Аренда фронтального погрузчика АМКОДОР ТО-18Б2 в Москве и области
Аренда фронтального погрузчика АМКОДОР ТО-18Б2
Компания „Проспект-НТМ” предлагает арендовать фронтальный погрузчик АМКОДОР ТО-18Б2 в Москве и области для выполнения самых разнообразных задач. С нами сотрудничают строительные, ЖКХ организации, муниципальные учреждения. Спецтехника позволяет решать поставленные задачи быстро и профессионально.
Технические характеристики фронтального погрузчика АМКОДОР ТО-18Б2
Масса погрузчика, т — 10,7 Есть вопросы по аренде? Задавайте их нашему консультанту +7 (985) 687-62-27 Заказать звонок
Мощность двигателя, л.с. — 130
Объем ковша, м³ — 1,9
Высота выгрузки погрузчика, м — 2,8
Максимальная грузоподъемность, т — 3,4
Фронтальный погрузчик АМКОДОР ТО-18Б2 — это универсальное решение для выполнения массы разнообразных задач. Маневренный, грузоподъемный, надежный. Его по достоинству оценили строители, дорожники, такелажники при выполнении регулярных и разовых работ на производстве. Это одна из самых популярных моделей погрузчиков среди своего класса спецтехники, которая многократно подтвердила свою надежность и многофункциональность.
Особенности использования фронтального погрузчика АМКОДОР ТО-18Б2, сфера применения
Этот агрегат погрузочно-разгрузочной спецтехники подходит для применения в промышленном, гражданском, дорожном строительстве. Используется для проведения монтажных, такелажных, вспомогательных работ. Благодаря продуманной и современной конструкции, функционалу, погрузчик АМКОДОР ТО-18Б2 будет кстати на любой рабочей площадке.
Cильными сторонами модели являются:
Мощная гидравлическая система — двухнасосная гидравлика снабженная приоритетным клапаном для рулевой манипуляции, гидрораспределитель прямого управления.
Точная рулевая система — рама шарнирно-сочлененного типа дополненная гидроприводом и снабженная гидравлической обратной связью, аварийным насосом с приводом от ведущих колес.
Сверх устойчивые стоячая и аварийная тормозные системы. За основу взяты сухой тип тормозной системы на базе однодисковой конструкции. Особую устойчивость погрузчику придают тормозной механизм дополненный пружинным сжатием, гидравлическим растормаживанием.
Надежная активная тормозная система. В основе конструкции лежат многодисковые тормозные механизмы погруженные в масло. Модули снабжены раздельным гидравлическим приводом для каждого моста
Преимущества аренды фронтального погрузчика АМКОДОР ТО-18Б2 в нашей компании
Удобные варианты аренды спецтехники. Предлагаем как почасовую аренду, так и сменную. Оплачивайте только нужные вам рабочие часы без простоя. Гибкие условия и простота сотрудничества — это про нас.
Приятные и честные цены на аренду техники круглый год. Арендуйте технику в любой день недели без поправки на праздники и выходные. Единая сетка тарифов для всех заказчиков.
Высококвалифицированные операторы. Гарантируем быстрое, точное, аккуратное выполнение работ. Предоставляем только обученных сотрудников работающих на результат.
Всегда обслуженная и подготовленная к работам спецтехника. Тщательно следим за техническим состоянием сдаваемых в аренду рабочих единиц. Будьте уверены, что мы не подведем какой бы сложной не была задача.
Оперативность и исполнительность. Большой автопарк собственной спецтехники позволяет нам приступить к началу выполнения работ в день обращения клиента. Не теряйте время в пустую. Свяжитесь с оператором, подайте заявку, получите исполнителя.
Если для вас важны высокая производительность рабочего цикла, малые сроки исполнения, то фронтальный погрузчик АМКОДОР ТО-18Б2 точно пригодится. Свяжитесь с нами по телефону или через сайт, арендуйте нужную спецтехнику уже сегодня.
Пальцы, втулки для фронтального погрузчика ТО-18Б2 (Амкодор) в России: низкие цены, доставка
Пальцы, втулки для фронтального погрузчика ТО — 18Б2 (Амкодор). В наличии.Более подробная информация по тел. (846) 22 — 10 — 810. Так же поставляем: Барабан тормозной У2210. 03 — 00. 051 Барабан тормозной 151. 38. 114 — 2 Блок клапанов У35. 615 — 12. 140 Блок разгрузочный УГА2 — 01. 01. 000 Блок управления -8 — 1 Блок управления 100ВНМ Вал ТО — 28. 04. 01. 001 Вал ТО — 18Б. 80. 01. 009 Вал ТО — 18Б. 80. 01. 007 Вал ТО — 28А. 02. 04. 008 Вал выходной У35. 605 — 00. 501 Вал заднего хода У35. 615 — 01. 301 (У35. 605 — 00. 587) Вал карданный ГМКП заднего моста 375 — 2202010 — 03 Вал карданный ТО — 18Д. 04. 00. 100 Вал карданный 509П — 2218010 — 12 Вал карданный КИС — 0104040 — 30 Вал карданный ТО — 18. 04. 03. 000 Вал карданный КИС — 0106860 — 04 Вал карданный 157КД — 2202011 — 02 Вал на опору ТО — 18А. 04. 02. 001 Вал промежуточный У35. 615 — 01. 351 (У35. 605 — 00. 547) Вал-шестерня У35. 605 — 00. 063 Вал-шестерня У2210. 20Н — 2-05. 022 Вал-шестерня ТО — 18Д. 02. 05. 022 Вал-шестерня ТО — 18. 02. 04. 008 Вал-шестерня У35. 615 — 00. 502 Водило в сб. с сателлитами У2210. 20Н — 2-05. 200 Водило в сб. с сателлитами У2210. 03А — 00. 030 Водило в сб. с сателлитами 150. 39. 012 — 4Б Водило в сб. с сателлитами 208А — 26. 04. 300 Водило 451. 16. 40. 020 Втулка ТО — 18. 02. 00. 008 Втулка ТО — 18. 02. 00. 009 Втулка ТО — 18. 02. 04. 902 Втулка ТО — 18. 05. 01. 004 Втулка ТО — 18. 14. 06. 001 Втулка ТО — 18А. 01. 00. 011 Втулка ТО — 18Б. 14. 01. 001 Втулка ТО — 18Б. 71. 00. 003 Втулка ТО — 28. 14. 05. 001 Втулка ТО — 28А. 05. 01. 001 Втулка У2210. 20Н — 2-03. 013 Втулка ТО — 28. 14. 03. 001 (95/80х70) Втулка-шестерня У2210. 20Н — 2-05. 025 Втулка ТО — 49. 01. 00. 004 Гидрораспределитель РГС — 16. 2 (2-х секц.) Гидрораспределитель РГС — 25Г (2-х секц., гидравлический) Гидрораспределитель РГС — 25 (2-х секц., механический) Гидрораспределитель 26. 14. 01. 000 Гидрораспределитель РГС16. 6 Гидросистема рулевого управления ТО — 18Д. 08. 00. 000 Гидроруль У245. 006. 00 (1000 мс3) Гидроруль У245. 009. 00 (1000 мс3) Гидротрансформатор А00. 000 — 00. 002 (КПП Польша) Гидротрансформатор 22. 17099 (Минск) Гидротрансформатор 22. 17099АЛ (алюмин.) Гидротрансформатор 22. 17099Н (нов. обр., КПП Минск) Гидроцилиндр ковша 322. 06. 11. 000 Гидроцилиндр ковша 352. 61. 03. 100Б Гидроцилиндр ковша ТО — 18А. 06. 01. 000 Гидроцилиндр ковша ТО — 18А. 06. 18. 000 Гидроцилиндр ковша ТО — 18Б. 06. 03. 100 Гидроцилиндр ковша ТО — 28А. 06. 26. 000 Гидроцилиндр ковша ТО — 28А. 06. 01. 000 Гидроцилиндр ковша 13. 62. 50. 