То 18б 3: Автомобильные объявления — Доска объявлений

Амкодор|Погрузчики фронтальные|Амкодор 333В (ТО-18Б3)

Предназначенный для выполнения любого вида землеройных работ (вырывное усилие около 10 500 кг!), погрузчик оснащён трансмиссией гидромеханической, рулевым управлением, представляющим собой шарнирно-сочленённую раму с гидравлическим приводом, а так же гидравлической обратной связью и аварийным насосом. Покупательскую привлекательность обеспечивает отличное соотношение стоимости спецтехники, её мощности (грузоподъёмность – 3.4 т) и высокой производительности, поэтому фронтальный погрузчик, купить который можно в «Амкодор-Челябинск», пользуется неизменным спросом у наших клиентов.

ТЕХНИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ:

Грузоподъемность, кг

3400

Номинальная вместимость ковша, м3

1,9

Вырывное усилие, кг

10500

Статическая опрокидывающая нагрузка
в сложенном положении (±40°), кг

7000

Ширина режущей кромки ковша, мм

2500

Высота разгрузки, мм

2800

Вылет кромки ковша, мм

900

Радиус поворота, мм

5600

Шины, дюйм

21,3 / 24

Длина, мм

7100

Ширина, мм

2500

Колея, мм

1930

Высота (по крыше кабины), мм

3400

Эксплуатационная масса, кг

10500

Трансмиссия

гидромеханическая

Скорость передвижения, вперед/назад, км/ч:

1 передача

0-6,5/0-6,6

2 передача

0-11,7/0-22,4

3 передача

0-21,8

4 передача

0-37,0

	Амкодор 333А	Амкодор 333В
Двигатель	Д-442МСИ	Д-260. 2
Эксплуатационная мощность, кВт (л.с.)	95 (130)	90,4 (123)

Заправочные емкости , л:

Топливный бак

215

Гидробак

110

Тормозная система:

Рабочая тормозная система — многодисковые тормозные механизмы в «масле»,с раздельным гидравлическим приводом по мостам

Cтояночная и аварийная тормозные системы — oднодисковый сухой тормозной механизм с механическим приводом

Рулевое управление — шарнирно-сочлененная рама с гидравлическим приводом, гидравли-
ческой обратной связью и аварийным насосом с приводом от ведущих колес

Гидравлическая система — двухнасосная с приоритетным клапаном для рулевого управления и гидрораспределителем с прямым гидравлическим управлением

Сменные рабочие органы (по дополнительному заказу):

Ковши (вместимость 1,5м³; 2,3м³; 3м³)

Крановая безблочная стрела

Захват челюстной

Бульдозерный отвал

Отвал поворотный для снега

Вилы грузовые

Стогометатель

Захват лаповый

Погрузочное оборудование с удлиненной стрелой
(вместимость ковшей: 1,5 м³; 1,9м³; 2,3м³; 3м³)

Погрузчики фронтальные

В МИД ответили на заявления Псаки о дезинформации по переговорам в Женеве

https://ria. ru/20220111/peregovory-1767272842.html

В МИД ответили на заявления Псаки о дезинформации по переговорам в Женеве

В МИД ответили на заявления Псаки о дезинформации по переговорам в Женеве — РИА Новости, 11.01.2022

В МИД ответили на заявления Псаки о дезинформации по переговорам в Женеве

Заявления Белого дома о дезинформации со стороны РФ по переговорам в Женеве вызывают только сочувствие, адекватную оценку дали эксперты, заявила официальный… РИА Новости, 11.01.2022

2022-01-11T09:24

2022-01-11T09:36

в мире

женева (город)

дженнифер псаки

россия

сша

вена

нато

совет россия-нато

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdnn21.img.ria.ru/images/07e5/02/1b/1599202062_0:0:3072:1728_1920x0_80_0_0_c2dbeb7c727d4d4d6ba10e78521f4594.jpg

МОСКВА, 11 янв — РИА Новости. Заявления Белого дома о дезинформации со стороны РФ по переговорам в Женеве вызывают только сочувствие, адекватную оценку дали эксперты, заявила официальный представитель МИД России Мария Захарова. Как заявила ранее представитель Белого дома Джен Псаки, США готовятся к тому, что Россия будет лгать об итогах переговоров о стратегической стабильности.»Мы слышали вчера заявления экспертов. В чем-то они были совпадающими с нами, в чем-то мы расходились в оценках. Я бы исходила из заявлений тех людей, которые были на переговорах. То, о чем мы вы говорите, вызывает только уже не недоумение, а глубокое сочувствие», — сказала Захарова в эфире «Соловьев Live».Россия и США 9-10 января в Женеве провели консультации по предложениям Москвы о гарантиях безопасности, после которого в Брюсселе состоится заседание Совета Россия-НАТО, а в Вене — консультации на площадке Организации по безопасности и сотрудничеству в Европе.В конце 2021 года Россия опубликовала проекты договора с США и соглашения с НАТО по гарантиям безопасности. Москва, в частности, требует от западных партнеров юридических гарантий отказа от дальнейшего расширения НАТО на восток, от присоединения к блоку Украины и от создания военных баз в постсоветских странах. Россия не раз отвергала обвинения Запада и Украины в эскалации, заявляя, что никому не угрожает и ни на кого не собирается нападать.

https://ria.ru/20220111/sovet-1767270491.html

женева (город)

россия

сша

вена

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2022

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdnn21.img.ria.ru/images/07e5/02/1b/1599202062_40:0:2771:2048_1920x0_80_0_0_58eea7ec5f98b38b39c6a4b82dfdf8c7.jpg

РИА Новости

internet-group@rian. ru

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

в мире, женева (город), дженнифер псаки, россия, сша, вена, нато, совет россия-нато, мария захарова

09:24 11.01.2022 (обновлено: 09:36 11.01.2022)

В МИД ответили на заявления Псаки о дезинформации по переговорам в Женеве

Эксперт Минздрава назвал решение проблемы штамма «Омикрон»: Общество: Россия: Lenta.ru

Основная угроза штамма COVID-19 «Омикрон» состоит в том, что он значительно быстрее распространяется, то есть он гораздо более заразен, чем штамм «Дельта» или уханьский вариант исходных штаммов. Если у предыдущих штаммов при контакте с выделителем из 10 человек при неблагоприятных условиях заражались 4-5 человек, то у «Омикрона» этот показатель достигает 8-9 человек, рассказал «Ленте. ру» заместитель директора по организационно-методической работе НМИЦ фтизиопульмолонологии инфекционных болезней Минздрава России, профессор Вадим Тестов. Таким образом, контакт с переносчиком практически на 90 процентов гарантирует заражение.

«Омикрон» — штамм COVID-19, который выявлен в ноябре 2021 года в ЮАР. По сравнению с предыдущими штаммами он характеризуется достаточно большим количеством мутаций — разные исследователи выделяют от 48 до 51 мутации, что означает существенное изменение его РНК и свойств.

«Из моментов, которые могут быть позитивными — течение «Омикрона» в клиническом плане менее тяжелое для здорового человека среднего возраста. В основном он проявляется симптомами ОРВИ: боль в горле, температура, насморк, значительно меньший процент повреждения легочной ткани (реже проявляется в виде пневмонии). Поэтому считается, что в целом по популяции он протекает несколько легче, чем заболевание, вызванное предыдущими штаммами», — рассказывает профессор.
Однако, учитывая высокую трансмиссивность и тот факт, что в Европе каждый день обновляются рекорды заболеваемости, средняя легкость течения болезни не означает, что тяжелых случаев не будет.

«Если при меньшем количестве тяжелых случаев общее число заболевших будет в разы выше, как мы предполагаем, то общее число тяжелых пациентов может быть достаточно значительным. Когда мы говорим, что «Омикрон» течет несколько по-другому и несколько легче, это не облегчает общую нагрузку на здравоохранение и никак не снижает угрозу для населения в целом», — подчеркивает Вадим Тестов.

Еще одна особенность этого штамма – способность вызывать повторные случаи заболевания. Люди, уже перенесшие COVID-19, при заражении «Омикроном» с большой степенью вероятности будут иметь новое заболевание — число случаев и повторного, и третичного заболевания уже достаточно велико по всему миру, отмечает эксперт. Решение проблемы – вакцинация.

«Ситуация по вакцинации следующая: вакцинированные люди, согласно данным южноафриканских коллег, болеют значительно меньше и легче. В ЮАР на стационарном лечении в госпиталях 98% составляют пациенты, не прошедшие вакцинацию. Вакцинированные лица могут заболеть, и в случае с «Омикроном» этот риск возрастает, но течет заболевание существенно легче, без поражения органов дыхания, что является самым негативным и критическим для пациентов с COVID-19. Группы риска остаются теми же самыми: это лица с хроническими заболеваниями и граждане старше 60 лет. Для этих групп прививка, по сути, единственный шанс пережить эту ситуацию», — говорит профессор.

Что касается распространения «Омикрона» в России, то в стране фактически в течение месяца есть завозные случаи заражения новым штаммом, и есть, пусть пока и немногочисленные, подтверждения случаев передачи «Омикрона» внутри государства.

«Пока штамм не является доминирующим или значимым, но, как показывает опыт других стран, вытеснение происходит очень быстро, буквально за неделю-две. Мы к этому готовимся, и прогноз на ближайшие 3-4 недели по числу заболевших я бы определил как неблагоприятный. Если сейчас мы имеем 15 000-16 000 заболевших, то после возвращения масс отдыхающих из Европы эти показатели могут начать расти в геометрической прогрессии», — предупреждает специалист.

2-5b+2 Tiger Algebra Solver

Шаг 1 :

Уравнение в конце шага 1 :

 (((18 • (b ³ )) - 3 ² b ² ) + 2
   Шаг 2 :

Уравнение в конце шага 2 :

 (((2•3 ² b ³ ) - 3 ² b ^{2 ) -2} )

Шаг 3:

Проверка для идеального куба:

3. 1 18B ³ -9B ² -9B + 2 — не идеальный куб

, пытаясь фактором, вытягивая:

3.2 Разложение на множители: 18b ³ -9b ² -5b+2

Вдумчиво разделите имеющееся выражение на группы, каждая из которых содержит два члена :

Группа 1: -5b+2
Группа 2: 18b 0 8 9000 -9b ²

Вытягивание из каждой группы отдельно:

Группа 1: (-5b+2) • (1) = (5b-2) • (-1)
Группа 2: (2b-1) • (9b ² )

Плохие новости !! Разложение на множители путем вытягивания не удается:

Группы не имеют общего множителя и не могут быть сложены для образования умножения.

Калькулятор корней полиномов :

3.3 Найдите корни (нули) : F(b) = 18b ³ -9b ² -5b+2
Калькулятор корней полиномов – это набор методов, предназначенных для который F(b)=0

Rational Roots Test является одним из вышеупомянутых инструментов. Он найдет только рациональные корни, то есть числа b, которые могут быть выражены как частное двух целых чисел

Теорема о рациональных корнях утверждает, что если многочлен равен нулю для рационального числа P/Q , то P является множителем замыкающей константы, а Q является множителем ведущего коэффициента

В этом случае начальный коэффициент равен 18, а конечная константа равна 2.

Коэффициент(ы):

ведущего коэффициента: 1,2 ,3 ,6 ,9 ,18
следующей константы: 1 ,2

Проверим ….

F (P / Q)2 9^{4 -1}^{4 -1} 9 9 9 9^{4 1} 9^{4 9} 92 9 9 9 9^{4 2}

P		Q		P / Q					Divisor
-1		1		-1.00		-20.00

-1		2	-0114			0. 00		2B + 1
	3	3		-0.33		2,00
-1		6		-0.17

			-0.11
-1		18	18		-0.06			225

-2		1		-2.00		-168.00

					-0.67			-4-400	⁵
-2										9	-0. 22	-0.22	2.47

1		1		1.00		60115
	9			0.50
	3		0.33		0.00		3B-1

1		6		0.17				1,00
				1.36	⁵
1		18		0,06		1.70

2		1		2. 00		1000015		⁵
	0.67		0.00		3B-2
	9 9		0.22	0.22			0.64

Теорема фактора заявляет, что если P / Q является корнем полинома, то этот полиномиал может быть разделен на Q * XP, что q и p. P/Q, приведенное к наименьшему значению

В нашем случае это означает, что
18b ³ -9b ² -5b+2
можно разделить на 3 различных многочлена, в том числе на 3b-2

Полином длинного деления:

3.4 Polynomial Dong Division
Разделение: 18b ³ -9b ² -9b + 2
(«Дивиденды»)
BY: 3B-2 («Divisor»)

⁴ —

Дивиденс		18B ³	—	—	9B ²	—	5b	+	2
— Divisor	* 6b ²	18B ³	—	12b ²

		3B ²¹	—	5B	+	2
— Divisor	* б ¹			3b ²	—	2b
Остальные		—	3	+	9
— Divisor	* -B ⁰			—	3B	+	2

						0
0

Кивок: 6б ² + B -1 Остаток: 0

Попытка разложить средний член

3. 5 Разложение на множители 6b ² +b-1

Первый член: 6b ² , его коэффициент равен 6 .
Средний член равен +b , его коэффициент равен 1 .
Последний член, «константа», равен -1

Шаг-1: Умножьте коэффициент первого члена на константу 6 • -1 = -6

Шаг-2: Найдите два множителя -6, сумма равен коэффициенту среднего члена, который равен 1 .

	-6	+	1	=	-5 ⁵

	-3	+	2	=	-1



	-2	-2	+	+	3	=	1	Это
, это

Шаг-3: Перепишите полиномиальные расщепления Средний термин с использованием двух факторов, найденных на шаге 2 выше, -2 и 3
6b ² — 2b + 3b — 1

— 1

Шаг-4: Сокращение первых 2 терминов, вытягивая как факторы:
2b • (3B-1)
Создание последних 2 терминов, вытягивая общие факторы :
1 • (3b-1)
Шаг-5 : Сложите четыре члена шага 4 :

Окончательный результат:

 (3b - 1) • (2b + 1) • (3b - 2)

Solve 3b2-18b=-14 Tiger Algebra Solver

Переформатирование входных данных:

Изменения, внесенные во входные данные, не должны влиять на решение:

(1): «b2» заменено на «b^2». 2-18*b-(-14)=0

Пошаговое решение :

Шаг 1 :

Уравнение в конце шага 1 :

 (3b ² - 18b) - -14 = 0

Шаг 2 :

Попытка разложения на множители путем разделения среднего члена

Средний член равен -18b, его коэффициент равен -18.
Последний член, «константа», равен +14

Шаг 1. Умножьте коэффициент первого члена на константу среднего члена, что составляет -18 .

