Varios artistas		Incluye dos actaciones de Monk inéditas
32009	Брильо-дель-Финал-дель-Хуэго	Сонни Ститт	¡Афинар! (Muse MR 5334) Constelación (Muse MR 5323)
32010	Полный цикл занятий Muse	Персона де Хьюстон и Рон Картер	Algo en común (Muse MR 5376) Ahora es el momento (Muse MR 5421)
32011	Las Sesiones Completetas de Landmark	Куартето Кронос	Monk Suite (Landmark) Música de Bill Evans (Landmark)
32012	…pensándolo bien	Хосе Фелисиано
32013	En mis Tiempos	Айк и Тина Тернер	грунтовка lanzamiento
32014	Leyenda de la Estrella Solitaria	Дэвид «Толстяк» Ньюман	¡Todavía tiempos Difíciles (musa) resurgimiento! (Муса)
32015	Dos álbumes clásicos	Комната, полная блюза	Эдди «Чистоголовый» Винсон и Комната, полная блюза (Muse MR 5282) … con Big Joe Turner
32016	Музыка дю Буа	Фил Вудс	Муса
32017	Cuerpo y alma	Аль Кон и Зут Симс	Муса
32018	Бар Варс	Уиллис Джексон	грунтовка lanzamiento
32019	Эль-Монтран	Вуди Шоу	Muse (MR 5472)
32020	Objetos perdidos	Персона де Хьюстон и Чарльз Браун	грунтовка lanzamiento (пистас 1-7) Wild Flower (1977; Muse) (пистас 8-12)
32021	Huellas	Пэт Мартино
32022	Clase Maestra	Хэнк Джонс	‘ Bop Redux (Muse) Groovin’ High (Muse)
32023	Suavemente hablado aquí	Кенни Бэррон	Loto Dorado (Musa) Del atardecer al amanecer (Muse)
32024	ltimo de la línea	Вуди Шоу	Кассандрит (муса) Танец любви (муса)
32025	Голпир эль-джаз	Varios artistas	Compilacion
32026	Canciones que hicieron que el teléfono se iluminara	Varios artistas	Compilacion
32027	Лос-охос-де-ми-мадре	Этта Джонс	Muse MR 5145
32028	De la nada	Сонни Ститт	Муса
32029	Эпистрофия	Чарли Роуз	Punto de referencia
32030	Эль-Рейнгресо	Джек Макдафф
32031	Fácil fácil	Джонни Литл	Манос рапидас (Muse) Tierra feliz (Muse)
32032	Años caninos en el cuarto anillo	Рахсаан Роланд Кирк	2CD de material inédito más Natural Black Inventions: Root Strata (Atlantic SD 1578)	3CD
32033	B-3in ‘	Varios artistas	Compilacion
32034	Navidad con Houston Person y Etta Jones	Персона де Хьюстон и Этта Джонс
32035	Mejores actaciones	Том Джонс	«… extraído de su serie de televisión de 1980-1981 «	2CD
32036	Робадо … и другие моменты	Марк Мерфи		2CD
32037	Вайб Мудрый	Бобби Хатчерсон	Esquemas de color Good Bait (punto de referencia) (paisaje)	2CD
32038	Aspectos destacados de la primera mitad	Кенни Бэррон
32039	Viaje oscuro	Вуди Шоу	Compilacion	2CD
32040	Perdido en la confusión	Джимми Рид	Compilacion
32041	Crema	Пэт Мартино	Compilacion
32042	De vez en cuando	Моргана Кинг	No puedo dejar de amarte (Muse) Esto es siempre (Muse)	2CD
32043	Fuego	Карлос Гарнетт	Compilacion
32044	Сегун г-н Рони	Уоллес Рони	Compilacion	2CD
32045	Sintiéndolo juntos	Джеймс Муди	Муса
32046	Наима	Сидар Уолтон	Муса
32047	Groove de Groove	Ричард «Грув» Холмс	recopilación de material de Muse
32048	Сьюдад-де-Йерро	Грант Грин	Муса
32049	Crisscraft	Сонни Крисс	Муса
32050	Cabeza y Corazon	Пэт Мартино	Conciencia (Muse) Live! (Муса)	2CD
32051	Por si acaso olvidaste lo malo que era en realidad	Сонни Ститт	грунтовка lanzamiento