000 Гидроцилиндр ковша 13. 63. 20. 000 Гидроцилиндр руля ТО — 28. 78. 08. 000 Гидроцилиндр руля ТО — 18А. 08. 03. 000 Гидроцилиндр руля ТО — 18Б. 08. 03. 000 Гидроцилиндр руля ТО — 30. 46. 01. 00 Гидроцилиндр стрелы 13. 61. 50 Гидроцилиндр стрелы ТО — 18А. 06. 03. 000 Гидроцилиндр стрелы ТО — 18Б. 06. 19. 000 Гидроцилиндр стрелы ТО — 28А. 06. 25. 000 Гидроцилиндр стрелы 322. 06. 02. 000 Гидроцилиндр ковша 322. 06. 11. 000 ГМКП У35. 615 — 00. 000 — 08 ГМКП У35. 615 — 00. 000 — 14 ГМКП У35 — 605 — 32 Датчик 18. 38. 29 Датчик давления гидросистемы ДД — 20 Демпфер МЭР — 24. 03. 65. 000 Демпфер ТО — 18. 02. 04. 100 Демпфер МЭР — 24. 02. 65. 000 Диск У2210. 20Н — 02. 03. 105 — 01 Диск У2210. 20Н — 02. 03. 101 Диск У2210. 20Н — 02. 00. 052 Диск ведомый У2210. 20Н — 02. 02. 160 Диск ведущий У2210. 20Н — 02. 02. 153 Диск ведущий У2210. 20Н — 02. 02. 153 — 02 Диск У35. 615 — 01. 062 (У35. 605М — 01. 004 — 02) Диск ведомый 150. 37. 074 Диск ведомый ТО — 33. 05. 04. 320 Диск ведущий У35. 615 — 01. 016 Диск опорный У35. 615 — 01. 068 (У35. 605М — 01. 003 — 02) Дифференциал 342. 05. 01. 070 Дифференциал У2210. 02 — 03. 050 Дифференциал ОДМ. 72. 013 Камера тормозная передняя с энергоакком. 20. 3519100 — 01 Камера тормозная передняя с энергоакком. 20. 3519100 — 11 Клапан У35. 605М — 05. 000 Клапан У35. 605М. 04. 000 — 03 Клапан РГС25Г — 12. 12. 100 Клапан обратный ТО — 28. 29. 17. 000 (ТО — 18Д. 08. 04. 000) Клапан обратный ТО — 28. 29. 20. 000 (ТО — 28. 29. 19. 000) Клапан обратный УГА1 — 07. 01. 000 Клапан обратный ТО — 18Д. 08. 04. 000 Клапан обратный 9КОТ16 — 3ТК Клапан предохранительный ТО — 27 — 1-1 — 16. 01. 07. 000 Клапан предохранительный ТО — 18Б. 08. 20. 000 Клапан приоритетный 141 — 11000 Колесо зубчатое У2210. 20Н — 2-3. 107 — 01 Колесо зубчатое У2210. 20Н — 2-3. 110 — 02 Колесо зубчатое 342. 05. 01. 073 Колесо зубчатое 8047. 02. 01. 006 Колонка рулевая У781079 — 0201750 — 01 Коромысло ковша 322. 14. 02. 000 Коромысло ковша ТО — 18Б. 14. 02. 000 Коромысло ковша 342С4. 14. 02. 000 (ТО — 28. 14. 02. 000) Коромысло ковша ТО — 28. 14. 02. 100 Кран тормозной УГА2 — 05. 01. 000 Кран тормозной УГА2 — 05. 02. 000 Крышка У35. 615 — 01. 081 Крышка У35. 615 — 01. 080 Крышка У35. 615 — 09. 011 (У35. 615 — 01. 012 — 01) Крышка У35. 615 — 09. 080 Крышка У35. 605 — 00. 270 Крышка ТО — 18. 02. 04. 501 Крышка ТО — 28. 02. 05. 004 Крышка ТО — 28А. 02. 04. 003 Крышка Д — 565. 3110 — 66 Крышка У2210. 20Н — 2-03. 003 Крышка ТО — 28А. 04. 00. 101 Крышка ТО — 28А. 04. 00. 102 Крышка ТО — 18А. 01. 015 — 01 Крышка У35. 615 — 09. 010 — 02 Комплект дисков колесного тормоза А00. 000 — 00. 078 Комплект пальцев и втулок рабочего оборудования А00. 000 — 00. 025 Комплект пальцев и втулок рабочего оборудования ТО — 18А. 14. 00. 000РО Комплект пальцев и втулок рабочего оборудования ТО — 28. 14. 00. 000РО Механизм тормозной У35. 615 — 35. 510 Механизм управления ТО — 18Д. 09. 02. 000 Механизм управления ТО — 18Д. 09. 06. 000 Мост ведущий в сборе ОДМ 73001А Мост 342Р. 05. 01. 00 Муфта У35. 615 — 01. 517 Муфта У35. 615 — 01. 518 Муфта У35. 605 — 00. 556 Муфта привода гидронасоса ТО — 25. 10. 01. 042 Муфта эластичная МЭР — 24. 02. 65. 030 Обод ТО — 28. 05. 02. 100 Обод ТО — 28. 05. 02. 200 Обод ТО — 28А. 05. 04. 200 Обод ТО — 18Б. 05. 04. 200 Обод 332В. 05. 01. 100 Обод 332В. 05. 01. 200 Обод ТО — 18Б. 05. 09. 100 Опора ТО — 18. 02. 00. 002 Опора кардана ТО — 28А. 04. 00. 103 Опора кардана ТО — 18. 04. 02. 000 — 01 Опора кардана ТО — 18. 04. 02. 000 — 02 Опора кардана ТО — 18А. 04. 03. 000 Опора кардана 322. 04. 01. 000 Опора кардана ТО — 18. 04. 02. 000 Опора кардана ТО — 28. 04. 01. 000 Палец ТО — 18А. 04. 00. 007 Палец ТО — 18А. 01. 00. 009 Палец ТО — 18А. 08. 00. 004 Палец ТО — 18А. 05. 00. 002 Палец ТО — 18А. 05. 00. 003 Палец ТО — 18Б. 14. 00. 004 Палец ТО — 18Б. 14. 00. 006 Палец ТО — 18Б. 71. 00. 001 Палец ТО — 18Б. 71. 00. 002 Палец ТО — 28. 14. 00. 002 Палец ТО — 28. 14. 00. 015 Палец ТО — 28. 14. 00. 016 Палец ТО — 28А. 05. 00. 001 Палец ТО — 28. 01. 40. 000 Пневмогидроаккумулятор ПГА 1. 0 Полумуфта У35. 605 — 00. 552 Полумуфта ТО — 28. 02. 04. 014 Полумуфта ТО — 28. 02. 04. 017 Полумуфта ТО — 25. 10. 02. 007 Полуось У2210. 20Н — 2-00. 003 (г/мост) Полуось У2210. 03Д — 00. 002 (Унимод) Полуось ТО — 33. 05. 14. 400 (Харьков, левая) Полуось 151. 39. 104 — 3 (Харьков, правая) Полуось У2210. 20Н — 2-00. 003С (21 шлиц) Полурама задняя ТО — 18Б. 01. 02. 000 Полурама задняя ТО — 28. 01. 20. 000 Полурама передняя ТО — 28А. 01. 01. 000 Полурама передняя ТО — 18Б. 01. 01. 000 Полурама передняя ТО — 18Б2. 01. 01. 000 Радиатор 371ТА — 7. 200 Радиатор водяной МО4У. 13. 003 — 01 Рамка балансирная ТО — 18А. 05. 02. 100 Рамка балансирная ТО — 28А. 05. 01. 000 Рамка балансирная ТО — 30. 20. 01. 100 Регулятор давления 80 — 3512010 Редуктор отбора мощности ТО — 28А. 02. 04. 000 — 01 Редуктор отбора мощности ТО — 28А. 02. 04. 000 Редуктор отбора мощности ТО — 28. 02. 05. 000 Редуктор отбора мощности ТО — 18Б. 80. 01. 000 — 02 Редуктор отбора мощности ТО — 18Б. 80. 01. 000 Редуктор отбора мощности ТО — 18Д. 02. 05. 000 Редуктор отбора мощности ТО — 25. 10. 04. 000 Редуктор отбора мощности ТО — 18. 13. 01. 000 Сателлит У2210. 20Н — 2-02. 170 Сателлит У2210. 20Н — 2-05. 207 Сателлит 150. 39. 106 — 3 Сателлит У2210. 03 — 00. 045 Стрела ТО — 18А. 14. 05. 000 Стрела ТО — 18Б. 14. 01. 000 Стрела ТО — 28А. 14. 01. 000 (ТО — 28. 14. 05. 000) Ступица-картер 150. 39. 101 — 2Е Ступица У2210. 20Н — 2-03. 300 — 02 Ступица У35. 615 — 01. 090 (У35. 605 — 00. 011) Ступица У2210. 03А — 00. 040 Ступица У2210. 03А — 00. 049 Ступица У2210. 03 — 00. 058 Суппорт тормоза У2210. 20Н — 03. 002 Тормоз колесный У2210. 20Н — 2-03. 100 — 03С Тяга ковша ТО — 28. 14. 03. 000 Фильтр CCH 302 h261449 Фильтр магистральный ФСК — 20 — 3-25М Фильтр магистральный УГА1 — 08. 01. 000 Фильтр магистральный ТО — 28А. 07. 04. 000 Фильтр магистральный ТО — 18Б. 08. 04. 000 Фильтр У35. 615 — 12. 100 Фильтр 260 — 1028010 (очистки масла) Фильтр топливного бака ТО — 18. 06. 01. 130 Фильтр топливный ФТ020 — 1117010 Фильтрующий элемент Р — 635 — 1-06 Фильтрующий элемент А00. 000 — 00. 021 Фильтрующий элемент Р — 661 — 1 Фильтрующий элемент А00. 000 — 00. 