^{4 -3}^{4 -2}^{4 1 +}^{4 2}2^{4 6}⁵^{4 7} 9^{4 14}^{4 21}

-42	+	-1	=		=

-21	+	-2	=	-23
	-14 +		-3 =		-17
	-7 +		-6 =		-13
-6	+	— 7	=	-13

+	=	-17
+	-21	=	-23
-1	+	-42	-422	=	-43

42	=	43 ⁵
+	21	=	23

3	+	14	=	9 ^{5 9013 9}
+	7	=	13
+	6	=	13

+	3	=	9
+	2	=	23
42	+	1	=	43

9003!!
Вывод: Трехчлен нельзя разложить на множители

Уравнение в конце шага 2 :

 3b ² - 18b + 14 = 0

Шаг 3 :

Парабола, нахождение вершины :

3. 1 Найдите вершину y = 3b ² -18b+14

Параболы имеют наивысшую или низшую точку, называемую вершиной. Наша парабола раскрывается и, соответственно, имеет низшую точку (абсолютный минимум). Мы знаем это еще до того, как начертили «у», потому что коэффициент первого члена, 3 , положителен (больше нуля).

Каждая парабола имеет вертикальную линию симметрии, проходящую через ее вершину. Из-за этой симметрии линия симметрии, например, будет проходить через середину двух точек пересечения x (корней или решений) параболы.То есть, если парабола действительно имеет два действительных решения.

Параболы могут моделировать многие реальные жизненные ситуации, такие как высота над землей объекта, брошенного вверх через некоторый период времени. Вершина параболы может предоставить нам такую информацию, как максимальная высота, на которую может подняться объект, брошенный вверх. По этой причине мы хотим иметь возможность найти координаты вершины.

Для любой параболы, Ab ² +Bb+C, b -координата вершины определяется как -B/(2A) . В нашем случае корпорация B составляет 3.0000

, подключение к Parabola Formula 3.0000 для B, мы можем рассчитать Y -Coordinate:
y = 3.0 * 3,00 * 3,00 — 18,0 * 3,00 + 14,0
или Y = -13.000

Парабола, Графическая вершина и точки пересечения X:

Корневой график для: y = 3b ² -18b+14
Ось симметрии (пунктирная) {b}={ 3,00}
Вершина в {b,y} = { 3,00,- 13.00}
b -Перехваты (корни):
Корень 1 в точке {b,y} = {0,92, 0,00}
Корень 2 в точке {b,y} = {5.08, 0.00}

Решить квадратное уравнение, заполнив квадрат

3.2 Решение 3b ² -18b+14 = 0, заполнив квадрат .

Разделите обе части уравнения на 3 , чтобы получить 1 в качестве коэффициента перед первым членом: ² -6b = -14/3

А теперь немного хитрости: возьмем коэффициент при b, равный 6, разделим на два, получим 3, и, наконец, возведем его в квадрат, получим 9

Прибавим 9 к обеим частям уравнения :
  В правой части имеем :
   -14/3  +  9    или, (-14/3)+(9/1)
  Общий знаменатель двух дробей равен 3   Складываем (-14/3)+( 27/3) дает 13/3
  Таким образом, прибавив к обеим сторонам, мы окончательно получим :
   b ² -6b+9 = 13/3

Добавление 9 дополнит левую часть до полного квадрата:
   b ² -6b+9  =
   (b-3) • (b-3)  =
  (b-3) ²
Вещи, равные одной и той же вещи, равны и друг другу. Поскольку
   b ² -6b+9 = 13/3 и
   b ² -6b+9 = (b-3) ²
, то по закону транзитивности
   (b-3) ² = 13/3

Мы будем называть это уравнение уравнением #3.2.1

Принцип квадратного корня гласит, что когда две вещи равны, их квадратные корни равны.

Обратите внимание, что квадратный корень из
   (b-3) ² равен
   (b-3) ^2/2 =
  (b-3) ¹ =
   b Принцип квадратного корня в уравнении#3.2.1 получаем:
   b-3 = √ 13/3

Добавьте 3 к обеим частям, чтобы получить:
b = 3 + √ 13/3

Так как квадратный корень имеет два значения, одно положительное, а другое отрицательное число
   b ² — 6b + (14/3) = 0
   имеет два решения:
  b = 3 + √ 13/3
   или
  b = 3 — √ 13/3

3 √3 can 1 √32 записывается как
√ 13 / √ 3

Решение квадратного уравнения с помощью квадратной формулы

3. 3 Решение 3b ² -18b+14 = 0 по квадратной формуле .

Согласно квадратичной формуле, B, решение для AB ² + BB + C = 0, где A, B и C являются числами, часто называемыми коэффициентами, задаются:

— B ± √ b ² -4CAC
B = ———
2A

В нашем случае A = 3
B = -18
C = 14

Соответственно, B ² — 4AC =
324 — 168 =
156

156

Применение квадратичной формулы:

18 ± √ 156
B = ——
6

Может √ 156 быть упрощенным?

Да! Разложение числа 156 на простые множители равно
2•2•3•13
Чтобы иметь возможность удалить что-то из-под корня, должно быть 2 этих экземпляра (поскольку мы берем квадрат i.е. второй корень).

√ 156 = √ 2 • 2 • 3 • 13 =
± 2 • √ 39
± 2 • √ 39

√ 39, округлые до 4 десятичных цифр, составляет 6,2450
, поэтому теперь мы смотрим:
B = (18 ± 2 • 6,245 ) / 6

Два действительных решения:

b =(18+√156)/6=3+1/3√ 39 = 5,082

или:

b =(18-√156)/6=3- 1/3√ 39 = 0,918

Были найдены два решения:

b = (18-√156)/6=3-1/3√ 39 = 0,918
b = (18+√156)/6= 3+1/3√ 39 = 5. 082

Общий закон — часть I, раздел II, глава 18B, раздел 13

Секция 13:

Плоские доски; члены; деловое свидание, встреча; условия

Раздел 13. В каждом районе, учрежденном в соответствии со статьей 3, должен быть районный совет по делам детей и семей, именуемый в этой главе районным советом, который должен быть агентством штата и работать в департаменте.Районный совет состоит из 23 членов, которые назначаются уполномоченным сроком на 3 года.

Ни один член не может быть сотрудником отдела. Две трети членов должны быть лицами, не являющимися служащими содружества или его политических подразделений.

Комиссар должен стремиться обеспечить надлежащее географическое представительство в составе правления. Две трети членов должны проживать в районе, для которого они назначены, а остальные члены должны либо жить, либо работать в этом районе. Должно быть включено не менее 1 члена от каждого города и, если возможно, от каждого города района.

Не менее 6 членов должны быть потребителями услуг, предоставляемых отделом. Не более 2 членов должны быть выбраны из кандидатур, представленных председателем группы коллективных переговоров, представляющих социальных работников, которые работают в отделе в этом районе. Из числа частных провайдеров на данной территории должно быть выбрано не более 2 членов. Один член на момент назначения должен быть членом местного совета по охране психического здоровья, созданного в соответствии с разделом 14 главы 19, 1 член на момент назначения должен быть лицом, обладающим знаниями в области умственной отсталости, 2 члена на момент на момент их назначения должны быть представителями финансовых или деловых кругов со специальными финансовыми или бюджетными навыками, а 2 члена на момент их назначения должны быть членами советов по общественным услугам, созданных в соответствии с разделом 7 главы 18.

По истечении срока полномочий любого члена его преемник назначается аналогичным образом сроком на 3 года. В случае вакансии комиссар может аналогичным образом назначить члена, который будет исполнять свои обязанности до конца оставшегося срока. Члены должны работать без вознаграждения и присягают на добросовестное выполнение своих обязанностей. Районный совет должен предложить на рассмотрение комиссара 1 или более имен для каждого такого истекающего срока или вакансии.Ни один член не может быть назначен более чем на 3 последовательных трехлетних срока.

Глава 18B Общего устава штата Северная Каролина

. Регулирование алкогольных напитков § 18B-302

(a) Продажа. Любое лицо должно считаться незаконным:

(1) Продавать солодовые напитки или некрепленое вино лицам моложе 21 года; или

(2) Продавать крепленое вино, спиртные напитки или смешанные напитки лицам моложе 21 года.

(a1) Дайте.— Любое лицо должно быть незаконным:

(1) Дать солодовые напитки или некрепленое вино лицам моложе 21 года; или

(2) Дайте крепленое вино, спиртные напитки или смешанные напитки лицам моложе 21 года.

(b) Покупка, владение или потребление. — Это должно быть незаконным для:

(1) Лицо моложе 21 года для покупки, попытки покупки или владения солодовыми напитками или некрепленым вином; или

(2) Лицо моложе 21 года для покупки, попытки покупки или владения крепленым вином, спиртными напитками или коктейлями; или

(3) Лица моложе 21 года могут употреблять любые алкогольные напитки.

(1) Несовершеннолетним лицом. Любое лицо, не достигшее законного возраста для совершения покупки и помогающее или подстрекающее другое лицо в нарушение подраздела (a), (a1) или (b) настоящей статьи, признается виновным в Правонарушение 2 класса.

(2) Лицом, достигшим совершеннолетия. Любое лицо, достигшее совершеннолетия для совершения покупок и помогающее или подстрекающее другое лицо в нарушение подраздела (a), (a1) или (b) настоящей статьи, считается виновным. о правонарушении 1 класса.

(d) Возражение. Возражением против нарушения подраздела (а) настоящего раздела считается, если продавец:

(1) Показывает, что покупатель предъявил водительские права, специальное удостоверение личности, выданное в Г.С.20-37.7 , военное удостоверение личности или паспорт, в котором указан его возраст, по крайней мере, требуемый возраст для покупки, и с физическим описанием лица, указанного в карточке, разумно описывающим покупателя; или

(2) Представляет доказательства других фактов, которые разумно указывали на момент продажи, что покупатель достиг требуемого возраста.

(3) Показывает, что во время покупки покупатель использовал систему биометрической идентификации, которая продемонстрировала (i) возраст покупателя как минимум требуемый возраст для покупки и (ii) покупатель ранее зарегистрировался у продавца или агент продавца водительские права, специальное удостоверение личности, выданное в Г. С.20-37.7 , военный билет или паспорт с указанием даты рождения покупателя и физическими данными лица, указанного в документе.

(e) Мошенническое использование идентификационных данных. – Вход или попытка проникновения любого лица в место, где продаются или потребляются алкогольные напитки, или получение или попытка получения алкогольных напитков, или получение или попытка получения алкогольных напитков, является незаконным. получить разрешение на покупку алкогольных напитков в нарушение пункта (b) настоящего раздела путем использования или попытки использования любого из следующего:

(1) Мошеннические или измененные водительские права.

(2) Поддельный или измененный документ, удостоверяющий личность, кроме водительских прав.

(3) Водительское удостоверение, выданное другому лицу.

(4) Документ, удостоверяющий личность, кроме водительского удостоверения, выданного другому лицу.

(5) Любая другая форма или средство идентификации, которые указывают или символизируют, что лицу не запрещено покупать или хранить алкогольные напитки в соответствии с настоящим разделом.

(f) Разрешение на использование удостоверения личности. – Разрешение любым лицом использовать водительские права или любую другую форму удостоверения личности любого рода, выданную или предоставленную этому лицу любым другим лицом, которое нарушает или пытается нарушить пункт (b) настоящего раздела.

(g) Отчет об осуждении, отправленный в Отдел автотранспортных средств. — Суд должен подать отчет об осуждении в Отдел автотранспортных средств с указанием имени осужденного и любой другой информации, запрошенной Отделом, если лицо осуждено за какое-либо из следующих:

(1) Нарушение подраздела (e) или (f) данного раздела.

(2) Нарушение пункта (c) настоящего раздела.

(3) Нарушение пункта (b) настоящей статьи, если нарушение произошло, когда лицо покупало или пыталось купить алкогольный напиток.

(4) Нарушение пункта (a1) настоящего раздела.

После получения отчета об осуждении Отдел аннулирует лицензию лица в соответствии с требованиями Г.С.20-17.3 .

(h) Обращение при исполнении служебных обязанностей. Ничто в этом разделе не должно толковаться как запрещающее несовершеннолетнему лицу продавать, перевозить, хранить или раздавать алкогольные напитки во время выполнения служебных обязанностей, если наем лица для этой цели законным в соответствии с применимыми законами о трудоустройстве молодежи и правилами Комиссии.

(i) Покупка, владение или потребление лицом в возрасте 19 или 20 лет. Нарушение подпункта (b)(1) или (b)(3) настоящего раздела лицом в возрасте 19 или 20 лет. является правонарушением 3 класса.

(j) Несмотря на любые другие положения закона, сотрудник правоохранительных органов может потребовать от любого лица, которое, по его обоснованным основаниям, не достигло 21 года и употребляло алкоголь, пройти тест на алкоголь с использованием устройства, одобренного Министерством здравоохранения. и социальные службы.Результаты любого скринингового устройства, применяемого в соответствии с правилами Министерства здравоохранения и социальных служб, допустимы в любом судебном или административном разбирательстве. Отказ от прохождения освидетельствования на наличие алкогольного опьянения допускается в любом судебном или административном порядке.

(k) Несмотря на положения данного раздела, употребление некрепленого вина или крепленого вина лицом моложе 21 года не является незаконным во время участия в освобожденной деятельности в соответствии с Г.С. 18Б-103(4) , (8) , или (11) .

Финансовый план Гамильтона [ushistory.org]

Американская история 1. Общество коренных американцев накануне британской колонизации а. Разнообразие групп коренных американцев b. Анасази ок. Алгонкские племена d. Племена ирокезов 2. Британия в Новом Свете а. Ранние начинания терпят неудачу b. Акционерные общества c. Поселение Джеймстаун и «Голодное время» d.