32052	Mujeres turcas en el baño	Пит Ла Рока	Блисс де Чик Кориа (Муза)	мошенник Джон Гилмор
32053	Es el señor Fathead	Дэвид «Толстяк» Ньюман	Fathead: Ray Charles представляет Дэвида Ньюмана (Atlántico) Straight Ahead (Atlántico) Fathead Comes On (Atlántico) Дом Давида (Атлантико)	2CD
32054	Мемфис, Ray y un toque de mal humor	Хэнк Кроуфорд	Más Soul (Atlántico) Del corazón (Atlántico) Душа Баллады (Atlántico) Dig these Blues (Atlántico)	2CD
32055	Capítulos 1 год 2	Малгрю Миллер
32056	Vivir en Filadelfia	Zoot Sims	грунтовка lanzamiento
32057	El bateador pesado	Эдди «Локджоу» Дэвис
32058	Мажорный джаз, минор-блюз	Ларри Кориелл	recopilación de material de Muse
32059	El hombre del gran патио delantero	Юсеф Латиф	The Complete Yusef Lateef (Atlántico) de Yusef Lateef Детройт (Atlántico) Silencio ‘n’ Trueno (Atlántico) El médico está en… y por fuera (Atlántico)	3CD
32060	Ases espalda con espalda	Рахсаан Роланд Кирк	Izquierda y derecha (Atlántico) Rahsaan Rahsaan (Atlántico) Prepárese para lidiar con un milagro (Atlántico) Música de otra gente (Atlántico) 91	4CD
32061	Jazz para una tarde lluviosa	Varios artistas	Compilacion
32062	Уиллис… con Pat	Пэт Мартино и Уиллис Джексон
32063	Estándares de Jazz	Марк Мерфи	recopilación de material de Muse	2CD
32064	Relajado	Кенни Баррелл	recopilación de material de Muse
32065	Ричи и Ричи и Фил	Ричи Коул		con Phil Woods
32066	Groove Jammy	Varios artistas	Compilacion
32067	Mayor que la suma de sus partes	Эдди Харрис	El In Sound (Атлантико 1448) Los verdes medios (Атлантико 1453) La Tormenta tierna (Атлантико 1478) Ciclos de plata (Atlántico 1517)	2CD
32100	Un ocho de pie	Рахсаан Роланд Кирк	El regreso del 5000 Lb.Человек (Warner Bros. BS 2918) Kirkatron (Warner Bros. BS 2982) Буги-вуги String Along for Real (Warner Bros. BSK 3085)	2CD
32142	Gancho izquierdo, крус дереча	Рахсаан Роланд Кирк	Esclavitud voluntaria (Атлантический SD 1534) Blacknuss (Атлантический SD 1601)

Fuente: «32 Jazz: Una lista de verificación»

Ссылка

enlaces externos

% 20sidney% 20 фотографий в Хите на Flickr | Flickr

новое сообщение icnflickr-free-ic3d pan white

• Проводить исследования
  • Последние фото
  • В тренде
  • События
  • Общество
  • Flickr Галереи
  • Карта мира
  • Поиск камеры
  • Блог Flickr
• Печать
  • Принты и настенное искусство
  • Фотокниги
• Получить Pro

• • Загрузить
  • Авторизоваться
  • Зарегистрироваться
  • Авторизоваться
  • Проводить исследования
  • В тренде
  • События
  • Общество
  • Flickr Галереи
  • Блог Flickr
  • Принты и настенное искусство
  • Фотокниги
  • Получить Pro
  О Вакансии Блог Разработчики Методические рекомендации Помощь Справочный форум Конфиденциальность Условия
• Файлы cookie
английский
• Проводить исследования
• В тренде
• События
• Более
Более

Теги % 20sidney% 20heath

• Около
• Вакансий
• Блог
• Разработчики
• Руководящие принципы
• Конфиденциальность
• Условия
• Справка
• Сообщить о нарушении
• Справочный форум
• английский
• SmugMug + Flickr.