022 Фильтрующий элемент Р — 605Г — 1-06 Фильтрующий элемент 260 — 1109300 Фильтрующий элемент Т — 150 — 1109560 Фильтрующий элемент масляный 840 — 1012040 Фильтрующий элемент масляный 260 — 1017060 Фильтрующий элемент топливный 240 — 1117030 Фланец У2210. 02 — 03. 020 Фланец 342В. 03. 01. 140 Фланец ТО — 33. 05. 14. 201 Фланец ТО — 28А. 02. 04. 023 Фланец ТО — 28А. 02. 04. 013 Фланец Д — 902. 10. 17. 000 Фланец У35. 605 — 00. 290 Фланец У35. 605 — 00. 140 Фланец ТО — 18Д. 02. 05. 033 Фланец ТО — 28А. 02. 04. 013 Фланец-втулка ТО — 25. 21. 02. 002 (ТО — 18. 04. 03. 000) Фрикцион У35. 615 — 01. 060 Фрикцион У35. 615 — 01. 060 — 01 Цапфа У2210. 20Н — 2-03. 019 Цапфа У2210. 03А — 00. 006 Цапфа ТО — 33. 05. 15. 101 Шестерня ТО — 18. 03. 01. 007 Шестерня ТО — 18Б. 80. 01. 006 Шестерня ТО — 28А. 02. 04. 015 Шестерня 350. 02. 04. 001 Шестерня 350. 02. 04. 005 Шестерня ТО — 18Д. 02. 05. 026 Шестерня ТО — 18Б. 80. 01. 019 Шестерня У35. 615 — 01. 180 — 01 (У35. 605 — 00. 180) Шестерня У35. 615 — 01. 180 (У35. 605 — 00. 190) Шестерня У2210. 20Н — 2-03. 025 Шестерня У35. 615 — 01. 305 Шестерня ТО — 18. 02. 04. 401 Шестерня ТО — 18. 02. 04. 908 Шестерня ТО — 18. 02. 04. 903 Шестерня ТО — 18Д. 02. 05. 061 Шестерня ТО — 28А. 02. 04. 004 Шестерня ТО — 28А. 02. 04. 005 Шестерня ТО — 28А. 02. 04. 006 Шестерня ТО — 18А. 02. 04. 251 Шестерня У35. 615 — 01. 402 Шестерня У35. 615 — 01. 200 Шестерня У35. 615 — 01. 402 (У35. 605 — 00. 508) Шестерня У35. 615 — 01. 353. 01 (У35. 605 — 00. 531) Шестерня У35. 615 — 01. 407 (У35. 605 — 00. 551) Шестерня У35. 615 — 01. 302 (У35. 605 — 00. 588) Шестерня У35. 615 — 01. 354. 01 (У35. 605 — 00. 537) Шестерня У35. 605 — 00. 536 (У35. 615 — 01. 352. 01) Шестерня ведомая 695Н. 38. 104 Шестерня ведомая У2210. 02 — 03. 052 Шестерня ведомая ТО — 49. 09. 00. 002 Шестерня ведущая 695Н. 38. 103 Шестерня коронная У2210. 03 — 00. 057 Шестерня полуоси гидромоста 342. 05. 01. 074 Шестерня солнечная У2210. 03 — 00. 002 Шестерня солнечная 150. 39. 110 — 3 Шестерня У35. 615 — 09. 012 (У35. 615 — 01. 516)
Амкодор 333А (ТО-18Б2), Амкодор 333В (ТО-18Б3)
Грузоподъемность, кг
3400
Номинальная вместимость ковша, м3
1,9
Вырывное усилие, кг
10500
Статическая опрокидывающая нагрузка в сложенном положении (±40°), кг
7000
Ширина режущей кромки ковша, мм
2500
Высота разгрузки, мм
2800
Вылет кромки ковша, мм
900
Радиус поворота, мм
5600
Шины, дюйм
21,3 / 24
Длина, мм
7100
Ширина, мм
2500
Колея, мм
1930
Высота (по крыше кабины), мм
3400
Эксплуатационная масса, кг
10500
Трансмиссия
гидромеханическая
Скорость передвижения, вперед/назад, км/ч:
1 передача
0-6,5/0-6,6
2 передача
0-11,7/0-22,4
3 передача
0-21,8
4 передача
0-37,0
Амкодор 333А
Амкодор 333В
Двигатель
Д-442МСИ
Д-260. 2
Эксплуатационная мощность, кВт (л.с.)
95 (130)
90,4 (123)
Заправочные емкости , л:
Топливный бак
215
Гидробак
110
Тормозная система:
Рабочая тормозная система — многодисковые тормозные механизмы в «масле»,с раздельным гидравлическим приводом по мостам
Cтояночная и аварийная тормозные системы — oднодисковый сухой тормозной механизм с механическим приводом
Рулевое управление — шарнирно-сочлененная рама с гидравлическим приводом, гидравли- ческой обратной связью и аварийным насосом с приводом от ведущих колес
Гидравлическая система — двухнасосная с приоритетным клапаном для рулевого управления и гидрораспределителем с прямым гидравлическим управлением
Сменные рабочие органы (по дополнительному заказу):
Ковши (вместимость 1,5м3; 2,3м3; 3м3)
Крановая безблочная стрела
Захват челюстной
Бульдозерный отвал
Отвал поворотный для снега
Вилы грузовые
Стогометатель
Захват лаповый
Погрузочное оборудование с удлиненной стрелой (вместимость ковшей: 1,5 м3; 1,9м3; 2,3м3; 3м3)
Погрузчик амкодор то-18б2 2003 г.
в. нар-ка1000м/ч
Амкодор ТО-18Б2 2003 г.в.пробег 1000 мч.Мотор алтайский 6 цилиндровый.Можно например дополнить различными навесками.
Фронтальный погрузчик ТО-18Б2 (АМКОДОР-333А)
ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
Грузоподъёмность, килограмм
3 400
Начальная Емкость ковша, куб.м
1,9
Вырывное усилие, килограмм
10 500
Статическая запрокидывающая загрузка в сложенном положении (±40 градусов), килограмм
7 000
Ширина режущей кромки ковша, миллиметров
2 500
Высота выгрузки, миллиметров
2 800
Вылет кромки ковша, миллиметров
900
Радиус разворота, миллиметров
5 600
Шины
21,3-24
Длина, миллиметров
7 100
Ширина, миллиметров
2 500
Колея, миллиметров
1 930
Высота (по крыше кабины), миллиметров
3 400
Применимая масса, килограмм
10 500
Трансмиссия
гидромеханическая
Быстрота перемещения вперед/назад, км/ч:
1 передача
0-6,5/0-6,6
2 передача
0-11,7/0-22,4
3 передача
0-21,8
4 передача
0-37,0
Двигатель
А-01МКС
Применимая производительность, кВт (л. с)
95 (130)
Заправочные емкости , л:
Объём топливного бака
215
Гидробак
110
Тормозной Система
действующая тормозной Система — многодисковые тормозные Системаы в «масле»,с распредельным гидравлическим приводом по мостам
Cтояночная и аварийная тормозные Механизмы — oднодисковый сухой тормозная Механизм с механическим приводом
Рулевое координирование — шарнирно-сочлененная рама с гидравлическим приводом, гидравлической обратной связью и аварийным насосом с приводом от ведущих колес
Гидравлической Система — двухнасосная с приоритетным клапаном для рулевого координирования и гидроразделителем с прямым гидравлическим координированием
заменные действующие орган
2 «. Еще 2 аналогичные замены.
Шаг 1:
Уравнение в конце шага 1:
((12 • (b 6 )) + (6 • (b 3 ) )) - (2 • 3 2 б 2 )
Шаг 2:
Уравнение в конце шага 2:
((12 • (b 6 )) + (2 • 3b 3 )) - (2 • 3 2 b 2 )
Шаг 3:
Уравнение в конце шага 3:
((2 2 • 3b 6 ) + (2 • 3b 3 )) - (2 • 3 2 b 2 )
Шаг 4:
Шаг 5:
Вытягивание как термины:
5. 1 Факторы вытягивания:
12b 6 + 6b 3 — 18b 2 = 6b 2 • (2b 4 + b — 3)
Калькулятор полиномиальных корней:
5.2 Найти корни (нулей) из: F (b) = 2b 4 + b — 3 Калькулятор полиномиальных корней — это набор методов, направленных на поиск значений b, для которых F (b) = 0
Тест рациональных корней является одним из вышеупомянутые инструменты. Он может найти только рациональные корни, то есть числа b, которые можно выразить как частное двух целых чисел
Теорема рационального корня утверждает, что если полином обнуляется для рационального числа P / Q, то P является множителем конечной константы и Q является множителем ведущего коэффициента
В этом случае ведущий коэффициент равен 2, а конечная константа — -3.