Рост торговли табаком e. Война и мир с народом Поухатана f.Палата горожан 3. Колонии Новой Англии а. Мэйфлауэр и Плимутская колония b. Уильям Брэдфорд и первый День благодарения ок. Массачусетский залив — «Город на холме» d. Пуританская жизнь e. Несогласие в Массачусетском заливе f. Добраться до Коннектикута g. Колдовство в Салеме 4. Средние колонии а. из Новых Нидерландов в Нью-Йорк b. Квакеры в Пенсильвании и Нью-Джерси ок. Город братской любви — Филадельфия d. Идеи Бенджамина Франклина 5. Южные колонии а.Мэриленд — католический эксперимент b. Наемные слуги c. Создание Каролины d. Должники в Грузии e. Жизнь на юге плантаций 6. Афроамериканцы в Британском Новом Свете а. Западноафриканское общество в точке соприкосновения с Европой b. «Средний проход» c. Рост рабства d. Рабская жизнь на ферме и в городе e. Свободные афроамериканцы в колониальную эпоху f. «Подчиненные коды» g. Новая афроамериканская культура 7. Начало революционного мышления а. Влияние Просвещения в Европе b.

Великое пробуждение c. Суд над Джоном Питером Зенгером ум. Контрабанда e. Традиция восстания f. «Что такое американец?» 8. Место Америки в глобальной борьбе а. Новая Франция b. Франко-индейская война c. История и опыт Джорджа Вашингтона d. Парижский мирный договор (1763 г.) и его последствия 9. События, приведшие к независимости а. Королевская прокламация 1763 г. b. Противоречие Закона о гербовом сборе c. Бостонские патриоты d. Акты Тауншенда e. Бостонская резня f.Чайный акт и чаепития g. Невыносимые действия 10. E Pluribus Unum a. Конгресс Закона о гербовых марках b. Сыновья и дочери свободы c. Комитеты по переписке d. Первый Континентальный Конгресс e. Второй Континентальный Конгресс f. Здравый смысл Томаса Пейна g. Декларация независимости 11. Американская революция а. Американские и британские сильные и слабые стороны b. Лоялисты, наблюдатели и патриоты c. Лексингтон и Конкорд d. Банкер-Хилл e. Революция в тылу f.Вашингтон в Вэлли-Фордж г. Битва при Саратоге х.

Французский Альянс i. Йорктаун и Парижский договор 12. Социальные последствия американской революции а. Влияние рабства b. Революция в социальном праве c. Политический опыт d. «Республиканское материнство» 13. Когда заканчивается революция? а. Декларация независимости и ее наследие b. Опыт войны: солдаты, офицеры и гражданские лица c. Лоялисты d. Революционные изменения и ограничения: рабство e.Революционные изменения и ограничения: женщины f. Революционные ограничения: коренные американцы g. Революционное достижение: йомены и ремесленники h. Эпоха атлантических революций 14. Установление правил а. Конституции штатов b. Статьи Конфедерации c. Оценка Конгресса d. Экономический кризис 1780-х гг. 15. Составление конституции а. Восстание Шейса b. Состав национальных суперзвезд c. Сложные вопросы d. Конституция через компромисс 16. Ратификация Конституции а. федералисты б.Антифедералисты c. Процесс ратификации: государство за государством d. После фактов: Вирджиния, Нью-Йорк и «Записки федералистов» e.

Победа антифедералистов в поражении 17. Джордж Вашингтон а. Вырос в колониальной Вирджинии b. Сила личности и военное командование c. Первая администрация d. Прощальный адрес e. Маунт-Вернон и дилемма революционного рабовладельца 18. Нерешенные внутренние вопросы а. Билль о правах b. Финансовый план Гамильтона c. Растущая оппозиция d.Военное поражение США; Индийская победа на Западе e. Устойчивость коренных американцев и насилие на Западе 19. Политика в переходный период: общественный конфликт в 1790-х гг. Трансатлантический кризис: Французская революция b. Переговоры со сверхдержавами c. Возникают две партии d. Президентство Адамса e. Законы об иностранцах и подстрекательстве к мятежу f. Жизнь и времена Джона Адамса 20. Джефферсонианская Америка: вторая революция? а. Выборы 1800 г. б. Идеология Джефферсона c. Экспансия на запад: покупка Луизианы d.Новая национальная столица: Вашингтон, округ Колумбия e. Оплот федералистов: Верховный суд Джона Маршалла f. Восстание Габриэля: другой взгляд на Вирджинию в 1800 г.

21. Расширяющаяся республика и война 1812 г. а. Значение Запада b. Исследование: Льюис и Кларк c. Дипломатические вызовы в эпоху европейских войн d. Сопротивление коренных американцев на западе Трансаппалачей e. Вторая война за независимость Америки f. Требование победы из поражения 22. Социальные изменения и национальное развитие a.Экономический рост и ранняя промышленная революция b. Хлопок и афроамериканская жизнь c. Религиозная трансформация и второе великое пробуждение d. Институционализация религиозной веры: Благотворительная Империя e. Новые роли для белых женщин f. Раннее национальное искусство и культурная независимость 23. Политика и новая нация а. Эпоха добрых чувств и двухпартийная система b. Расширение избирательного права: демократия белого человека c. Миссурийский компромисс d. Выборы 1824 г. и «коррупционная сделка» e.Джон Куинси Адамс f. Джексоновская демократия и современная Америка 24. Эпоха Джексона а. Восстание простого человека b. Сильное президентство c.

Споры об аннулировании в Южной Каролине d. Война против банка e. Джексон против Клея и Калхуна f. След слез — переселение индейцев 25. Подъем американской промышленности а. Эпоха каналов b. Ранние американские железные дороги c. Изобретатели и изобретения d. Первые американские фабрики e. Возникновение «женской сферы» f. Ирландская и немецкая иммиграция 26.Взрыв новой мысли а. Религиозное возрождение b. Эксперименты с утопией c. Права женщин d. Реформа тюрем и убежища e. Художники Школы реки Гудзон f. Трансцендентализм, американская философия 27. Своеобразный институт а. Коронация короля Коттона b. Рабская жизнь и кодексы рабства c. Плантация и рыцарство d. Свободные (?) афроамериканцы e. Восстания на плантации и за ее пределами f. Южный аргумент в пользу рабства 28. Растет аболиционистский настрой а. Уильям Ллойд Гаррисон и «Освободитель» б.Афро-американские аболиционисты c. Подземная железная дорога d. Гарриет Бичер-Стоу — Хижина дяди Тома 29. Явная судьба а.

Республика Одинокой Звезды b. 54° 40′ или Бой c. «Американская кровь на американской земле» d. Американо-мексиканская война e. Золото в Калифорнии 30. Непростой мир а. Условие Уилмота b. Народный суверенитет c. Три сенаторских гиганта: Клэй, Кэлхун и Вебстер д. Компромисс 1850 г. 31. «Кровавый Канзас» а. Закон Канзаса-Небраски b. Пограничные хулиганы c.Мешок Лоуренса d. Резня в Поттаватоми-Крик e. Canefight! Престон Брукс и Чарльз Самнер 32. От непростого мира к ожесточенному конфликту а. Решение Дреда Скотта b. Дебаты Линкольна-Дугласа c. Рейд Джона Брауна d. Выборы 1860 г. Юг отделяется 33. Разделенный дом а. Форт Самтер b. Сильные и слабые стороны: Север против Юга c. Первая кровь и ее последствия d. Священные верования e. Кровавый Антиетам f. О генералах и солдатах g. Геттисберг: Высшая точка Конфедерации h.Северные планы по окончанию войны i. Дорога к Аппоматтоксу 34. Война в тылу а. Прокламация об освобождении b. Дипломатия военного времени c. Северный тыл d. Южный тыл e.

Выборы 1864 г. f. Убийство президента 35. Реконструкция а. Президентская реконструкция b. Радикальная реконструкция c. Президент подвергся импичменту d. Восстановление старого порядка 36. Позолоченный век а. Связывание нации по железной дороге b. Новые магнаты: Джон Д. Рокфеллер ок.Новые магнаты: Эндрю Карнеги ум. Новые магнаты: Дж. Пьерпон Морган e. Новое отношение к богатству f. Политика позолоченного века 37. Организованный труд а. Великий переворот b. Трудовые ресурсы против руководства c. Ранние национальные организации d. Американская федерация труда e. Юджин В. Дебс и американский социализм 38. Из деревни в город а. Очарование американских городов b. Обратная сторона городской жизни c. Наплыв иммигрантов d. Коррупция выходит из-под контроля e. Религиозное возрождение: «Социальное евангелие» f.Художественные и литературные тенденции 39. Новые измерения в повседневной жизни a. Образование б. Спорт и отдых c. Женщины в позолоченном веке d. Викторианские ценности в новую эпоху e.

Печатная революция 40. Закрытие границ a. Резня в Сэнд-Крик b. Последний бой Кастера c. Конец сопротивления d. Жизнь в резервациях e. Резня Вундед-Ни 41. Западные народные обычаи а. Горнодобывающий бум b. Пути ковбоя c. Жизнь на ферме d. Рост популизма e. Выборы 1896 года 42.Прогрессивизм охватывает нацию а. Корни движения b. Сборщики мусора c. Наконец-то избирательное право женщин d. Букер Т. Вашингтон e. У. Э. Б. Дюбуа 43. Прогрессисты в Белом доме а. Тедди Рузвельт: Грубый всадник в Белом доме b. Разрушитель доверия c. Рука помощи для труда d. Сохранение дикой природы e. Передача факела f. Выборы 1912 г. Новая свобода Вудро Вильсона 44. В поисках империи а. Ранние пробуждения b. Гавайская аннексия c. «Помни Мэн!» д.Испано-американская война и ее последствия e. Следствие Рузвельта и Латинская Америка f. Добраться до Азии g. Панамский канал 45. Америка в Первой мировой войне а. Прощай, изоляция b. Там c. Здесь d. Версальский договор и Лига Наций 46. Бурное десятилетие а.

Эпоха автомобилей b. Борьба с «демоническим ромом» c. Изобретение подростка d. Заслонки e. Гарлемское Возрождение f. Экономика потребления g. Радиолихорадка h.Причуды и герои 47. Старые ценности против новых ценностей a. Красная угроза b. Суд над обезьяной c. Непереносимость d. Книги и фильмы e. Внутренняя и международная политика 48. Великая депрессия а. Крах рынка b. Погружаясь все глубже и глубже: 1929-33 гг. Бонусный марш d. Последняя битва Гувера e. Социальные и культурные последствия депрессии 49. Новый курс а. Банковский выходной b. Возвращение людей к работе c. Проблема земледелия d. Социальное обеспечение e. Алфавитный суп Рузвельта f. Критики Рузвельта g.Оценка Нового курса 50. Дорога в Перл-Харбор а. Изоляционизм 1930-х годов б. Реакция на неспокойный мир c. Начинается война d. Арсенал демократии e. Перл-Харбор 51. Америка во Второй мировой войне а. Стратегия военного времени b. Американский тыл c. День «Д» и капитуляция Германии d. Война на Тихом океане e.

Японо-американское интернирование f. Манхэттенский проект g. Решение сбросить бомбу 52. Послевоенные вызовы а. Вспыхивает холодная война b. Организация Объединенных Наций c.Сдерживание и план Маршалла d. Берлинский воздушный мост и НАТО e. Корейская война f. Внутренние вызовы 53. 1950-е годы: счастливые дни а. Маккартизм б. Пригородный рост c. Земля телевидения d. Американский рок-н-ролл e. Холодная война продолжается f. Голоса против конформизма 54. Новое движение за гражданские права а. Отдельно больше нет? б. Роза Паркс и автобусный бойкот Монтгомери c. Столкновение в Литл-Роке d. Сидячая забастовка e. Доходы и потери f. Мартин Лютер Кинг мл. г. Долгое жаркое лето h.Малкольм Икс и нация ислама i. Власть черных 55. Вьетнамская война а. Раннее участие b. Годы эскалации: 1965-68 гг. Тетское наступление d. Антивоенное движение e. Годы ухода 56. Политика от Камелота до Уотергейта а. Выборы 1960 г. б. Новый рубеж Кеннеди c. Глобальные вызовы Кеннеди d. Убийство Кеннеди e.

«Великое общество» Линдона Джонсона f. 1968: Год распутывания g. Треугольная дипломатия: США, СССР и Китай 57. Формирование Новой Америки а.Современный феминизм b. Борьба за репродуктивные права c. Поправка о равных правах d. Роу против Уэйда и его последствия e. Экологическая реформа f. Другие требуют равенства g. Студенческая активность h. Цветочная сила 58. Время болезни а. Отмена президента b. Больная экономика c. Зарубежные беды d. Поиск себя e. Новые правые 59. Годы Рейгана а. «Утро в Америке» б. Рейганомика c. Внутренние и внешние связи d. Жизнь в 1980-х e. Конец холодной войны 60.Навстречу новому тысячелетию а. Операция «Буря в пустыне» b. Бэби-бумер в Белом доме c. Республиканцы против демократов d. Жизнь в век информации e. Конец американского века
Александр Гамильтон — один из немногих американских деятелей, фигурирующих в американской валюте, который никогда не был президентом. Он был убит в 1804 году на дуэли с Аароном Берром.

Президенты Вашингтон (1 доллар), Линкольн (5 долларов), Джексон (20 долларов) и Грант (50 долларов) указаны на валюте. А как насчет этого парня Александра Гамильтона на десятом месте? Как он туда попал? Козел говорит, что вы узнаете ответ после прочтения этой статьи.

Основная проблема, с которой столкнулось первое федеральное правительство, заключалась в том, как справиться с финансовым хаосом, созданным Американской революцией. Государства имели огромные военные долги. Произошла бешеная инфляция. На протяжении 1780-х годов почти все области экономики выглядели уныло. Тяжелые экономические времена были основным фактором, создавшим ощущение кризиса, которое привело к усилению центрального правительства в соответствии с новой Конституцией.

Джордж Вашингтон выбрал талантливого Александра Гамильтона, который служил с ним на протяжении всей Войны за независимость, чтобы взять на себя руководство федеральной экономической политикой в качестве министра финансов.Гамильтон — очаровательный персонаж, чьи амбиции способствовали огромному успеху человека, который сделал себя сам. Родившийся в Вест-Индии у матери-одиночки, которая была владельцем магазина, он научился у нее своим первым экономическим принципам и пошел подмастерьем в крупную торговую фирму. Из этого скромного происхождения Гамильтон стал главным защитником современной капиталистической экономики в ранних национальных Соединенных Штатах.