908 корень многочлена, то этот многочлен можно разделить на q * xp. Обратите внимание, что q и p происходят от P / Q, уменьшенного до его младших членов
В нашем случае это означает, что 2b 4 + b — 3 можно разделить с b — 1
Полиномиальное деление в длину:
5.3 Полиномиальное деление в длину Деление: 2b 4 + b — 3 («Дивиденд») По: b — 1 («Делитель»)
Дискретная математика с приложениями 4-е издание Глава 6 — Теория множеств — Набор упражнений 6.1 — стр. 350 7
A = {x ∈ Z | x = 6a + 4 для некоторого целого числа a}, B = {y ∈ Z | y = 18b — 2 для некоторого целого числа b}, и C = {z ∈ Z | z = 18c + 16 для некоторого целого числа c} а. Ложь, A ⊈ B. Противоречие: Предположим, что x — частный, но произвольно выбранный элемент из A и B. По определению A существует целое число a такое, что x = 6a + 4. По определению B существует целое число b такое, что x = 18b — 2. Под заменой следует, что: 6a + 4 = 18b — 2 б = (6а + 4 + 2) / 18 = (6а + 6) / 18 = (а + 1) / 3 Поскольку b = (a + 1) / 3, то b не является целым числом, поскольку является частным. Отсюда следует, что b не является целым числом, а b — целым числом; противоречие. Следовательно, предположение неверно и A ⊈ B. Контрпример: в A есть элементы, которых нет в B. Например, если a = 3 — конкретный, но произвольно выбранный элемент в A, то x = 6 (3) + 4 = 22. Если x = 22 — элемент в B, то: 22 = 18b — 2 б = (22 + 2) / 18 = 24/18 = 6 * 4 / (6 * 3) = 4/3 б = 4/3 Поскольку b = 4/3, b не является целым числом, поскольку является частным. Отсюда следует, что b не является целым числом, а b — целым числом; противоречие.Следовательно, предположение неверно и A ⊈ B. б. Правда, B⊆A Доказательство. Предположим, что y — частный, но произвольно выбранный элемент B. По определению B существует целое число b такое, что y = 18b — 2. [18b — 2 = 6a + 4 a = (18b — 6) / 6 = 3b — 1] Пусть a = 3b — 1. Тогда a — целое число, поскольку это сумма целых чисел. Подстановкой 6a + 4 = 6 (3b — 1) + 4 = 18b — 6 + 4 = 18b — 2. Следовательно, по определению A, x является элементом A. c.C⊆B Доказательство того, что B⊆C: Предположим, что y — частный, но произвольно выбранный элемент B. По определению B существует целое число b такое, что y = 18b — 2. [18b — 2 = 18c + 16 c = (18b — 18) / 18 = b — 1] Пусть c = b — 1. Тогда c — целое число, так как это сумма целых чисел. Подставляя c в определение C, получаем 18c + 16 = 18 (b — 1) + 16 = 18b — 18 + 16 = 18b — 2 = x. Следовательно, по определению C, x является элементом C. Доказательство того, что C⊆B: Предположим, что z — частный, но произвольно выбранный элемент C.По определению C существует такое целое число c, что z = 18c + 16. [18c + 16 = 18b — 2 b = (18c + 18) / 18 = c + 1] Пусть b = c + 1. Тогда b является целым числом, поскольку представляет собой сумму целых чисел. Подставляя b в определение B, получаем 18b — 2 = 18 (c + 1) — 2 = 18c + 18-2 = 18c + 16 = x. Следовательно, по определению B, x является элементом B.
Эффективное генерирование респираторно-синцитиального вируса (RSV), нейтрализующего MoAb человека, с помощью мышей SCID периферической крови (hu-PBL) -SCID и библиотек фаговых дисплеев scFv
Резюме
RSV является одной из основных причин пневмонии и бронхиолита у младенцев и маленьких детей и ассоциируется с высокой смертностью. Человеческое антитело, нейтрализующее RSV (hu-Ab), как известно, опосредует устойчивость к вирусной инфекции, а также является эффективным средством лечения тяжелой инфекции RSV нижних дыхательных путей. Ранее мы продемонстрировали, что первичный и вторичный иммунные ответы человека могут быть установлены у мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом, которым прививаются лимфоциты периферической крови человека (hu-PBL-SCID). Комбинируя эту животную модель с методом библиотеки фагового дисплея одноцепочечных антител к Fv (scFv), мы смогли дополнительно исследовать его клинический потенциал, создав панель человеческих scFv, которые проявляют как высокое сродство связывания гликопротеина F (RSV-F) ( ∼10 8 M -1 ) и сильную нейтрализующую активность против RSV-инфекции in vitro .Анализ секвенирования случайно выделенных клонов scFv против RSV-F показал, что они произошли от различных семейств V H с мутациями в области 1, определяющей комплементарность (CDR1). Результаты предполагают, что: (i) RSV-F-специфические иммунные ответы человека и созревание аффинности могут быть индуцированы у мышей hu-PBL-SCID; и (ii) этот подход можно применять для создания большого количества scFv человека с терапевтическим потенциалом. Несмотря на то, что библиотека hu-PBL-SCID фагового дисплея scFv человека и мыши была создана индивидуально, наш подход вносит простой и значительный шаг на пути к обобщению производства антиген-специфических человеческих моноклональных антител (hu-MoAb) и их клиническому применению.
Ключевые слова: адъювантная иммунизация, биопэннинг, анализ BIAcore, гипермутация, пассивная иммунотерапия
ВВЕДЕНИЕ
RSV является основной причиной инфекции нижних дыхательных путей, приводящей к бронхиолиту и пневмонии у младенцев и детей младшего возраста [1,2]. Уровень инфицирования достигает 69% в течение первого года жизни, и почти все дети были инфицированы хотя бы один раз к 2 годам [3]. Дети с врожденными пороками сердца, хроническими заболеваниями легких или недоношенные дети подвергаются высокому риску тяжелого заболевания нижних дыхательных путей, вызванного RSV. Респираторный эпителий является первичным очагом инфекции, репликации и распространения вируса [4]. Бронхиолит является результатом как прямого вирус-индуцированного цитопатического повреждения, так и деструктивных воспалительных иммунных реакций. Несмотря на то, что некоторые белки, кодируемые RSV, могут вызывать защитные иммунные ответы, исследования гуморального и клеточно-опосредованного иммунитета показали, что высококонсервативный RSV-F является наиболее важной мишенью для иммунотерапии [5–7]. Вакцинация против RSV оказалась неудачной из-за незрелой иммунной системы маленьких детей [8,9].Вместо этого внутривенная инъекция иммуноглобулинов и паливизумаба, «гуманизированного» анти-RSV-F MoAb, в настоящее время используется для лечения младенцев из группы высокого риска с инфекцией RSV [10]. Следовательно, создание RSV-специфичных нейтрализующих hu-MoAb будет иметь клиническое значение.
Технология фагового дисплея, разработанная десять лет назад, успешно использовалась для скрининга человеческих scFv-библиотек. Из-за биологической опасности и этических ограничений библиотеки scFv обычно конструировали из образцов hu-PBL и / или лимфоидных тканей человека без предварительного усиления антительных ответов соответствующими антигенами.Было показано, что создание высокоспецифичных hu-MoAb со способностью нейтрализации является трудоемким и непредсказуемым. Ранее мы продемонстрировали эффективный метод для достижения высокого уровня приживления (до 80%) hu-PBL мышам SCID [11,12]. Кроме того, первичные и вторичные иммунные ответы человека против различных антигенов, обнаруженные у этих мышей hu-PBL-SCID после иммунизации смесями антиген-адъювант, предполагают, что созревание hu-Ab может происходить in vivo . Мы сообщаем здесь о совместных усилиях по применению мышей hu-PBL-SCID и библиотеки фагового дисплея scFv для усиления иммунных ответов человека против RSV и клонирования панели scFv, нейтрализующих RSV, соответственно.Было показано, что полученные scFv происходят от различных семейств V H человека с мутантными нуклеотидными последовательностями CDR1, и некоторые из них проявляют высокую аффинность связывания RSV-F, связанную с нейтрализующей активностью RSV in vitro . Эти данные предполагают, что созданные scFv обладают клиническим потенциалом для лечения тяжелой инфекции RSV и что наш комбинированный подход может быть широко применим для клонирования высокоантиген-специфичных и нейтрализующих hu-MoAb.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Мыши и материалы
Гомозигота C.Мышей B.-17 scid / scid (SCID) выращивали и содержали в Исследовательском институте Самуэля Луненфельда в Торонто. Фетальная телячья сыворотка (FCS), полные и неполные адъюванты Фрейнда (FCA, FIA) и обратная транскриптаза (RT) были получены от Gibco-BRL (Gaithersburg, MD). Все олигонуклеотидные праймеры были получены от Dalton Chemical Lab. Inc. (Торонто, Онтарио, Канада). Ficoll-Hypaque, Superdex R 75 HR10 / 30 и система рекомбинантных фаговых антител (RPAS) были получены от Pharmacia (Пискатауэй, Нью-Джерси).Антитело против asialo GM1 было получено от Wako Chemicals (Даллас, Техас). Мышиные MoAb против CD3-PE, CD20-FITC и CD45-PE человека были приобретены у Serotec Ltd. (Кидлингтон, Великобритания). Рестрикционные ферменты были получены от New England Biolabs (Беверли, Массачусетс). Козьи антитела против человеческого IgM и IgG, конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP), были получены от Jackson Immunoresearch Labs Inc. (Westgrove, PA). Гемоцианин лимфы улитки (KLH), цельномолекулярные человеческие IgG и IgM были получены от Pierce (Rockford, IL).Мышиные антитела против человеческого IgM и IgG были получены от PharMingen (Сан-Диего, Калифорния). Изопропилтио-β-d-галактозид (IPTG) и дигидрохлорид диметилпимелимидата (DMP) и другие химические вещества были приобретены у Sigma Chemical Co. (Сент-Луис, Миссури). Мышиные анти-RSV-F MoAbs 18B2 и 23A3 были получены от Argene Inc. (North Massapequa, NY). Клетки VERO (АТСС CCL-81) и длинный штамм А2 RSV (АТСС VR-26) были получены из Американской коллекции типовых культур (Роквилл, Мэриленд). Целые белки RSV и очищенный RSV-F были любезно предоставлены Pasteur Merieux Connaught Canada (Торонто, Онтарио, Канада). В этом исследовании использовалась система Millipore HPLC. Система состоит из системного контроллера Waters 600E, системы очистки белка Waters 650E Advance, настраиваемого детектора абсорбции Waters 486, модуля данных Waters 746 и коллектора фракций Waters. Экспериментальные животные и протоколы были одобрены подкомитетами Университета Торонто и больницы Mount Sinai, Торонто.
RSV-иммунизированные мыши hu-PBL-SCID
Свежие hu-PBL выделяли от пяти согласившихся доноров и подвергали воздействию градиента фиколла-гипака.Изолированные hu-PBL от каждого донора прививали шести предварительно обработанным мышам SCID ( n = 30) на 2 день. Каждую мышь иммунизировали внутрибрюшинно 100 мкл смеси адъювантов FCA / FIA (об. / Об. = 1/10), содержащей 50 мкг. всего белка RSV на 3 день (RSV-hu-PBL-SCID) в соответствии с ранее описанной процедурой [11]. Мышиные сыворотки и селезенки собирали и объединяли в пять соответствующих групп на 16 день. МРНК получали индивидуально из PBL донора и из спленоцитов соответствующей группы мышей RSV-hu-PBL-SCID и использовали для создания библиотек scFv человека. .
Одноцепочечные библиотеки фаговых дисплеев антител
Систему рекомбинантных фаговых антител, полученную от Pharmacia Biotech, использовали для клонирования scFv. Вкратце, гены вариабельной области тяжелой и легкой цепи иммуноглобулина человека (V H и V L ) амплифицировали с помощью RT-полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием наборов праймеров, описанных Marks et al . [13]. V H и V L были случайно связаны вместе олигонуклеотидными линкерами: 5′-TC TCC / T TCA GGT GGC GGC GGT TCG GGC GGA GGA GGC TCT GGC GGT GGC GGA TCG GA-3 ‘, который кодировал гибкие и гидрофильные пептиды. (-Gly 4 Ser-) 3 .Затем полученные scFv клонировали в фаговый вектор pCANTAB 5 E, следуя инструкциям производителя.
Биопэннинг
Прямой пэннинг проводили, как описано ранее Marks et al . [13] с использованием очищенного белка RSV-F. Вкратце, лунки в 12-луночной полоске Immulon I (Dynatech, Chantilly, VA) покрывали в течение ночи при 4 ° C RSV-F (100 мкл 1 мкг / мл в 0,1 м натрий-бикарбонатном буфере, pH 9. 6) и заблокировали блотто (3% обезжиренное молоко в PBS). Библиотеку фагов (10 8 бляшкообразующих единиц (БОЕ) / лунку в 0,1 мл блотто) добавляли в лунку и оставляли слегка покачиваться в течение 2 часов.Затем лунки промывали 60 раз PBS-TT (PBS + 0,05% Tween 20 + 0,01% Triton X-100) и 5 раз буфером с бикарбонатом натрия, pH 9,6. Связанные фаги элюировали 100 мкл 0,1 м триэтиламина pH 11,5 и встряхивали в течение 5 мин перед нейтрализацией 10 мкл 3 м трис-HCl pH 7,5. Элюированные фаги использовали для заражения 2 мл растущего Escherichia coli TG1 (штамм Suppressor F + ) в течение 30 минут при 37 ° C и высевали на пять чашек с агаром LB плюс Amp размером 100 мм (150 мкг / мл ампициллина). . Были отобраны связывающие фаги и использованы для заражения E.coli HB2151 (штамм супрессора F —) для продуцирования растворимых белков scFv.
ELISA
96-луночные планшеты Immulon I покрывали 100 мкл 1 мкг / мл RSV-F в 100 мм бикарбонатном буфере, pH 9,6 на ночь при 4 ° C, затем блокировали 0,3 мл блотто. (PBS + 3% обезжиренного молока). Супернатант (0,1 мл), содержащий фаги (приблизительно 10 9 фагов) или растворимый scFv плюс 3% обезжиренного молока и 0,05% твин 20, добавляли в каждую лунку и инкубировали при комнатной температуре в течение 2 часов при встряхивании.В каждую лунку добавляли либо конъюгированные с HRP мышиные антитела против M13 (0,1 мл), либо конъюгированные с HRP антитела против E Tag и инкубировали в течение 1 часа при встряхивании. Связывание детектировали с использованием набора субстратов HRP (BioRad Labs, Ричмонд, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Лунки, непосредственно покрытые 10 9 фагами, использовали в качестве положительного контроля. Образцы фага 10 9 и растворимого белка scFv произвольно выбранных связывающих клонов RSV-F подвергали ELISA для отбора клонов с сильным связыванием.Клоны демонстрируют сигналы ELISA фагов, составляющие по меньшей мере 50% от сигналов положительного контроля, и сигналы ELISA для сильных растворимых scFv были условно названы сильными связующими веществами.
Аффинность связывания RSV-F, BIAcore
Образцы белка
scFv очищали из периплазматических экстрактов выбранных клонов с помощью аффинной хроматографии с использованием колонки с белком G-сефарозой 4B, конъюгированной с антителом против E taq. Очищенные образцы scFv затем подвергали эксклюзионной хроматографии на Superdex 75 HR10 / 30 для выделения мономеров scFv.Все буферы и образцы перед использованием были отфильтрованы через фильтры 0,22 мкм. Аффинность связывания растворимого scFv с RSF-F измеряли с использованием BIAcore, биосенсорной системы (Pharmacia) в соответствии с руководством производителя. Вкратце, в процессе иммобилизации использовали раствор 250 мкг RSV-F в 1 мл 10 мМ ацетатного буфера с pH 4 · 0. Раствор RSV-F вводили в каждую сенсорную ячейку с постоянной скоростью потока 2 мкл / мин в течение 10 мин. Это состояние привело к 4000–5000 единиц ответа (RU) иммобилизованного RSV-F.Растворы scFv (в PBS) вводили на чип в условиях непрерывного потока 20 мкл / мин в течение 1 мин. Скорости ассоциации (k a ) и диссоциации (k d ) scFv на чипе были обнаружены и сформулированы с помощью программного обеспечения BIA Evaluation версии 2.1, представленного в модели системы биосенсора BIAcore Upgrade (Pharmacia Biosensor AB). Собранные данные были подогнаны к однородному одноцентровому взаимодействию между двумя молекулами (гомогенная кинетика). Название модели диссоциации AB = A + B было использовано для расчета константы скорости диссоциации kd путем подгонки данных к уравнению: R = R 0 e −k d ( t — t 0 ) ( t , время в секундах; k d , константа скорости диссоциации; R 0 , реакция в начале диссоциации; t 0 , время начала диссоциации).Название модели ассоциации A + B = AB тип 1 использовалось для расчета константы скорости ассоциации k a и уровня реакции в установившемся режиме R eq путем подгонки данных к уравнению: R = R eq [1-e — (k a Cn + k d ) ( t — t 0 ) ] ( t , время в секундах; k a , константа скорости ассоциации ; R eq , устойчивый уровень ответа; C, молярная концентрация аналита; n , фактор стерической интерференции; t 0 , время начала ассоциации; k d , константа скорости диссоциации).
Анализ нейтрализации RSV — анализ уменьшения бляшек
Способность контрольных MoAb и изолированных scFv ингибировать инфекцию RSV исследовали с помощью модифицированного анализа микронейтрализации, разработанного Prince et al . [14]. Вкратце, 1 × 10 5 клеток Vero в 1 мл полной среды 199 (среда 199 плюс 10% FCS без антител против RSV) добавляли в каждую лунку 24-луночного планшета (Falcon) и инкубировали в течение ночи. Для приготовления тестируемой смеси антител приблизительно 50 БОЕ длинного штамма А2 RSV смешивали с разведением либо тестируемого scFv, либо RSV, нейтрализующего MoAb мыши 18B2, либо не нейтрализующего RSV мышиного MoAb 23A3 в качестве контроля в 0,2 мл тестовой среды 199. (среда 199 + 2% FCS) и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C.Затем культуральную среду заменяли смесью антител и инкубировали в течение 1 ч при 37 ° C. Смесь антител заменяли 1 мл оверлейной среды (среда 199 + 2% FCS + 1% метилцеллюлоза), и тестовый планшет инкубировали в течение 6 дней. Верхнюю среду отбрасывали, клетки фиксировали 1 мл ледяного 80% метанола в течение 30 минут при 4 ° C и блокировали на 1 час с помощью блотто. Антитело 18B2 (0,2 мл 0,5 мкг / мл) в блотто добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 ч при встряхивании. HRP-конъюгированные антитела против IgG мыши (0,2 мл в разведении 1: 2000) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 часа.Субстрат HRP (0,2 мл; 0,6 мг / мл 3,3-диаминобензидинтетрагидрохлорида + 0,03% NiCl 2- + 1 мкл / мл 30% H 2 O 2 ). добавляли в каждую лунку и инкубировали 20 мин. Бляшки выглядели как темно-синие пятна.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Усиленные ответы hu-Ab на RSV-F у мышей hu-PBL-SCID
В соответствии с нашими ранее опубликованными данными [9,10], мыши RSV-hu-PBL-SCID имели аналогичные уровни сыворотки. человеческие иммуноглобулины к иммуноглобулинам доноров (данные не показаны).FACS-анализ спленоцитов подтвердил, что эти клетки экспрессировали маркеры лимфоцитов человека: 15–23% экспрессировали CD20 человека; 34–42% экспрессировали CD3 человека; и 66–84% экспрессировали человеческий CD45. Эти маркеры не экспрессировались на спленоцитах мышей SCID, иммунизированных RSV. Кроме того, сывороточные титры человеческого анти-RSV-F IgG у мышей RSV-hu-PBL-SCID в среднем были в 90–165 раз выше, чем у соответствующих донорских сывороток, в то время как титры IgM снизились с 12 до 30 раз. Duchosal и др. . сообщили о сходных ответах hu-Ab на столбнячный анатоксин у мышей hu-PBL-SCID [15].Поскольку все пять групп мышей RSV-hu-PBL-SCID демонстрировали стабильно высокие уровни приживления hu-PBL и антител к RSV-F, результаты, следовательно, были хорошо воспроизводимыми. Любая из этих пяти групп мышей может быть дополнительно охарактеризована как репрезентативная для результатов.