Влиятельные связи Гамильтона были связаны не только с Вашингтоном, но и с сетью ведущих нью-йоркских торговцев и финансистов.Его брак в 1780 году с Элизабет Шайлер из богатой семьи, владевшей землей в долине реки Гудзон, укрепил его связи с богатыми и влиятельными лидерами Нью-Йорка. Его новаторская финансовая политика помогла преодолеть финансовые проблемы Конфедерации, а также принесла пользу экономической элите, с которой он имел тесные связи.

Александр Гамильтон задумал Первый банк Соединенных Штатов как способ стандартизировать американскую валюту и справиться с национальным долгом времен войны за независимость. Банк до сих пор стоит в Национальном парке Независимости в Филадельфии.

Первый вопрос, которым занялся Гамильтон в качестве министра финансов Вашингтона, касался проблемы государственного кредита. Правительства всех уровней взяли на себя столько долгов во время революции. Обязательство вернуть их не было воспринято очень серьезно. К концу 1780-х годов стоимость таких государственных ценных бумаг упала до небольшой доли их номинальной стоимости. Другими словами, государственные долговые расписки — деньги, взятые взаймы для финансирования революции, — считались почти бесполезными.

Гамильтон выступил со смелым предложением.Федеральное правительство должно полностью погасить все долги Конфедерации (штата). Такие действия значительно укрепили бы легитимность нового центрального правительства. Чтобы собрать деньги для погашения долгов, Гамильтон выпустит новые ценные бумаги). Инвесторы, купившие эти государственные ценные бумаги, могли бы получить огромную прибыль, когда Соединенным Штатам придет время выплачивать эти новые долги.

Прялка «Дженни» была одной из нескольких крупных технологических инноваций, которые сделали британский текстиль такой экономической силой.

Видение Гамильтона по перестройке американской экономики включало федеральную хартию национального финансового учреждения. Он предложил Банк Соединенных Штатов. Созданный по образцу Банка Англии, центральный банк поможет сделать экономику новой страны динамичной за счет более стабильной бумажной валюты.

Центральный банк столкнулся с серьезным сопротивлением. Многие опасались, что он попадет под влияние богатых горожан с северо-востока и спекулянтов из-за границы. В конце концов, при поддержке Джорджа Вашингтона, банк получил первую штаб-квартиру в Филадельфии.

Третье важное направление экономического плана Гамильтона было направлено на то, чтобы сделать американских производителей самодостаточными. Американская экономика традиционно опиралась на крупномасштабный экспорт сельскохозяйственной продукции для оплаты импорта британских промышленных товаров. Гамильтон справедливо считал, что эта зависимость от дорогих иностранных товаров удерживала американскую экономику на ограниченном уровне, особенно по сравнению с быстрым ростом ранней индустриализации в Великобритании.

Вместо того, чтобы принять это условие, Гамильтон хотел, чтобы Соединенные Штаты приняли меркантилистскую экономическую политику. Это защитило бы американских производителей за счет прямых государственных субсидий (подачек бизнесу) и тарифов (налогов на импортные товары). Эта протекционистская политика поможет начинающим американским производителям конкурировать с недорогим европейским импортом.

Гамильтон обладал удивительно острым экономическим видением. Его агрессивная поддержка производства, банков и сильного государственного кредита стали центральными аспектами современной капиталистической экономики, которая разовьется в Соединенных Штатах через столетие после его смерти.Тем не менее, его политика была глубоко противоречивой в свое время.

Многим американцам не нравится ни элитарное отношение Гамильтона, ни его приверженность британской модели экономического развития. Его пробританская внешняя политика была потенциально взрывоопасной после революции. Гамильтон выступал за даже более сильное центральное правительство, чем было создано Конституцией, и часто связывал демократические импульсы с потенциальной анархией. Наконец, поскольку бенефициары его новаторской экономической политики были сосредоточены на северо-востоке, они угрожали спровоцировать разобщающие географические различия в новой нации.

Тем не менее, экономическая философия Гамильтона стала пробным камнем современной американской капиталистической экономики.

Спорим на 10 долларов, теперь вы понимаете, почему он на 10-долларовой купюре.

Длинная некодирующая РНК SNHG1 способствует экспрессии TERT путем губчатой миР-18b-5p при раке молочной железы | Cell & Bioscience

Доступ к общедоступным данным и их анализ

Профиль экспрессии SNHG1 по всему геному и информация о клинической патологии рака человека были загружены из базы данных TCGA (https://tcga-data.nci.nih.gov/) . Транскрипт SNHG1 нормализовали путем трансформации log ₂. Экспрессия SNHG1 была дихотомизирована с использованием медианного выражения для конкретного исследования в качестве порогового значения для определения «высокого значения» на уровне медианы или выше по сравнению с «низким значением» ниже медианы. Подробная клиническая патологическая информация, включая идентификационный номер, стадию TNM пациента с раком молочной железы из TCGA, показана в дополнительном файле 3: Таблица S1. База данных GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) и база данных TCGA использовались для прогнозирования корреляций между SNHG1 и TERT; E2F1 и SNHG1 при раке поджелудочной железы и раке молочной железы.Корреляции между генами оценивали по коэффициентам корреляции Пирсона. Prognoscan (http://dna00.bio.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html) [46] и плоттер KM (http://kmplot.com/analysis/) использовались для изучения выживаемости больных раком молочной железы. в соответствии с дифференциальным уровнем экспрессии SNHG1. Профиль экспрессии кодирующего гена при раке молочной железы был извлечен из профиля экспрессии TCGA BRCA (дополнительный файл 7: таблица S5). По уровню экспрессии SNHG1 образцы ткани рака молочной железы были разделены на две группы.Было обнаружено, что группа с высокой экспрессией SNHG1 больше или равна среднему значению SNHG1, в то время как группа с низкой экспрессией SNHG1 оказалась меньше среднего значения. Дифференциально экспрессируемый ген (DEG) был идентифицирован по edgeR между группой с высокой экспрессией SNHG1 и группой с низкой экспрессией, из которых FDR < 0,01, FC > 1,2.

Клеточная культура

Линии клеток MDA-MB-468, Hs578T, HEK293T, MDA-MB-231 и 4T1 были получены из банка клеток Китайской академии наук. MDA-MB-468, Hs578T, HEK293T и 4T1 культивировали в среде DMEM (Gibco, Waltham, MA) и 10% фетальной бычьей сыворотке (FBS; Gibco), 100 мкг/мл пенициллина и выращивали при 37 °C с 5% CO. ₂ (термо).MDA-MB-231 культивировали в среде L15 (Gibco, Waltham, MA) и 10% FBS, 100 мкг/мл пенициллина и выращивали при 37 °C в воздушном инкубаторе (Thermo).

Пациенты и образцы тканей

Ткани рака молочной железы и парные нормальные ткани были получены из Онкологического центра Харбинского медицинского университета (HMUCC). Ни один из пациентов не получил адъювантную химиотерапию, иммунотерапию или лучевую терапию перед операцией, и пациенты с рецидивами опухолей, метастатическим заболеванием, двусторонними опухолями или другими предшествующими опухолями были исключены. Для экстракции РНК свежую ткань от людей с раком молочной железы и нормальных контролей собирали и хранили при температуре - 80 °C сразу после резекции. Уровень экспрессии SNHG1 и TERT измеряли с помощью RT-qPCR. Это исследование было одобрено комитетами по этике Харбинского медицинского университета. Письменное информированное согласие было получено от всех субъектов, принимавших участие в этом исследовании.

Экстракция РНК и ОТ-ПЦР

Образцы тотальной РНК из образцов клеток выделяли с использованием реагента Тризол (Invitrogen, США) в соответствии с протоколами производителя.Затем тотальную РНК (0,5 мкг) подвергали обратной транскрипции с использованием набора для синтеза кДНК Transcriptor First Strand (Roche, США) для получения кДНК. Набор SYBR Green PCR Master Mix Kit (Applied Biosystems, США) использовали для количественного определения уровней РНК с использованием набора SYBR Green PCR Master Mix, результаты нормализовали относительно уровней экспрессии GAPDH и U6 с использованием метода 2 ^–ΔΔCT. ОТ-кПЦР проводили на системе ПЦР в реальном времени ABI StepOne (Applied Biosystems, США). Последовательности праймеров следующие: SNHG1-F: 5′-AACTTCCCATAACTCCACTTC-3′; SNHG1-R: 5′-ACAACCAACACAGCAACAC-3′; TERT-F: 5′-CTGTACTTTGTCAAGGTGGATGTGA-3′; TERT-R: 5′-ACGTGTTCTGGGGTTTGATGATG-3′; Hsa-миР-18b-5p-F: 5′-CGGGCTAAGGTGCATCTAGTGC-3′; Hsa-миР-18b-5p-R: 5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′; Hsa-миР-18b-5p-RT: 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTAACA-3′; Hsa-U6-F: 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′; Hsa-U6-R: 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′; Hsa-U6-RT: 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′;

Hsa-миР-18a-5p-F: 5′-GCGGGCTAAGGTGCATCTAGTGC-3′; Hsa-миР-18a-5p-R: 5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′; Hsa-миР-18a-5p-RT: 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCTATCT-3′; Hsa-миР-376a-3p-F: 5′-CGGGCCGGATCATAGAGGAAAAT-3′; Hsa-миР-376a-3p-R: 5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′; Hsa-миР-376a-3p-RT: 5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACACACACGTGG-3′; Hsa-383-5p-F: 5′-GCGGGCAGATCAGAAGGTGATT-3′; Hsa-383-5p-R: 5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′; Hsa-383-5p-RT: 5′-GTCGTACCAAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCCAC-3′; GAPDH-F: 5′-CATGTTCGTCATGGGTGTGAA-3′; GAPDH-R: 5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′; E2F1-F: 5′-ACGTGACGTGTCAGGACCT-3′; E2F1-R: 5′-GATCGGGCCTTGTTTGCTCTT-3′; Mus-TERT-F: 5′-TCTACCGCACTTTGGTTGCC-3′; Mus-TERT-R: 5′-CAGCACGTTTCTCTCGTTGC-3′.

Трансфекция малых интерферирующих РНК, миметиков/ингибиторов миРНК и плазмиды

Короткие интерферирующие РНК (миРНК) LncRNA SNHG1, миметики Hsa-miR-18b-5p и ингибитор Hsa-miR-18b-5p были синтезированы компанией Ribo Co., Ltd. (Гуандун, Китай). Плазмида SNHG1 (pcDNA3.1-SNHG1) была сконструирована компанией Shanghai GeneChem, Co. для сверхэкспрессии SNHG1. Клетки высевали в 6-луночный планшет, когда клетки вырастали до 70–80% слияния для трансфекции миРНК (100 нмоль), миРНК (100 нмоль), ингибитора (50 нмоль) и плазмиды со сверхэкспрессией SNHG1 (2000 нг).Клетки трансфицировали с использованием jetPRIME (трансфекция Polyplus). Последовательности следующие: si-контрольный смысл: UUCUCCGAACGUGUCACGUTT; si-SNHG1#1 смысл: GGUUUGCUGUGUAUCACAUTT; si-SNHG1#2 смысл: GACCUAGCUUGUUGCCAAUTT; si-E2F1#1 смысл: GAGACCTCTTCGACTGTGA; si-E2F1#2 смысл: CTATGAGACCTCACTGAAT; si-E2F1#3: GGGAGAAGTCACGCTATGA; смысл si-TERT#1: GAGCCAGTCTCACCTTCAA; смысл si-TERT#2: GGAGCAAGTTGCAAAGCAT; si-TERT#3 смысл: GAGTGACCGTGGTTTCTGT. Перемешанные миметики/ингибитор отрицательного контроля и микроРНК (миР) 18b-5p-, миР-383-5p были приобретены у Invitrogen (Invitrogen, Калифорния, США) и имели следующие последовательности: Hsa-miR-18b-5p миметики смысл: UAAGGUGCAUCUACUAGUGCAGUUAG антисмысловой : AACUGCACUAGAUGCACCUUAUU; Значение ингибитора Hsa-miR-18b-5p: CUAACUGCACUAGAUGCACCUUA; Hsa-miR-383-5p имитирует смысл: AGAUCAGAAGGUGAUUGUGGCU антисмысл: CCACAAUCACCUUCUGAUCUUU; имеет смысл ингибитора-18b-5p: CUAACUGCACUAGAUGCACCUUA.

Лентивирусная трансфекция

Полноразмерные последовательности РНК-интерференции и антисмысловые последовательности были амплифицированы с помощью ПЦР и клонированы в лентивирусные частицы, отобранные с использованием пуромицина, которые были сконструированы и упакованы компанией Shanghai GeneChem, Co., Ltd. Для лентивирусной трансфекции использовали умеренные лентивирусы для заражения Клетки 4T1 в 6-луночном планшете с полибреном 4–6 мкг/мл (№ 107689, Sigma). Затем инфицированные клетки подвергали селекции с 1 мкг/мл пуромицина (№ 540411, Calbiochem, США) и культивировали в течение нескольких дней. Стабильный нокдаун snhg1 исследовали с помощью ОТ-ПЦР. Последовательность лентивируса следующая: sh-snhg1#1: CTGGTGACAAATCTCAGGCAT; sh-snhg1 # 2: GTGGTTCATCTCAAAGCCCCTT; sh-snhg1#3: AAGGATAGGAACAGAAATCAT.

Анализ жизнеспособности клеток

Жизнеспособность обработанных клеток оценивали с помощью набора Cell Counting Kit-8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan) в соответствии с инструкциями производителя и как описано ранее [47]. Вкратце, клетки высевали с плотностью 5 × 10 ³ клеток/лунка со 100 мкл DMEM + 10% FBS в 96-луночные планшеты для микротитрования.В каждую лунку добавляли 10 мкл раствора CCK-8, включая 100 мкл среды DMEM, а затем планшет инкубировали при 37 °C в течение 60 минут. Затем измеряли оптическую плотность каждой лунки с помощью устройства для считывания микропланшетов при длине волны 450 нм. Среда, содержащая 10% CCK-8, служила контролем.