Только библиотека γκ, полученная от мыши, содержала клоны scFv против RSV-F
Спленоциты мышей группы 3 с наибольшим увеличением сывороточных титров человеческого анти-RSV-F IgG (в 165 раз) и PBL от соответствующего донора были использованы для конструирования отдельных библиотек scFv (γκ, γλ) из более чем 10 8 членов (2 · 7 · 10 8 -3 · 8 · 10 8 ) каждая и проверили на scFv, связывающиеся с RSV-F. Для гарантии того, что количество клонов, извлеченных из лунок с отрицательным контролем, будет меньше, чем 1: 1000 клонов в тестовых лунках, использовали жесткие условия промывки. Было обнаружено, что количество клонов, связывающих RSV-F, не различается между двумя библиотеками γκ, в то время как две библиотеки γλ не содержат никаких клонов, связывающих RSV-F после биопэннинга. Связывающие клоны отбирали случайным образом для проверки сильных связывающих факторов, которые демонстрировали как ELISA-сигналы фагов, составляющие по меньшей мере 50% от сигналов положительного контроля, так и сильные ELISA-сигналы растворимых scFv.Десять процентов случайно выбранных клонов (6/60) из библиотеки γκ, полученной от мыши, были положительными, в то время как ни одного не было обнаружено в другой библиотеке γκ (). Тот факт, что в этом анализе использовалось стандартизованное количество фагов (10 9 ) каждого клона, позволяет предположить, что сильные связывающие вещества могут экспрессировать scFv с более высокой аффинностью или алчностью связывания RSV-F, чем у других протестированных клонов. Кроме того, сигналы ELISA растворимого scFv, вероятно, указывают на то, что растворимые белки scFv эффективно продуцируются этими клонами.Эти результаты соответствовали вероятности контакта человека-донора с RSV. Они также предположили, что циркулирующих IgG против RSV-F с высокой аффинностью связывания было больше у мышей RSV-hu-PBL-SCID, чем у соответствующего донора-человека. Обладая этой информацией, мы выбрали сильные связующие вещества для дальнейшей характеристики.
Таблица 1
Скрининг клонов scFv, связывающихся с RSV-F, с помощью ELISA
γλ
γκ
№ библиотекисвязующих *
Крепкие связующие †
Кол-во связующих
Крепкие связующие
Донорский PBL
0
NA
1 · 0 × 10 3
0 / 60
RSV-hu-PBL-SCID мыши
0
NA
1 · 4 × 10 3
6/60
Разные клоны scFv проявляли аффинность связывания RSV-10
8 M -1 диапазон
Мы провели анализ секвенирования для определения клональности выбранных клонов scFv против RSV-F. Результаты показали, что последовательности ДНК V H шести клонов отличались друг от друга и что они происходили из различных семейств человеческих зародышевых линий V H (). Эти данные предполагают наличие относительно разнообразного репертуара антител против RSV-F в библиотеке γκ. Кроме того, были обнаружены мутации в CDR1. В отличие от CDR3, который представляет собой область VDJ, CDR1 подходит для определения того, была ли мутирована область V. Выделенные scFv проявляли аффинность связывания RSV-F в диапазоне высоких 10 7 -10 8 M -1 на основе анализа BIAcore ().Важно отметить, что scFv, полученный из любого данного антитела, обычно имеет аффинность связывания, по крайней мере, в 2–30 раз ниже, чем у исходного целого антитела [16]. Таким образом, ожидается, что если целые молекулы hu-IgG были сконструированы из этих изолированных scFv, они, вероятно, будут проявлять сродство связывания RSV-F в диапазоне 10 9 M -1 или даже выше.
Сравнение ДНК и аминокислотных последовательностей выделенных scFv с соответствующими зародышевыми линиями иммуноглобулинов человека.ДНК и аминокислотные последовательности шести клонов scFv, связывающих RSV-F, сравнивали с последовательностями соответствующих зародышевых линий V H , которые имеют идентичные каркасные области 1 и 2 [38]. Последовательности V H сравнивали с выбранной последовательностью основной зародышевой линии этого семейства. Последовательности scFv выровнены с соответствующей последовательностью зародышевой линии, и нуклеотиды, идентичные последовательности зародышевой линии, показаны точками. Мутировавшие нуклеотиды и соответствующая аминокислота выделены жирным шрифтом и подчеркнуты.Аминокислотные последовательности показаны однобуквенным аминокислотным кодом. Последовательности праймеров на 5′-конце FR1 подчеркнуты.
Таблица 2
R1C *
R2C
R3C
R4C
R5C
R6C
12 k
4 9008 1
) †
4 · 39 × 10 5
2 · 73 × 10 5
3 · 11 × 10 5
2 · 95 × 10 5
2 · 73 × 10 5
5 · 11 × 10 5
k d (с −1 ) ‡
4 · 75 × 10 −3
2 · 10 × 10 −3
2 · 40 × 10 −3
4 · 40 × 10 −3
3 · 87 × 10 −3
2 · 88 × 10 −3
K A = k a / k d (M −1 ) §
9 · 24 × 10 7
1 · 03 × 10 8
1 · 30 × 10 8
6 · 70 × 10 7
7 · 10 × 10 7
2 · 77 × 10 8
Нейтрализация RSV активность
in vitro
RSV нейтрализующий MoAb мыши (18B2) и ненейтрализующий MoAb мыши (23A3) использовали в качестве антитела положительного и отрицательного контроля в анализе нейтрализации RSV соответственно. Клон R5C показал очень высокую нейтрализующую активность RSV, при этом инфекционность RSV полностью блокировалась 30 нг / 0,2 мл (приблизительно 1 нмоль) белка R5C. Положительный контроль MoAb, 18B2, показал полное ингибирование RSV при концентрации 240 нг / 0,2 мл (приблизительно 1,6 нмоль) (). Эти данные показывают, что нейтрализующая способность клона R5C была по крайней мере сопоставима с таковой 18B2 на молярной основе, поскольку молекулярная масса scFv (приблизительно 30 кДа) примерно в пять раз меньше, чем у полного IgG (150 кДа). ).Клон R1C также проявил некоторую нейтрализующую активность в пределах тестируемого диапазона концентраций; однако он был примерно в 16 раз ниже, чем у клона R5C. По нашей оценке, эта библиотека содержит от 14 до 41 отдельных клонов scFv против RSV, обладающих как высокой аффинностью связывания RSV-F, так и сильной вируснейтрализующей активностью.
Таблица 3
Анализ нейтрализации — анализ уменьшения образования зубного налета
Конц. нг / 0 · 2 мл
18B2 * + ve контроль
23A3 † –ve контроль
+ R1C ‡
R2C —
R3C —
R4C —
R5C +
R6C —
0
57 §
55
50
54
48
45
52
55
5
69120
49
56
50
31
54
10
62
54
56
53
58
56
27
20120
56
2720120120120
49
45
61
51
48
37
17
62
30
42
51
38
51
120
64
0
41
60
25
57
49
53
39
52
5
120120
4347 9201
19
61
47
42
1
55
240
1
54
5
49
52
47 9011
471
1 480
2
47
2
56
48
54
3
52
ОБСУЖДЕНИЕ
В этом исследовании мы объединили нашу ранее опубликованную модель мыши hu-PBL Используя метод библиотеки фагового дисплея scFv, мы продемонстрировали, что hu-MoAb с терапевтическим потенциалом, нейтрализующие RSV, можно клонировать с разумной легкостью и высокой эффективностью. Использование мышей RSV-hu-PBL-SCID для усиления ответа hu-Ab in vivo позволило нам получить большой репертуар различных RSV-F-специфичных B-клеток, экспрессирующих мутированные последовательности V H , которые, в свою очередь, упростили клонирование scFv, нейтрализующих RSV. Нам удалось обойти трудоемкий путь гибридомы [], а также избежать перекоса ответов hu-Ab в сторону доминантных, ненейтрализующих эпитопов, как было отмечено при клонировании вирус-нейтрализующих hu-MoAb непосредственно от человеческих доноров. [18–20].Работа, о которой мы здесь сообщаем, обладает некоторыми благоприятными характеристиками, непосредственно применимыми к клонированию специфических и нейтрализующих hu-MoAbs. Нам постоянно удавалось усиливать специфические ответы hu-Ab и индуцировать созревание аффинности антител у мышей hu-PBL-SCID в течение первых 16 дней после приживления hu-PBL, тем самым избегая прогрессирования ответов hu-Ab на антигены мыши [ 21,22]. Использование мышей RSV-hu-PBL-SCID для усиления ответа человеческого антитела против RSV было настолько эффективным, что для выделения клонов scFv, нейтрализующих RSV, потребовался только один цикл очень строгого биопэннинга.