Анализ образования колоний

1 × 10 ³ клеток высевали в 6-луночный планшет и культивировали в среде, содержащей 10% FBS, в течение 14 дней.

Утилизируйте культуральную среду, трижды промойте PBS 6-луночный планшет.Колонии фиксировали метанолом в течение 40 минут, затем в каждую лунку на 30 минут добавляли по 500 мкл 5% кристаллического фиолетового (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). После окрашивания колонии осторожно промывали и подсчитывали.

Анализ заживления ран

Клетки высевали в 6-луночный планшет, трансфицировали миРНК или миметиками миРНК в соответствии с предыдущим методом. Когда слияние клеток достигало 100%, пипеткой на 10 мкл делали царапины на дне 6-луночного планшета. Поцарапанные клетки смыты.Затем фотографирование через 0 ч, 24 ч, 48 ч.

Анализ инвазии Transwell

Анализ инвазии Transwell проводили с использованием планшета Transwell (Corning, Нью-Йорк, США), покрытого матригелем (Sigma-Aldrich, США). 5 × 10 ⁴ клеток в бессывороточной среде суспендировали в верхней камере с матригелем. В нижнюю камеру добавляли среду, содержащую 20% FBS (Seratech, PAN). После инкубации при 37°С в течение 48 ч. Затем культуральную среду отбрасывали, клетки, проникшие на нижнюю сторону трансвелла, фиксировали метанолом, окрашивали 0.5% кристаллический фиолетовый и изображение под микроскопом. Изображение J использовалось для подсчета количества клеток.

Эксперименты на животных

Эксперименты на животных были одобрены Медицинской комиссией по экспериментальному уходу за животными Харбинского медицинского университета. Самок мышей Balb/C в возрасте 4–5 недель приобретали в Центре животных Второго филиала Харбинского медицинского университета. Клетки 4T1, стабильно экспрессирующие sh-scramble и sh-snhg1#3, ресуспендировали в среде DMEM. Затем 100 мкл бессывороточной среды, содержащей 5 × 10 ⁴ клеток, вводили в правую жировую ткань молочной железы.Объем опухоли измеряли штангенциркулем каждые 2 дня, начиная с 6-го дня после имплантации клеток. BIBR1532 вводили внутрибрюшинно (в/б) в дозе 1,5 мг/кг в течение 2 недель. Объем опухоли рассчитывали по формуле объем опухоли = 1/2 (длина × ширина ² ). Затем мышей подвергали эвтаназии, измеряли массу опухолей у мышей. Затем из половины опухолей экстрагировали белок, а из другой половины экстрагировали РНК.

Вестерн-блоттинг

Клетки лизировали лизирующим буфером, содержащим 150 ммоль/л NaCl, 1% Triton X-100, 5 ммоль/л ЭДТА, 5000 ЕД/мл апротинина, 20 мг/мл лейпептина, 1 ммоль/л. фенилметилсульфонилфторид, 2 ммоль/л ортованадата натрия, 50 ммоль/л NaF, 5% глицерин, 10 ммоль/л трис-HCl (pH 7.4) и 2% SDS. Затем ультразвуковая дробилка была использована для разрушения клеточного ядра. После центрифугирования при 13 500 × g в течение 30 минут собирали надосадочную жидкость. Затем концентрации белка тестировали с помощью набора для анализа белка BCA (#p0010; Beyotime, Шанхай, Китай). Затем эти белки разделяли с помощью SDS-PAGE с последующим электроблоттингом на нитроцеллюлозной мембране, которую блокировали 5% обезжиренным молоком в 0,1% Tween 20-TBS в течение ночи при 4°C. Мембрану инкубировали с первичным антителом против TERT (#sc-377511; биотехнология Санта-Крус), антителом E2F1 (#3742; Cell Signaling Technology) и β-актином (#sc-377511; биотехнология Санта-Крус). После промывания Tween 20/TBS (TBST) мембрану инкубировали со вторичными антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена, в течение 1 ч при комнатной температуре. После промывания Tween 20/PBS (PBST) полосы белка на мембране визуализировали с помощью системы обнаружения вестерн-блоттинга с усиленной хемилюминесценцией (Western Lightning; Perkin-Elmer, Norwalk, CT).

Анализ репортерного гена двойной люциферазы

Мы клонировали полноразмерные 3′-нетранслируемые области (UTR) SNHG1 и TERT человека для создания репортерных векторов с сайтами связывания микроРНК.Полноразмерные 3′-UTR SNHG1 и TERT человека амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в вектор экспрессии люциферазы psi-CHECK-2, который содержал сайты Not1-Xhol. Клетки HEK293T были выбраны для проведения этого анализа. Когда 293 Т достигла 40–50% слияния, JetPRIME использовали для трансфекции HEK293T 20 мкмоль/л миметиков Hsa-miR-18b-5p или миметиков отрицательного контроля и 0,5 мг плазмиды. Активность люциферазы измеряли через 48 ч после трансфекции с использованием набора для анализа с двумя репортерными люциферазами (#E1910, Promega, США) и люминометра (GloMax 20/20, Promega, США).

Фракционирование цитоплазматической и ядерной РНК

Экстракцию цитоплазматической и ядерной РНК разделяли с использованием набора для очистки цитоплазматической и ядерной РНК (№ 21000, NORGEN) в соответствии с указаниями производителя. Мы собрали 3 × 10 ⁶ клеток (HEK293T, MDA-MB-468 и Hs578T), промыли их охлажденным на льду PBS, а затем ресуспендировали эти клетки в охлажденном на льду цитоплазматическом лизисном буфере J на 5 минут на льду. Затем лизаты центрифугировали при 13 500× g в течение 10 мин при 4°С. Супернатант собирали как цитоплазматическую фракцию, оставшиеся лизаты собирали как ядерную фракцию.Наконец, цитоплазматическая РНК и ядерная РНК были успешно разделены. Затем с помощью ОТ-ПЦР определяли уровни экспрессии GAPDH, U1 и SNHG1 в цитоплазме или ядре.

Иммунопреципитация хроматина (ChIP)

Анализы иммунопреципитации хроматина (ChIP) проводились с использованием набора для анализа ChIP (#p2078; Beyotime, Шанхай, Китай) в соответствии с протоколом производителя. 2 × 10 ⁷ клеток сшивали 1% формальдегидом, и эту реакцию останавливали через 20 минут добавлением глицина в конечной концентрации 0.125 М. ДНК подвергали иммунопреципитации из обработанных ультразвуком клеточных лизатов с использованием антитела E2F1; IgG (BD Biosciences, Сан-Диего, Калифорния, США) служил в качестве отрицательного контроля. Protein A/G Plus-агароза была приобретена у компании Santa Cruz Biotechnology (#sc-2003). R Наза А в качестве обработки протеиназой К, иммунопреципитированную ДНК экстрагировали с помощью набора для очистки ДНК (Beyotime, Шанхай, Китай). Иммунопреципитированную ДНК подвергали ПЦР для амплификации сайтов связывания промотора E2F1. Затем амплифицированные фрагменты анализировали на агарозном геле.Хроматин (1%) перед иммунопреципитацией использовали в качестве входного контроля. Последовательности праймеров сайта связывания между E2F1 и SNHG1 были следующими: SNHG1-F: 5′-CAGGAGAATTGCTTGAACCCG-3′; SNHG1-R: 5′-TGGCCCGATCTCAGCTCACT-3′.

Электрофорез нуклеиновых кислот

Продукты ПЦР ДНК исследовали с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с текущим буфером ТАЕ. ДНК разделяли электрофорезом при 100 В в течение 30 мин. В качестве ДНК-маркера использовали Marker L (50–500 п.н.) (Sango Biotech, Китай).Полосы исследовали с помощью УФ-облучения (Biorad).

Статистический анализ

Экспрессию SNHG1 в раковых тканях по сравнению с нормальными тканями тестировали с помощью парного t-критерия. Метод Каплана-Мейера и критерий логарифмического ранга использовались для оценки разницы в выживаемости между пациентами с высокой экспрессией SNHG1 и низкой экспрессией SNHG1. Различия результатов экспериментов in vitro и in vivo между группами анализировали с помощью критерия Стьюдента. Все эксперименты были выполнены независимо в трехкратной повторности.Все статистические тесты были двусторонними, и P < 0,05 указывали на статистическую значимость. Статистический анализ выполнен с использованием графического программного обеспечения 332R.3.4 и программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software, США).

WX-132-18B, новый ингибитор микротрубочек, проявляет многообещающие противоопухолевые эффекты

ВВЕДЕНИЕ

Микротрубочки являются важными компонентами цитоскелета и участвуют во многих клеточных процессах, включая поддержание морфологии клеток, внутриклеточный транспорт и митоз [1]. , 2].Динамический цикл между тубулином и микротрубочками имеет решающее значение для клеточной функции, особенно при нормальном митозе [3]. Таким образом, ингибирование микротрубочек является потенциальной стратегией лечения рака, поскольку ингибирование динамики микротрубочек остановит клеточный цикл и, таким образом, ингибирует пролиферацию опухолевых клеток [4]. Три хорошо известных агента, ингибирующих микротрубочки (МИА) с различными сайтами связывания тубулина, широко используются для лечения различных видов рака и подагрического артрита: препараты, деполимеризующие микротрубочки, колхицин и винкристин, и агент, полимеризующий микротрубочки, таксол (рис. 1) [1]. 5, 6].Таксол и винкристин являются препаратами первой линии для лечения рака легких [7], рака молочной железы [8] и рака яичников [9]. Как и в случае с другими противоопухолевыми препаратами, непереносимая токсичность [10] и лекарственная устойчивость ограничивают клиническое применение этих препаратов. Плохая растворимость в воде и нехватка сырья также ограничивают клиническое использование таксола. Разработка новых ингибиторов микротрубочек с более высокой активностью, меньшей токсичностью и лучшей устойчивостью к лекарственным препаратам, чем доступные в настоящее время варианты, остается насущной потребностью и текущим направлением исследований [11, 12].Комбретастатин А4, соединение, нацеленное на колхицин, и агент, разрушающий сосуды, который может разрушать кровеносные сосуды опухоли и эффективно ингибировать солидные опухоли, недавно прошел клинические испытания фазы I и II [13-15]. Кроме того, МИА с высокой цитотоксической активностью в настоящее время также являются первым выбором для конъюгата антитело-лекарственное средство [16, 17].

Рисунок 1: Химическая структура соединения WX-132-18B и трех известных агентов, ингибирующих микротрубочки (таксол, колхицин и винкристин).

WX-132-18B — новое структурное соединение, синтезированное в Пекинском институте фармакологии и токсикологии (рис. 1).Предварительный скрининг показал, что WX-132-18B нацелен на микротрубочки и проявляет высокую биологическую активность в ингибировании пролиферации опухолевых клеток. В этом исследовании противоопухолевые эффекты WX-132-18B были впервые изучены на ряде линий опухолевых клеток человека. В качестве положительных контролей использовали три классических МИА (колхицин, винкристин и таксол). Мишень WX-132-18B была тщательно подтверждена с помощью теста конкурентного связывания тубулина, многопараметрического анализа высокого содержания (HCA) клеточного скелета и функциональных анализов клеток, связанных с ингибированием микротрубочек.WX-132-18B также подвергали скринингу на гепатотоксические профили фенотипа и 22 сигнальных пути, связанных с опухолью. Наконец, противоопухолевых эффектов in vivo WX-132-18B систематически оценивали на трех различных мышиных моделях ксенотрансплантата опухоли.

РЕЗУЛЬТАТЫ

WX-132-18B ингибирует пролиферацию опухолевых клеток

Противоопухолевую биологическую активность WX-132-18B оценивали с использованием метода сульфородамина B (SRB) в линиях раковых клеток HepG2, HeLa, A549, h560, BGC -823, MX-1, устойчивые к таксолу клетки рака молочной железы MX-1/T и эндотелиальные клетки пупочной вены человека (HUVEC). Как показано в таблице 1, WX-132-18B проявлял самую сильную ингибирующую активность в отношении всех тестируемых клеточных линий по сравнению с тремя тестируемыми контрольными MIA (таксол, колхицин и винкристин). Контрольные MIA показали очевидную клеточную селективность и имели более низкое значение IC ₅₀ на HUVEC и гораздо более высокое значение IC ₅₀ на MX-1/T, чем их эффекты на другие линии раковых клеток. Однако WX-132-18B не проявлял селективности ни в одной протестированной линии раковых клеток и проявлял более сильную ингибирующую активность, чем три известных MIA, на всех клеточных линиях со значением IC ₅₀ менее 1 нМ.Сходство формы кривой концентрация-ингибирование между WX-132-18B и колхицином позволяет предположить, что они могут иметь сходные механизмы действия (рис. 2).

Таблица 1: IC ₅₀ Значения проверенных соединений в разных клеточных линиях

9152

⁵⁴

⁴

279,35

IC _{50 IC ₅₀ (NM)}
IC _{50 IC ₅₀ (NM)}	HEPG2	HeLa	А549	H560	КУП-823	МХ-1	MX-1 / T	HUVEC
Таксол	10. 68 ± 0,61	12,86 ± 0,25	4,81 ± 0,61	6,7 ± 0,21	6,59 ± 0,76	50,03 ± 8,17	689,76 ± 25,08	3,04 ± 0.12
					43.80 ± 1,64	26,74 ± 2,26	12.24 ± 3,61	90,70 ± 4,74	260,48 ± 5,92	27,67 ± 1,79
винкристин	16,51 ± 0,36	16,76 ± 0,33	27.80 ± 2,75	4,87 ± 0,34	6,03 ± 1,64		302,77	9,15 ± 0,78
WX-132-18B	0.80 ± 0,02	0,90 ± 0,01	0,99 ± 0,06	0,86 ± 0,03	0,45 ± 0,07	0,90 ± 0,04	0,84 ± 0,04	0,70 ±0,04

Клетки обрабатывали различными соединениями в течение 72 часов. Значения средние ± стандартное отклонение, n = 3

эндотелиальные клетки пупочной вены.Клетки обрабатывали различными соединениями в течение 72 ч, а затем анализировали методом сульфородамина В, как указано. Значения средние ± стандартное отклонение, n = 3.