Недавно было разработано несколько протоколов для усиления иммунных ответов человека у мышей hu-PBL-SCID для клонирования полных молекул иммуноглобулина человека [23–27]. Однако в целом продукция hu-MoAb, нейтрализующая вирус, не использовалась. В этом исследовании библиотеки scFv, полученные непосредственно от доноров, не дали никаких клонов с высокими сигналами связывания, несмотря на то, что титры сывороточного анти-RSV IgG были обнаружены клинически. Стоит отметить, что донорская сыворотка демонстрирует неопределяемый уровень RSV-нейтрализующей активности in vitro (данные не показаны).Из четырех сконструированных библиотек только библиотека γκ, полученная от мыши, содержит клоны с сильным связыванием RSV-F, которые проявляют сильную RSV-нейтрализующую активность in vitro (, и). Кроме того, результаты анализа секвенирования ДНК показали, что эти клоны произошли от различных семейств V H (). Вместе с этими результатами мутации, обнаруженные в CDR1, решительно подтверждают идею о том, что как RSV-F-специфический ответ антител человека, так и нормальное созревание аффинности могли иметь место in vivo , что согласуется с выводами, сделанными Brams et al . и Smithson и др. . [23,24]. Одно из возможных объяснений расхождения между нашим исследованием и исследованиями Tsui et al . и Сакураи и др. . заключается в том, что у мышей hu-PBL-SCID могут отсутствовать некоторые регуляторные механизмы, которые направляют ответ антител на иммунодоминантный эпитоп RSV-F во время естественной инфекции RSV у людей [18,19]. В результате привитые hu-PBL могут без разбора распознавать ряд эпитопов RSV-F и отвечать на них с последующим созреванием аффинности антитела.Кроме того, было показано, что различные протоколы иммунизации сильно влияют на результат ответа антител, и наше использование адъюванта Фрейнда при иммунизации вполне может быть причиной несоответствия. Для решения этого вопроса необходимы дополнительные исследования. Недавно, используя аналогичный протокол, мы смогли клонировать scFv против собственного Ag, фактора некроза опухоли-альфа человека (TNF-α), с аффинностью связывания в диапазоне 10 8 M -1 ( неопубликованные данные). Эти клоны характеризуются своей нейтрализующей активностью как in vitro , так и in vivo .
Поскольку RSV-F отвечает за слияние RSV с респираторными эпителиальными клетками [28], вполне вероятно, что R5C-scFv может действовать, нарушая проникновение RSV в клетку-хозяин и / или его последующее снятие оболочки. scFv является одновалентным, поэтому перекрестное связывание RSV-F, агрегация вирусных частиц или эффекторных областей Fc не может объяснить RSV-нейтрализующую активность R5C-scFv.Ранее сообщалось, что F (ab ‘) 2 , полученный из человеческих RSV-нейтрализующих антител, был так же эффективен, как и весь IgG на молярной основе, когда они были доставлены в легкие RSV-инфицированных хлопковых крыс. Титры RSV в легких не восстанавливались [14]. О тех же результатах сообщалось, когда аэрозольный моноклональный Fab был доставлен в легкие мышей, инфицированных RSV. Моноклональные антитела были в 25-200 раз эффективнее объединенных поликлональных антител [29,30]. Следовательно, область Fc, по-видимому, не является обязательной для местной пассивной иммунотерапии легочной RSV-инфекции.
Аэрозольный иммуноглобулин использовался в клинических испытаниях для лечения RSV-инфекции у младенцев [31]. Однако суд по разным причинам в основном не увенчался успехом. В этом клиническом испытании использовалась цельная фракция IgG объединенной сыворотки человека с относительно низким RSV-нейтрализующим титром 1: 789. Этот нейтрализующий титр мог быть слишком низким, поскольку было показано, что эффективность аэрозольного IgG зависит от дозы [32]. Препарат IgG специфичен к подтипу A, тогда как подтипы A и B были обнаружены у некоторых пациентов позже.Однако исследование показало, что однократная доза в 100 мг аэрозольного IgG на кг массы тела может быть доставлена в течение 60 минут, и эта доза хорошо переносится младенцами, включенными в исследование. Будучи небольшими, высокоспецифичными и моноклональными, scFv, нейтрализующие RSV, могут иметь больший потенциал в качестве аэрозоля при тяжелых инфекциях RSV нижних дыхательных путей. Кроме того, ряд отдельных клонов scFv, нейтрализующих RSV, которые несут различные вариабельные области человеческого иммуноглобулина, распознающие разные антигенные эпитопы RSV-F, можно относительно легко клонировать из нашей библиотеки scFv.Эти scFv можно использовать либо в комбинации, либо в альтернативном режиме для противодействия как ответам антиидиотипических антител, так и появлению мутантов, ускользающих от антигенного RSV.
MoAb человека были также клонированы из мышей с транслоцитами человеческого иммуноглобулина [33]. Преимущество этого трансгенного подхода состоит в том, что, если доступна подходящая линия трансгенных мышей, специфические hu-MoAb могут быть клонированы с использованием гибридомных методов. Однако методы, используемые для развития этих мышей, все еще сложны, и их доступность ограничена.Химерные мышиные / человеческие и гуманизированные MoAb также были сконструированы и использовались в клинических испытаниях [10,34–37], но их количество остается ограниченным. Фактически, паливизумаб — единственный гуманизированный MoAb, доступный для лечения тяжелой инфекции RSV [2]. Хотя не сообщалось о побочных эффектах, специфически связанных с паливизумабом, возможные антиидиотипические реакции антител и появление антигенных мутантов RSV могут вызвать вопросы о его долгосрочной терапевтической эффективности.
В заключение, наши результаты показывают, что RSV-иммунизированные мыши hu-PBL-SCID и библиотеки фагового дисплея могут эффективно использоваться для создания человеческих scFv с терапевтическим потенциалом, минуя этические и опасные проблемы иммунизации людей различными вредными антигенами и адъювантами.Наш комбинированный подход может не ограничиваться чужеродными антигенами, поскольку мы, применяя тот же протокол, смогли клонировать scFv против человеческого TNF-α с высокой аффинностью связывания. В настоящее время проводятся дальнейшие исследования для проверки терапевтического потенциала scFv против RSV-F и против человеческого TNF-α in vivo . Сделан вывод о том, что текущий подход представляет собой простую и высокоэффективную модель для создания человеческих MoAb с потенциальным клиническим применением.
Продолжается серия для любительской бейсбольной команды Aberdeen Circus.
Цирк отправился в Гротон в среду вечером, поставив на кон свою серию из пяти побед. Благодаря паре крупных иннингов и уверенной подаче на старте гости сравняли счет с Гротоном со счетом 10: 1, улучшившись до 6: 0 в начале года.
Цирк выиграл второй тайм, затем добавил еще три в начале третьего. Джесси Спэнглер добился результата, когда он выровнял тройку к стене в правом центре от стартового игрока «Гротона» Адама Хермана, который забил Чаду Эллингсону с преимуществом 2: 0.Спенсер Садбек затем выровнял единственную точку в центре поля, чтобы забить Спенглеру, сделав его преимуществом 3: 0. Садбек забил два отбивающих позже, после одиночного удара Келли Коутс слева от центра в третьем забеге и лидерства 4: 1 после четырех подач.
Игрок / тренер Райан Эллингсон считает ранний результат одним из основных факторов раннего успеха команды.
«Без сомнения, это была еще одна спокойная ночь (у тарелки) для нас», — сказал Райан Эллингсон. «Всегда важно выставлять на дорогу (несколько больших) номеров.Мы только что смогли получить удары сцепления на ранней стадии (в этом сезоне) ».
Джои Уоллман начал выступление в цирке, и, хотя он не имел полного контроля над ударной зоной, он делал передачи, когда это было необходимо. В общей сложности он подбросил пять подач, позволив один пробег при одном ударе. Он прошел четыре и вычеркнул четыре отбивающих на пути к своей первой победе в году.
«Я был очень доволен (Уоллманом)», — сказал Райан Эллингсон. «До сих пор в этом сезоне он выглядел« странным ». Мы получили отличную подачу от наших (других игроков в стартовом составе), и он играл для нас скорее вспомогательную роль. Было действительно приятно видеть, что он подает немного дольше, чем всего два иннинга. У него действительно есть талант, чтобы быть большим подспорьем для нашего (качающего) персонала ».