WX-132-18B индуцирует деполимеризацию микротрубочек в клетках A549

Поскольку МИА обычно используются для лечения немелкоклеточного рака легкого, влияние WX-132-18B на микротрубочки исследовали с использованием многопараметрической HCA цитоскелета в клетках A549. Как показано на рисунке 3А, в то время как таксол способствовал агрегации микротрубочек, клеточные микротрубочки были значительно разрушены и уменьшены после 24-часовой обработки WX-132-18B, колхицином и винкристином.Воздействие тестируемых препаратов на цитоскелет проиллюстрировано на тепловой карте (рис. 3B), показывающей кратность изменений параметров цитоскелета, включая F-актин, тубулин и ядро, после обработки различными концентрациями тестируемых соединений. WX-132-18B, колхицин и винкристин имеют сходные профили клеточного фенотипа, тогда как их эффекты на параметры, связанные с тубулином, отличаются от таксола. Кроме того, кривые концентрация-эффект, показанные на рисунке 3C, показывают, что WX-132-18B, колхицин и винкристин снижают тубулин I*A и 1/(форм-фактор) и увеличивают удлинение тубулина зависимым от концентрации образом.Тубулин I*A, 1/(фактор формы), удлинение указывает на среднее клеточное содержание тубулина, средний индекс округлости тубулина и среднее отношение короткой оси к длинной оси тубулина, соответственно (как показано в таблице 2). ). WX-132-18B был более мощным, чем известные МИА при низких концентрациях; EC ₅₀ WX-132-18B составляет 9,43, 2,99 и 3,12 нМ по этим трем различным параметрам, связанным с тубулином (таблица 3). Эти результаты показали, что, подобно деполимеризующим агентам колхицину и винкристину, WX-132-18B также снижал содержание тубулина и укорачивал или разрушал микротрубочки.Таксол, напротив, увеличивал содержание тубулина в зависимости от концентрации, но практически не влиял на 1/(форм-фактор) и параметры удлинения. Наблюдение за временным эффектом показало, что MIA и WX-132-18B продемонстрировали вмешательство в структуру микротрубочек через 6 часов; в то время как таксол способствовал агрегации микротрубочек, WX-132-18B, колхицин и винкристин усиливали деградацию микротрубочек (дополнительная фигура 1). Эти результаты показывают, что WX-132-18B является мощным агентом, деполимеризующим микротрубочки, а не агентом, стабилизирующим микротрубочки.

Рисунок 3: Влияние соединения WX-132-18B на клеточный скелет и ядро. (A) Репрезентативные изображения ядра, актина и тубулина клеток A549 после обработки носителем (0,1% диметилсульфоксид), колхицином (100 нМ), винкристином (100 нМ), таксолом (100 нМ) или WX-132 -18B (3 нМ) в течение 24 часов. Тубулин визуализировали с помощью антитела против α-тубулина (красный), актин визуализировали с помощью фаллоидина Alexa Flour 488 (зеленый), а ядро клетки визуализировали с помощью Hoechst 33342 (синий).Изображения были получены с помощью IN Cell Analyzer 1000 с использованием 20-кратного объектива. (B) Анализ тепловой карты тестируемых соединений в многопараметрическом анализе клеточной морфологии в клетках A549 с помощью анализа высокого содержания. (C) Кривые концентрация-воздействие тестируемых соединений на три различных параметра тубулина в клетках A549. Значения средние ± стандартное отклонение, n = 3.

Таблица 2: Мульти-параметрический сотовой фенотипический анализ панели

^{4
^{5 ⁴}
⁴
^{5 ⁴}
²
⁵}

площадь идентифицированного ядра

⁵⁴

Интенсивность

^{4 ^{5 ^{4
⁵}}}⁴

1 / (форм-фактор)

⁵

actin

^{4 интенсивность}

Общая площадь

^{4 ⁵}^{4 ⁵}

I * A

^{4 Среднее содержание актина в клетках}

Среднее соотношение короткой оси до длинной оси нити

²^{4 интенсивность}

⁴^{4 ⁵}

I * A

Удлинение

^{4 ^{4 1 / (форм-фактор)}}

^{4 NMP}

^{5 ^{4 ^{5 ⁴}
400115
⁴
Средняя интенсивность пикселей в клеточной области непосредственно примыкает к Toto-3}}^{4
^{4 Средняя интенсивность тото- 3 пикселя внутри ядра}}

Общая площадь MNSOD, приписываемой к ячейке

²⁴^{5 ^{5
Количество митохондрий, приписываемых к ячейке}}^{4 Интернет-интервал}⁴⁴

Расстояние до NUC

⁵⁴

^{5 ⁴}

⁵

²⁴^{4 ^{4 ⁵}}^{4 ⁴}⁴^{4
^{5 ^{4
Поздний апоптоз}}}

^{4 Интенсивность × Общая площадь}

Анализ цели	Параметры	Последствия
Assay1

^{5 ^{4 площадь}}
Среднее ядерная интенсивность


соотношение короткой оси до длинной оси ядра
средняя круглость я NDEX ядра, по периметру ² / (4π × зона)
Средняя интенсивность пикселей для нитей

Общая площадь нитей

^{5 ^{4 Удлинение}}
	⁵	⁵	⁵	⁵	Средняя круглость индекс актина, периметр ² / (4π × зона)
Tubulin	Средняя интенсивность пикселей для тубулина
	90 032 Общая площадь	Общая площадь Tubulin
Среднее содержание тубулина в клетках
⁵
Среднее соотношение Ось к длинной оси Tubulin

Средняя круглая индекс тубулина, периметр ² / (4π × ×
assay2

	(Nuc-Back Ground)Int	Интенсивность вычитания фоновой интенсивности из интенсивности ядра.
MnSOD	Граф	Количество MnSOD связывается с клеткой
	Разносом	меры взаимосвязанного MnSOD расстояния
	Расстояние до NUC	Среднее расстояние от центра тяжести MnSOD гравитации до ядра центра тяжести
^{5 ^{5 Общая площадь}}

	Интенсивность ⁵	Средняя интенсивность пикселей в MNSOD


	инте R-Mitochondria расстояние

⁵	Среднее расстояние от Mitochondria Centre of Gravity до ядра Центр гравитации
⁵	Общая площадь Общая площадь Митохондрия, приписываемая к ячейке

Средняя интенсивность пикселей в Mitochondria


Annexin V	Интенсивность × Всего Площадь

PI	Некроз

Выходные параметры и их последствия, полученные с рабочей станции IN Cell Analyzer Workstation 3. 5 и модуль Multi Target Analysis для скрининга высокого содержания (GE HealthCare, США). Ядерный анализ был включен в каждый анализ.

Таблица 3: EC ₅₀ Значения тестирования соединений на параметры тубулина в A549 клетки

EC ₅₀ (нм)

Интенсивность * Площадь

Удлинение

1 / (форм-фактор)

Taxol

75.84 ± 6,73

—

30,89

Колхицин

105,5

111,62

114,1

винкристин

293,2

352.03 ± 18.10

30,89

30. 89

WX-132-18B

^{4 9.43
9.43
^{5 3.12
2,99
Клетки обрабатывали различными соединениями в течение 24 часов. Значения средние ± стандартное отклонение, n = 3
WX-132-18B связывается с сайтом связывания колхицина на тубулине
Учитывая, что большинство деполимеризующих тубулин агентов связываются либо с сайтами связывания колхицина, либо с сайтами связывания винбластина [18], характеристики связывания WX-132-18B исследовали на этих двух участках тубулина с помощью анализов конкурентного связывания на молекулярном уровне. Повышенная собственная флуоресценция, вызываемая колхицином при его связывании с тубулином [19], использовалась в качестве индикатора конкуренции WX-132-18B с колхицином в анализе связывания тубулина.Как и ожидалось, винкристин, типичный препарат для сайта связывания винбластина, не влиял на интенсивность флуоресценции комплекса колхицин-тубулин (рис. 4А). Однако WX-132-18B снижал интенсивность флуоресценции в зависимости от концентрации со значением IC ₅₀, равным 0,47±0,10 мкМ.
Рисунок 4: Анализ сайта связывания соединения WX-132-18B на тубулине. (A) WX-132-18B конкурентно ингибировал связывание колхицина с тубулином. Степень ингибирования выражается в процентах (%) снижения флуоресценции комплекса колхицин-тубулин. (B) Влияние соединений на связывание комплекса BODIPY FL-винбластин-тубулин. Значения средние ± стандартное отклонение, n = 3. (C) Анализ ограниченного протеолиза. Тубулин расщепляли трипсином после предварительной инкубации с носителем (0,1% диметилсульфоксид), 10 мкМ колхицина, винкристина и WX-132-18B. Тубулин, обработанный WX-132-18B, показал характер протеолиза, сходный с таковым колхицина.
Аналогично, флуоресцентный аналог винбластина, BODIPY FL-винбластин, использовали в анализе сайта связывания винбластина.Как показано на рисунке 4B, интенсивность флуоресценции комплекса BODIPY FL-винбластин-тубулин снижалась дозозависимым образом под действием винкристина со значением IC ₅₀ 6,97 ± 1,61 мкМ, но не под действием колхицина или WX-132. -18Б. WX-132-18B лишь незначительно ингибировал интенсивность флуоресценции комплекса BODIPY FL-винбластин-тубулин при более высокой концентрации (30 мкМ). Кривая ингибирования WX-132-18B была аналогична кривой ингибирования колхицина, но отличалась от кривой ингибирования винкристина, что указывает на то, что WX-132-18B не действует на сайт связывания винбластина тубулина.
Колхицин и винкристин связываются с тубулином в разных местах, что может специфически воздействовать на ферментативные гидролизаты тубулина [20]. Для дальнейшего подтверждения характеристик связывания тубулина комплексов WX-132-18B, WX-132-18B-, колхицин- или винкристин-тубулин расщепляли с использованием трипсина, обработанного тозил-фенилаланином, хлорметил-кетоном (TPCK), и разделяли с помощью SDS-PAGE. электрофорез. На фигуре 4C показано, что спектр полосы электрофореза WX-132-18B аналогичен спектру колхицина и отличается от спектра винкристина.WX-132-18B и колхицин оба имеют усиленную полосу β-колхицина с более четкими полосами в области низкой молекулярной массы. Сообщалось, что полоса β-колхицина является продуктом расщепления, связанным с сайтом колхицина, продуцируемым трипсином [21, 22]. В комплексе винкристин-тубулин полоса β-колхицина отсутствует. Эти результаты показывают, что WX-132-18B связывается с сайтом связывания колхицина, а не с сайтом связывания винбластина тубулина.
WX-132-18B останавливает клеточный цикл в фазе G2/M в клетках A549. делящиеся опухолевые клетки [23].Как сообщалось, анализ проточной цитометрии (FCM) подтвердил, что таксол (100 нМ), колхицин (300 нМ) и винкристин (300 нМ) вызывали значительную остановку фазы G2/M (рис. 5). WX-132-18B также останавливал клеточный цикл в фазе G2/M в зависимости от концентрации. Эффективность, наблюдаемая с 3 нМ WX-132-18B, аналогична активности, наблюдаемой с 100 нМ таксола, 300 нМ колхицина и 300 нМ винкристина, а доля клеток, обработанных 3 нМ WX-132-18B в фазе G2/M составил 74,77±8,47%, тогда как в контрольной группе всего 8.68±2,30%. Эти данные ясно указывают на то, что WX-132-18B является мощным митотически блокирующим средством.
Рисунок 5: Влияние соединения WX-132-18B на клеточный цикл клеток A549. Клетки A549 обрабатывали носителем (0,1% диметилсульфоксид), колхицином (300 нМ), винкристином (300 нМ), таксолом (100 нМ) или WX-132-18B (3 нМ) в течение 24 ч, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. . Гистограмма показывает процент распределения клеточного цикла на основе результатов проточной цитометрии. Значения средние ± стандартное отклонение, n = 3. *Р<0,05, **Р<0.01, ***P<0,001 по сравнению с контрольной группой.
WX-132-18B индуцирует апоптоз в клетках A549
МИА могут индуцировать апоптоз в опухолевых клетках с помощью нескольких механизмов, таких как блокирование клеточного цикла [4], ингибирование фосфорилирования Bcl-2 и Bcl-xl [24], активируя каспазы [11], активируя E2F1 [25] и вызывая высвобождение цитохрома с [26]. Влияние WX-132-18B на клеточный апоптоз исследовали в клетках A549 с помощью FCM с методом двойного мечения Annexin V-FITC/PI [27].Как показано на рисунке 6, три известных MIA индуцировали явный клеточный апоптоз после 48-часовой обработки клеток A549. Точно так же WX-132-18B индуцировал апоптоз клеток A549 зависимым от концентрации образом. Эффект WX-132-18B в концентрации 3 нМ такой же, как и у препаратов положительного контроля, как показано на гистограмме на рисунке 6. Окрашивание коктейлем с использованием аннексина V/PI/Hoechst 33342 в сочетании с флуоресцентной визуализацией HCA показало аналогичные результаты. с FCM (дополнительный рисунок 2).
Рисунок 6: Влияние соединения WX-132-18B на апоптоз в клетках A549.Клетки A549 обрабатывали 300 нМ колхицином, 300 нМ винкристином, 100 нМ таксолом или 3 нМ WX-132-18B в течение 48 ч, а затем анализировали с помощью проточной цитометрии. Гистограмма показывает значительное увеличение скорости апоптоза клеток A549. Значения средние ± стандартное отклонение, n = 3. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001 по сравнению с контрольной группой.
Влияние WX-132-18B на цитотоксичность в клетках HepG2
Проницаемость ядерной мембраны (NMP), потенциал митохондриальной мембраны (MMP) и супероксиддисмутаза марганца (MnSOD) являются обычно используемыми индикаторами цитотоксичности [28]. Увеличение и уменьшение MnSOD происходит в ответ на окислительный стресс и повреждение окислительно-восстановительной системы соответственно. Эти параметры сравнивали между тремя известными MIA и WX-132-18B в клетках HepG2, клеточной линии, обычно используемой для скрининга гепатотоксичности. Как показано на рисунке 7, аналогично известным MIA, при уменьшении количества клеток и размера ядер в зависимости от концентрации основные параметры MnSOD и MMP показали зависимое от концентрации снижение, в то время как NMP увеличился после того, как клетки HepG2 были обработаны. обработан WX-132-18B в течение 24 часов.Цитотоксические профили 300 нМ колхицина, 100 нМ таксола, 300 нМ винкристина и 3 нМ WX-132-18B были сходными. Эффект WX-132-18B и колхицина на снижение MnSOD и MMP более сильный, чем эффект таксола или винкристина, а максимальный эффект WX-132-18B или колхицина на NMP намного ниже, чем наблюдаемый для таксола или винкристина. винкристин. Эти результаты показывают, что WX-132-18B имеет сходные гепатотоксические характеристики и механизм действия с известными МИА и больше всего напоминает колхицин.
Рисунок 7: Влияние соединения WX-132-18B на цитотоксичность в клетках HepG2. (A) Репрезентативные изображения NMP, MnSOD и MMP в клетках HepG2, обработанных носителем, колхицином (300 нМ), винкристином (нМ), таксолом (100 нМ) и WX-132-18B (3 нМ) в течение 24 ч . (B) Анализ тепловой карты тестируемых соединений на профилях цитотоксичности в клетках HepG2; гистограмма показывает изменения количества клеток параметров и (ядерного фона) интенсивности NMP, в частности. NMP, проницаемость ядерной мембраны; MnSOD – супероксиддисмутаза марганца; ММП, митохондриальный мембранный потенциал.См. Таблицу 2 для значений параметров.
Влияние WX-132-18B на клеточные сигнальные пути
Для исследования других потенциальных механизмов и исключения побочных эффектов WX-132-18B, 22 клеточных сигнальных пути (дополнительная таблица 1), которые прямо или косвенно связаны с появление и развитие опухоли дополнительно проверяли с помощью HCA с использованием репортерных клеточных линий пути. Четыре препарата были протестированы в концентрациях 0,03, 0,1, 0,3, 1 и 3 мкМ, что охватывает фармакодинамический и цитотоксический диапазон этих молекул.Результаты скрининга показывают, что, помимо незначительного индуцирования образования очагов Rad51 (индикатор повреждения ДНК) при более высоких концентрациях (дополнительная фигура 3), WX-132-18B и три других MIA (таксол, колхицин и винкристин) не проявляют значительных влияние на другие 21 экранированный сигнальный путь. Этот эффект повреждения ДНК, обнаруженный при анализе образования очагов Rad51, может указывать на токсичность МИА, поскольку концентрация, при которой он наблюдался, была намного выше, чем концентрация, ингибирующая микротрубочки, а наблюдаемый эффект намного ниже, чем эффект, наблюдаемый с камптотецином, лекарственным средством. используется в качестве положительного контроля для оценки этого пути.Таким образом, наш анализ панели путей дополнительно демонстрирует, что, как и известные MIA, WX-132-18B не влияет на другие проверенные сигнальные пути.
WX-132-18B сильно ингибировал рост опухоли
in vivo Поскольку WX-132-18B показал высокую и неселективную противоопухолевую активность in vitro , мы сначала оценили противоопухолевую активность in vivo WX-132-18B у мышей Куньмин (КМ) с ксенотрансплантатом S180. Причина, по которой мы выбрали S180, заключается в том, что мышиная модель ксенотрансплантата клеток саркомы S180 легко устанавливается и, следовательно, ее целесообразно использовать для первичной оценки противоопухолевого действия препарата.Принимая во внимание, что немелкоклеточный рак легкого является основным признаком MIA и что ксенотрансплантация клеток A549 невозможна у мышей, систематическая биоактивность была оценена на голых мышах h560 человека, несущих немелкоклеточный рак легкого. Кроме того, чтобы раскрыть лежащие в основе противоопухолевые механизмы WX-132-18B, также исследовали воздействие на голых мышей BGC-823, несущих рак желудка человека, с таксолом, наиболее сильнодействующим MIA, в качестве положительного контроля. Фигура 8 показывает, что ксенотрансплантатная опухоль S180 растет экспоненциально после трансплантации; Ксенотрансплантатные опухоли h560 и BGC-823 демонстрировали медленный рост в ранней фазе (с 0-го дня до 10-го дня), а затем опухоли сильно разрастались (с 10-го дня до конца эксперимента).Обработка WX-132-18B ингибировала рост опухолей ксенотрансплантата во всех трех моделях ксенотрансплантата дозозависимым образом. Во время лечения WX-132-18B не было обнаружено ни смертности, ни значительной потери массы тела, что указывает на то, что WX-132-18B хорошо переносится и безопасен в испытанных дозах. У мышей S180 с ксенотрансплантатом KM введение 1 мг/кг WX-132-18B приводило к 70,06% ( P <0,01) и 72,62% ( P <0,01) ингибированию объема и массы опухоли соответственно. Противоопухолевый эффект дозы 1 мг/кг WX-132-18B сравним с эффектом таксола 15 мг/кг у голых мышей Nu/Nu с ксенотрансплантатом h560 и ксенотрансплантатом BGC-823.В конце лечения степень ингибирования WX-132-18B в отношении объема и массы опухоли для опухоли h560 составила 68,70% ( P <0,01) и 61,90% ( P <0,01), а в группе BGC- 823 ксенотрансплантата опухоли они составляли 76,06% ( P <0,01) и 77,32% ( P <0,01) соответственно (Фигура 8А). Эти данные ясно указывают на то, что WX-132-18B обладает мощной противоопухолевой активностью in vivo .
Фигура 8: WX-132-18B ингибирует рост опухоли in vivo . (A) Эффекты ингибирования роста опухоли WX-132-18B у мышей с ксенотрансплантатом S180 KM, ксенотрансплантатом h560 и ксенотрансплантатом BGC-823 Nu/Nu голых мышей. Мышей лечили таксолом или различными дозами (0,25, 0,5 и 1,0 мг/кг) WX-132-18B в течение трех недель. Объемы опухолей измеряли до лечения и в указанные дни лечения. В конце эксперимента опухоли резецировали и взвешивали. Значения представляют собой средние ± стандартное отклонение объема или веса опухоли для всех тестируемых мышей в каждой группе. (B) Гистологическое исследование и иммуногистохимический анализ экспрессии и распределения CD31, каспазы 3 и Ki67 в ксенотрансплантатной опухоли BGC-823.Красная стрелка указывает на кровеносные сосуды. Масштабная линейка, 100 мкм.
Для дальнейшего раскрытия основных противоопухолевых механизмов WX-132-18B на образцах опухолей были проведены гистопатологические тесты и иммуноанализы маркеров клеточной пролиферации, апоптоза и ангиогенеза. Окрашивание гематоксилином и эозином (HE), выполненное на опухолевых тканях ксенотрансплантата BGC-823 (фиг. 8B), показало, что клеточные ядра в необработанной группе были увеличены и глубоко окрашены; однако после обработки WX-132-18B ядра сморщились, и структура стала неполной.Кроме того, экспрессию каспазы 3 (индикатор клеточного апоптоза), Ki67 (индикатор клеточной пролиферации) и CD31 (маркер ангиогенеза) в опухолевой ткани наблюдали с помощью иммуногистохимического анализа (ИГХ). Как показано на фигуре 8B, обработка WX-132-18B резко увеличивала окрашенную в коричневый цвет каспазу 3 и снижала экспрессию Ki67. CD31, специфически экспрессируемый в эндотелиальных клетках сосудов, также снижался с помощью WX-132-18B дозозависимым образом. Данные in vivo дополнительно показывают, что WX-132-18B ингибирует рост опухоли путем ингибирования клеточной пролиферации, индукции апоптоза, подавления ангиогенеза опухоли и разрушения кровеносных сосудов.
ОБСУЖДЕНИЕ
МИА обычно используются в качестве противоопухолевых средств. Высокая активность, антирезистентность к лекарствам и ингибирование опухолевого ангиогенеза находятся в центре внимания исследований, направленных на разработку новых МИА [14, 29]. WX-132-18B, новое структурное соединение, разработанное и синтезированное в нашем институте, показало широкий спектр антипролиферативной активности in vitro в отношении многих линий раковых клеток человека, включая опухолевые клетки, устойчивые к таксолу, за счет специфического связывания с колхицин- сайт связывания и зависящее от концентрации снижение содержания микротрубочек.Дальнейшее исследование показало, что WX-132-18B демонстрирует клеточные фенотипические профили, сходные с профилями классических МИА, включая остановку клеточного цикла в фазе G2/M, запуск апоптоза опухолевых клеток, стимулирование NMP и снижение MMP и MnSOD, без каких-либо эффектов. на 22 других сигнальных путях, связанных с опухолью, которые мы скринировали. Что еще более важно, фармакодинамика in vivo подтвердила, что WX-132-18B может независимо ингибировать саркому мышей, опухоли легкого человека и ксенотрансплантат рака желудка, а также опухолевые кровеносные сосуды у мышей.
Общепризнанно, что молекулы со сходными механизмами действия обычно проявляют сходную биологическую активность [30, 31]. Для определения механизма действия WX-132-18B в качестве эталонов были выбраны три имеющихся в продаже MIA с определенными и репрезентативными сайтами связывания, и было проведено сравнительных исследований in vitro из . MIA вмешиваются в динамический процесс микротрубочек, ингибируя деполимеризацию микротрубочек или препятствуя сборке тубулина посредством связывания с молекулой.Многопараметрический анализ клеточного скелета на основе изображений с высоким содержанием (HCI) прямо и количественно отражает влияние тестируемых препаратов на клеточный скелет, включая микротрубочки, микрофиламенты и ядра одновременно. Этот анализ ясно показал, что фенотипический профиль клеточного скелета, связанный с WX-132-18B, был аналогичен таковому, связанному с агентами, деполимеризующими микротрубочки, колхицину и винкристину, но отличался от такового, связанного с таксолом, агентом, полимеризующим микротрубочки, в тех же цитотоксических условиях. .Единственные параметры клеточного фенотипа, которые отличаются, связаны с микротрубочками. WX-132-18B индуцировал обломки микротрубочек и уменьшал содержание клеточных микротрубочек. Тесты конкурентного связывания тубулина и SDS-электрофорез продуктов ферментативного гидролиза тубулина дополнительно показали, что WX-132-18B избирательно связывается с колхициновым участком на тубулине. Это согласуется с результатами анализа ингибирования полимеризации тубулина [32]. WX-132-18B, таким образом, продемонстрировал, что он является деполимеризующим микротрубочки агентом, который связывается с колхициновым участком тубулина.[23]. Соединения также фосфорилировали Bcl-2 и Bcl-xL, активировали каспазы, способствовали высвобождению цитохрома с [24, 26] и индуцировали апоптоз [2, 23]. Таким образом, остановка фазы G2/M и индукция апоптоза были признаны основными клеточными эффектами MIA.В текущем исследовании количественный анализ FCM и HCA вместе показал, что WX-132-18 обладает теми же эффектами на остановку клеточного цикла и индукцию апоптоза, что и три известных MIA.