Заезд поддержки Цирка продолжится в верхней пятой. Коутс начал счет со своего второго подряд одиночного удара слева по центру, который забил Райана Эллингсона и вывел его вперед 5: 1. Чад Эллингсон добавил еще двух, сделав удар к секунде, который Тайлер Оливер не смог придумать, позволив двум бегунам забить и выйти в «Цирке» 7: 1.До сих пор Коутс был важным звеном в нападении Цирка.
«Клюшка (Келли) была отличным началом года», — сказал Райан Эллингсон. «Он хорошо работает со счетом и имеет действительно хороший подход с двумя ударами. К тому же он отличный ловец, который действительно укрепляет нашу защиту. В целом, он сейчас действительно крут, и я надеюсь, что он продолжит это ».
Лукас Хайзер, Спэнглер и Райан Эллингсон придут и закроют его для Цирка. Команда Райана Эллингсона возвращается в строй в субботу, когда принимает у себя Цирковой любительский турнир по бейсболу. Цирк сразится с Редфилдом в 11 часов утра, а затем вернется к алмазу в 17 часов. когда они сталкиваются с Джеймстауном (Северная Дакота).
«Редфилд — хорошая команда, которую мы увидим несколько раз (в этом году)», — сказал Райан Эллингсон. «Джеймстаун также станет для нас проблемой в эти выходные. Мы просто хотим продолжать привлекать парней и выяснять, кто и где им подходит. Мы надеемся и дальше получать хорошие результаты от нашего состава и уверенную подачу. Пока что это сработало, так что, надеюсь, оно будет работать и дальше (в этом сезоне.) ”
Следуйте в Twitter @JRobb_AAN.
Circus 013 041 100-10 11 1
Groton 001 000 000 — 1 2 2
Motorola V980 Руководство пользователя к D01dce06 18b2 4b90 b256 30e82283aa3d
Руководство пользователя: Motorola V980 к руководству
Непосредственное открытие PDF: Просмотр PDF. Количество страниц: 27
Тип файла: PDF
Расширение типа файла: pdf
Тип MIME: приложение / pdf
Версия PDF: 1.2
Линеаризованный: Да
Количество страниц: 27
XMP Toolkit: набор инструментов XMP 2.9.1-13, framework 1.6
О себе: uuid: e887b928-2650-4e48-ae4b-0d0941f5ae4c
Производитель: Acrobat Distiller 6.0 (Windows)
Дата изменения: 2005: 06: 20 14: 59: 37 + 01: 00
Дата создания: 2005: 06: 20 14: 59: 37 + 01: 00
Идентификатор документа: uuid: 5a5b6b38-8afc-4403-9f37-3c4fb4097edf
Формат: заявка / pdf
Название: без названия
EXIF Метаданные предоставлены EXIF.инструменты
Задача 18B2 — для презентации в классе
Обвиняемый, Эрнандес, обвиняется в незаконном въезде в Соединенные Штаты. Обвинение требует доказательства того, что обвиняемый
ранее въезжал в Соединенные Штаты незаконно.
Федеральный иммиграционный офицер Уиллер опросил ответчика о его иммиграционном статусе, а затем использовал национальную компьютерную систему федерального правительства
, чтобы определить, есть ли у ответчика иммиграционное досье.Когда компьютер
показал существующий файл, Уиллер распечатал файл на своем офисном принтере. Из дела следует, что обвиняемый
ранее был арестован в Денвере за незаконный въезд в Соединенные Штаты и был депортирован по приказу судьи иммиграционной службы
. Уилер знаком с записями федерального правительства, которые делаются всякий раз, когда незаконный иностранец арестован и затем депортирован
. Тем не менее, он ничего не знает о более раннем аресте и депортации обвиняемого.
Агент ФБР Новотны направил запрос отпечатков пальцев обвиняемого в полицейское управление Денвера. В ответ на запрос
агенту была отправлена дактилоскопическая карта. Идентификационный номер на дактилоскопической карте — это тот же идентификационный номер
, который указан в записях ИНН ответчика. Однако Новотны ничего не знает об аресте обвиняемого
или снятии отпечатков пальцев полицией Денвера, а также не знает процедуры, которую полиция Денвера использует для создания и хранения записей отпечатков пальцев.
Перед началом судебного разбирательства ответчик пытается воспрепятствовать приему записей INS и карты отпечатков пальцев. Это слушание по делу
.
FRE 1005: Копии публичных записей для подтверждения содержания
Инициатор может использовать копию для доказательства содержания официальной записи — или документа, который был записан или подан в государственном учреждении
в соответствии с законом, если эти условия соблюдены:
Документ или запись допустимы ~ да, это так,
это актуально ~
любая тенденция сделать факт более или менее вероятным, чем это было бы без доказательств
факт имеет значение для иска
или надежен
Это публичный отчет, ваша честь, и обоснование признания публичных записей в качестве исключения из слухов
является презумпцией того, что государственный служащий будет выполнять свои обязанности должным образом
o Это верно — здесь нет соображения 403, при котором опасность существенно перевешивала бы доказательное значение
.
Это исключение, основанное на слухах: согласно 803 (8)
oПравило не требует, чтобы создатель записи или источник информации говорили на основании
личных знаний по данному вопросу.
Копия удостоверяется как правильная в соответствии с 902 (4)
o Товар становится самоподтверждаемым, если хранитель или другое уполномоченное лицо
ИЛИ свидетельствует свидетель, который сравнил его с оригиналом, как верный. .
В соответствии с FRE 902 и 1005 допускается заверенная копия записи.
Основа для общедоступной записи проста — она является самоподтверждаемой, что означает, что стороннику нужно только
представить ее в качестве доказательства.
-Это избавляет от необходимости вызывать подходящего свидетеля в суд.
— Общедоступная запись должным образом заверяется в соответствии с 902 (4), если копия записи удостоверяется как верная хранителем или
другим лицом, уполномоченным делать свидетельство.
o Офицеры уполномочены проводить сертификацию
ПРОТИВНИК: свидетельство, предоставленное администратором государственного бюро расследований, которое не было ни под печатью
в соответствии с FRE 902 (1), ни само по себе, является подлинным официальным лицом с печатью в соответствии с в соответствии с FRE 902 (2) было недостаточно
для подтверждения подлинности записей о судимости, отпечатков пальцев, которые были публичными записями, подпадающими под FRE
902 (4).
18B2 (2011) «Юниорская лига регби Aquinas Colts
До 18 лет B2 Раунд1
Кольтс 32 в Комо 12
Очки: Sammy D 2T, Dan 3T Ahmed 1T 4G:
Обсуждение перед игрой было уникальным, поскольку игроки и тренеры познакомились друг с другом из 17 перечисленных игроков, у нас было 14 2 и гребцов, 1 нападающий, 1 HB и 1 замок. Некоторые быстрые переговоры привели к тому, что собралась своего рода команда, и они ушли.
Игра была довольно близка в первые десять минут, а затем класс Кольтс засветился: Сэм и Дэниел получили хорошие попытки, а лучший в мире полузащитник Magic реализовал их обоих.Погода на Capitan Cook была очень теплой, и игроки, похоже, немного расслабились во время тайма и позволили Мо попробовать свои силы.
В первом тайме было много ярких моментов, но то, как эта команда объединилась для группы, которая никогда не тренировалась вместе, почти заставило супертренера Гаса замолчать. Защита выигрывает игры, и с учетом того, что Комо обыграл эту команду в финале по разнице очков в прошлом году, было действительно впечатляющим то, как они не давали им забивать в течение очень долгих периодов времени.
Вторая половина была проведена намного лучше, игроки в значительной степени придерживались плана игры, и последовали четыре удачные попытки команд.Мэджик Ахмед забил специальный тридцатиметровый гол, что для «бывшей проститутки» было неслыханно. Магия хороших усилий. Я не думала, что это в тебе есть, и это было очень впечатляюще.
Награды MOM на этой неделе были тяжелыми, так как большинство игроков старались изо всех сил, но одним игроком, который был классом выше других, был Дэнни Барбера
БАРБ (Дэнни) 3
Сэмми Д. (Сэм) 2
Бэтмен (Кайл) 1 и Мэджик (Ахмед) 1
В заключение поздравляю с отличной победой, но помните, что мяч отскочил от нас сегодня, и большинство вызовов судьи также были нашими, что не всегда будет иметь место.
Самый смущающий момент хммм Эй, Сэм, бомба в глуши — это особые усилия, но твоя последующая попытка со штрафным ударом прямо в палатку бомбардира была огромной работой. Пожалуйста, в следующий раз убедитесь, что он попал в Алан.
Извините, ребята, и у Алана, и у меня есть альзимхиера, хотя у Ала намного хуже, чем у меня, но пока мы не знаем всех овец. Пожалуйста, постарайтесь приступить к тренировкам, чтобы мы могли поработать над некоторыми вещами, в которых победители умеют ухмыляться, и вы все сыграли свою роль. Для тех парней, которые не успели разбежаться из-за задержек с переводом, мы будем преследовать их на этой неделе.