Оценка гепатоцеллюлярной токсичности играет важную роль в разработке лекарств и токсикологии [33, 34]. В некоторой степени цитотоксический профиль может предсказать механизм, лежащий в основе тестируемых молекул. NMP, MnSOD и MMP отражают функциональное состояние клеток в структуре ядерной мембраны, окислительно-восстановительных системах и митохондриях соответственно и обычно используются в качестве индикаторов цитотоксичности и механизма действия.В этом исследовании мы изучили и сравнили цитотоксические эффекты WX-132-18B и трех MIA в клетках HepG2 с помощью многопараметрического HCA NMP, MnSOD и MMP. WX-132-18B и три MIA увеличивали NMP и снижали MnSOD и MMP в зависимости от концентрации; они демонстрировали сходные профили гепатотоксического фенотипа при цитотоксической концентрации. WX-132-18B подобен колхицину и оказывает более сильное влияние на окислительно-восстановительную систему и функцию митохондрий, но более слабое влияние на увеличение NMP, чем таксол или винкристин. Это еще раз подтвердило характер механизма действия WX-132-18B. Экспрессия MnSOD активируется окислительными стрессами, включая увеличение количества активных форм кислорода (АФК), что в основном связано с повреждением митохондрий и ДНК [35]. Снижение содержания MnSOD после 24-часовой обработки WX-132-18B или MIA предполагает, что повреждение митохондрий может быть не начальной мишенью лекарств, а скорее сопутствующим событием цитотоксичности этих препаратов; начальное ингибирование микротрубочек практически не влияет на митохондрии, что позволяет предположить, что митохондриальная дисфункция не может быть основным путем индукции апоптоза MIA.Механизм, с помощью которого ингибиторы микротрубочек ингибируют экспрессию MnSOD, в настоящее время неясен и еще предстоит идентифицировать. Кроме того, действие тестируемых соединений на NMP было эффективным при более низких концентрациях, что указывает на то, что WX-132-18B и три MIA специфически изменяют клеточный NMP и что NMP тесно связан с функцией микротрубочек. Поскольку увеличение пор клеточного ядра позволяет большему количеству веществ, вызывающих клеточный апоптоз, проникать в ядро [36], это может быть дополнительным механизмом, с помощью которого WX-132-18B и три MIA способствуют клеточному апоптозу.Таким образом, дисбаланс гомеостаза окислительно-восстановительной системы и увеличение NMP составляют основную причину цитотоксичности WX-132-18B и MIA.
Кроме того, для скрининга возможного воздействия WX-132 использовали 22 линии репортерных клеток с флуоресцентной меткой, прямо или косвенно связанные с путями или мишенями опухолей, включая AKT, PI3K, Raf, p38 MAPK, p53 и Rad51. -18B по другим потенциальным целям (дополнительная таблица 1). WX-132-18B продемонстрировал результаты, соответствующие трем MIA в этом анализе.Они лишь незначительно индуцировали образование очагов Rad51 в клетках U2OS при более чем 30–100-кратных концентрациях и не влияли на другие 21 мишень или пути. Очаги Rad51 являются индикатором повреждения клеточной ДНК [37]. Хотя при более высоких концентрациях WX-132-18B и MIA слегка повреждали ДНК, их максимальный эффект составлял лишь 25% от эффекта, вызываемого камптотецином, специфическим ингибитором топоизомеразы I типа [38]. Эти результаты показывают, что повреждение ДНК является неспецифическим токсическим эффектом этих соединений и может быть результатом увеличения NMP и апоптоза.Эти данные дополнительно демонстрируют, что WX-132-18B обладает относительно хорошей селективностью по мишеням.
Высокая активность, антирезистентность к лекарственным препаратам и ингибирование опухолевого ангиогенеза являются тремя основными целями разработки новых МИА. В отличие от трех протестированных MIA, WX-132-18B продемонстрировал антипролиферативную активность широкого спектра в восьми различных типах клеточных линий человека, включая шесть опухолевых клеток, одну резистентную к таксолу клетку опухоли молочной железы и HUVEC, с IC ₅₀. значения в диапазоне от 0,45 до 0,99 нМ (намного ниже, чем у таксола, колхицина и винкристина). Что наиболее важно, исследование in vivo фармакодинамики показало, что WX-132-18B дозозависимо ингибирует рост ксенотрансплантатных опухолей у мышей KM с саркомой S180 и немелкоклеточным раком легкого человека h560 и голых мышей с раком желудка человека BGC-823. , не влияя на массу тела во время лечения. В соответствии с результатом in vitro анализ ИГХ опухолей BGC-823 показал, что количество опухолевых сосудов резко уменьшилось, а количество апоптотических клеток резко увеличилось.WX-132-18B оказывает определенное влияние на рак и ангиогенез опухоли, хотя его антилекарственная устойчивость in vivo все еще требует дальнейшего изучения.
Таким образом, исследование связывания тубулина и клеточных фенотипических профилей цитоскелета, цитотоксичности и сигнальных путей показало, что WX-132-18B является новым деполимеризующим микротрубочки агентом, который избирательно связывается с колхицин-связывающим участком тубулина. Его мощная противоопухолевая активность, высокая селективность, ингибирование сосудов опухоли и потенциальная антирезистентность делают WX-132-18B многообещающим противоопухолевым лекарством-кандидатом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы
Соединение WX-132-18B (чистота ≥98%) разработано и синтезировано в нашем институте; структура подтверждена с помощью ядерного магнитного резонанса/масс-спектрометрии (ЯМР/МС), а чистота определена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) [32]. Колхицин, винкристин и таксол были приобретены у Merck (Дармштадт, Германия). Все соединения растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) до концентрации 10 мМ и хранили при -20°С.
Обработанные TPCK трипсин и бычий сывороточный альбумин были получены от Sigma-Aldrich (Миссури, США). Hoechst 33342, MitoTracker Red CMXRos, йодид TOTO-3, фаллоидин Alexa Flour 488; ослиные антимышиные вторичные антитела Alexa Fluor 488 и Alexa Fluor 546; мышиные антитела против MnSOD и α-тубулина были получены от Life Technologies (Калифорния, США). Кроличьи антитела против Ki67, каспазы 3 и CD31, козьи антикроличьи вторичные антитела, меченные пероксидазой хрена, наборы субстратов диаминобензидина (DAB) и набор для окрашивания HE были приобретены у Wuhan Boster Biological Technology, Ltd (Ухань, Китай). Набор Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit был приобретен у Invitrogen (Орегон, США).
Линии клеток
Линии клеток, использованные для скрининга сигнальных путей (дополнительная таблица 1), были приобретены у GE Health Care (Массачусетс, США) и Thermo Scientific (Нью-Гемпшир, США) и культивированы в соответствии с инструкциями к продукту. HepG2, HeLa, A549, h560, BGC-823, MX-1, MX-1/T и HUVEC были приобретены в Основном медицинском центре Института фундаментальных медицинских наук Китайской академии медицинских наук и культивированы в RPMI- 1640 при 37°С во влажном инкубаторе с 5% СО ₂, за исключением клеток А549, которые культивировали в среде Хэма F12.Все среды снабжались 10% фетальной телячьей сывороткой, а для клеточной линии МХ-1/Т добавляли 10 нМ таксола.
Анализ жизнеспособности клеток
Анализ SRB использовали для оценки антипролиферативной активности тестируемых соединений [39]. Вкратце, клетки (от 2,5 до 8,0 × 10 ³ клеток/лунку, в зависимости от типа клеток) высевали в 96-луночный планшет и культивировали в течение ночи перед воздействием тестируемых соединений. После 72 ч обработки соединением клетки фиксировали трихлоруксусной кислотой (ТХУ, 10%) при 4°С в течение 1 ч, пять раз промывали бидистиллированной водой и сушили при 25°С (обычно определяемой как комнатная температура, КТ). ) последовательно.Затем клетки окрашивали SRB (0,4% в 1% уксусной кислоте) при комнатной температуре в течение 30 мин, пять раз промывали 1% уксусной кислотой и последовательно сушили при комнатной температуре; Затем добавляли 10 мМ раствор трис-основания и измеряли оптическую плотность при 510 нм. В каждую лунку планшета включали контрольную группу с носителем и положительную контрольную группу с лекарственным средством. Каждая тестируемая концентрация включала не менее трех повторных лунок. Данные обрабатывали, как описано [40]. Антипролиферативную активность выражали в виде степени ингибирования.Степень ингибирования (%) = (A _{, контроль 72h} — A _{, соединение 72h}) / (A _{, контроль 72h} — A _{, контроль 0h}) * 100, где A представляет собой поглощение при 510 нм.
Анализ методом проточной цитометрии
Для выявления клеточного апоптоза, индуцированного тестируемыми соединениями, использовали набор Alexa Fluor 488 Annexin V/Dead Cell Apoptosis Kit. Клетки A549, высеянные в шестилуночный планшет с плотностью 8 × 10 ⁴ клеток/мл, культивировали в течение ночи, а затем обрабатывали тестируемыми соединениями в течение 24 ч перед сбором путем центрифугирования.Клетки окрашивали аннексином V и PI в соответствии с инструкциями производителя и измеряли с помощью цитометра FACSCalibur (BD Biosciences, Калифорния, США). Клетки классифицировали как «выжившие», «ранний апоптоз», «поздний апоптоз» и «некроз» в зависимости от степени окрашивания аннексином V и/или PI.
Для анализа клеточного цикла собранные клетки фиксировали в 70% этаноле в фосфатно-солевом буфере (PBS) в течение ночи при 4°C и последовательно обрабатывали 0,05 мг/мл РНКазы и 3 мкМ PI перед обнаружением клеточного цикла.Клеточный цикл был разделен на фазы G0/G1, S и G2/M в зависимости от степени окрашивания ДНК.
Многопараметрический анализ HCA
Многопараметрический анализ HCA проводили, как описано ранее [41]. Для многопараметрического анализа цитоскелета клетки А549, высеянные с плотностью 8 × 10 ³ клеток/лунку в 96-луночный черный планшет (Costar 3603, США), культивировали в течение ночи, а затем обрабатывали тестируемыми соединениями в течение 24 часов. Затем клетки фиксировали и клеточные ядра, актин и микротрубочки окрашивали Hoechst 33342, фаллоидином Alexa Flour 488 и антителом к α-тубулину; затем клетки инкубировали с меченым Alexa Flour 546 вторичным антителом.Время инкубации проводили в соответствии с инструкциями производителя.
Для обнаружения апоптоза клетки HepG2, культивированные в 96-луночном черном планшете, обрабатывали в течение 24 часов. Клетки дважды промывали буфером для связывания аннексина V (140 М NaCl, 10 мМ HEPES, 2,5 мМ CaCl ₂, pH 7,4) и метили аннексином V-Alexa и 3 мкМ PI в течение 15 мин. Затем клетки окрашивали 1 мкМ Hoechst 33342 в PBS в течение 1 часа.
Для многопараметрического анализа цитотоксичности клетки HepG2, выращенные в 96-луночном черном планшете, инкубировали с соединениями в течение 24 часов.К клеткам добавляли MitoTracker Red CMXRos, Hoechst 33342 и TOTO-3 Iodide перед тем, как клетки фиксировали для идентификации MMP, ядер и NMP соответственно. Затем клеточный MnSOD определяли первичным антителом и вторичным антителом, меченным Alexa Fluor 488.
Для скрининга клеточного сигнального пути использовали клетки, стабильно экспрессирующие белок, связанный с этим путем, слитый с белком усиленной зеленой флуоресценции (EGFP) (дополнительная таблица 1). Когда сигнальный путь затрагивается в ответ на действие тестируемого соединения, изменение сигнального белка может быть обнаружено по уровню его экспрессии, площади точек или транслокации из цитозоля в ядро или мембрану и наоборот.Затем эти изменения могут быть подвергнуты количественному анализу. В этом исследовании соединения подвергались скринингу двумя способами: режим агониста, при котором добавляется только соединение; и режим антагониста, при котором соединение добавляют одновременно с агонистом. Репортерные клетки высевали в 96-луночные черные планшеты с соответствующей плотностью и культивировали в течение ночи; затем культуральную среду заменяли соответствующим буфером для анализа. Продолжительность лечения и концентрация положительных препаратов, используемых на различных клеточных линиях, соответствовали инструкциям производителя (дополнительная таблица 1).Клетки фиксировали и окрашивали 1 мкМ Hoechst 33342 в PBS в течение 2 ч после обработки.
Наконец, окрашивающий раствор удаляли, клетки сохраняли в PBS, а изображения для анализов получали в IN Cell Analyzer 2000 (GE HealthCare, США) под объективом 20×. Для всех измерений устанавливали фильтры по длине волны флуоресцентных красителей и получали девять полей из каждой лунки и не менее 200 клеток. Полученные изображения анализировали с помощью рабочей станции IN Cell Analyzer Workstation 3.5 и Multi Target Analysis Module (GE Health Care, США). Окончательные измерения усредняли по популяции клеток, обнаруженных в полях зрения. Выходные параметры и их последствия показаны в таблице 2. Другие условия обнаружения и анализа такие же, как описано в нашей предыдущей статье [41]. Во всех экспериментах среда для культивирования клеток, содержащая 0,2% ДМСО, была обозначена как пустой контроль и была включена в каждый планшет для обеспечения нормализации данных и контроля качества планшета.Каждое испытание проводили в трехкратной повторности.
Конкурентный анализ связывания тубулина
Для оценки участка связывания колхицина на тубулине 4 мкМ тубулина, полученного из свежей ткани мозга собаки [42, 43], добавляли к буферу PEM (25 мМ PIPES, 1 мМ EGTA, 3 мМ MgCl ₂ , pH 6,8) и инкубировали с различными концентрациями (0,1, 0,3, 1, 2, 3 и 10 мкМ) WX-132-18B или винкристина или без них при 37°C в течение 45 мин в непрозрачной черной 96-луночный планшет. Затем к смеси добавляли 10 мкМ колхицина и инкубировали при 37°С в течение 45 мин.Измеряли интенсивность флуоресценции реакционной системы (напр. 340 нм, эм. 435 нм). Степень ингибирования выражали как процент (%) снижения флуоресценции тубулин-колхицинового комплекса и рассчитывали по следующей формуле: степень ингибирования % (IR) = (I _p — I _c ) / (I _p — I _n ) * 100%, где I — интенсивность флуоресценции, «p» и «n» обозначают положительный контроль (10 мкМ колхицина) и отрицательный контроль (пустой контрольный раствор без колхицина) соответственно.»c» представляет собой раствор испытуемого соединения с тубулином. Винкристин, который не может связываться с колхициновым участком тубулина, добавляли в качестве отрицательного контроля.
Для оценки участка связывания винбластина на тубулине тубулин (4 мкМ) в буфере PEM смешивали с WX-132-18B, колхицином и винкристином в концентрациях 0,01, 0,1, 1, 3, 10, 30 и 100 мкМ и инкубировали при 37°С в течение 45 мин. Затем добавляли BODIPY FL-винбластин (2 мкМ) и смеси инкубировали в течение 45 мин. Интенсивность флуоресценции комплекса FL-винбластин-тубулин (напр. 470 нм, эм. 515 нм). Снижение интенсивности флуоресценции комплекса тубулин-BODIPY FL-винбластин измеряли и переводили в показатели ингибирования. Степень ингибирования % (IR) = (I _p — I _c )/(I _p — I _n ) * 100%, где «p» и «n» обозначают положительный контроль (2 мкМ FL- винбластин) и отрицательный контроль (холостой контрольный раствор без тубулина) соответственно.
Анализ ограниченного протеолиза
Тубулин (конечная концентрация 1 мг/мл) смешивали с буфером PEM, как указано выше, а также с 10 мкМ колхицина, 10 мкМ винкристина или 10 мкМ WX-132-18B и инкубировали при 30°С. С в течение 30 мин.Затем добавляли трипсин, обработанный TPCK (1:40, вес/вес к тубулину), и реакционную систему инкубировали на льду в темноте в течение 20 минут. Образцы смешивали с 4-кратным загрузочным буфером SDS и кипятили в течение 5 минут перед разделением с помощью 10% геля SDS-PAGE. Гель окрашивали кумасси бриллиантовым синим, и изображение получали с использованием системы визуализации геля Chemi Imager 5500 (Alpha Innotech, Калифорния, США).
Исследование противоопухолевой эффективности in vivo Приблизительно 6 × 10 ⁶ Клетки S180 вводили подкожно в правую подмышечную Медицинские науки, Пекин, Китай).Через 7-10 дней после имплантации опухолевых клеток всех мышей случайным образом разделили на группы лечения и контрольную группу (n=10) и обработали WX-132-18B (1,0 мг/кг, 0,5 мг/кг или 0,25 мг/кг). ) или носитель (физиологический раствор) путем внутрибрюшинной (ip) инъекции два раза в неделю в течение трех недель.
Приблизительно 6 × 10 ⁶ клеток h560 или клеток BGC-823 вводили подкожно в правую подмышечную впадину восьминедельным бестимусным мышам (получены от Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., ООО). Когда опухоль вырастала до 2-3 см в диаметре, опухолевые блоки удаляли, делили на крошечные блоки размером около 2,5 мм ³ и трансплантировали подкожно мышам в стерильных условиях. Через 7-10 дней после имплантации все мыши были случайным образом разделены на контрольную группу, группу обработки таксолом (15 мг/кг) и группу лечения WX-132-18B (1,0 мг/кг, 0,5 мг/кг или 0,25 мг/кг) (n =8). Лекарства вводили один раз каждые пять дней голым мышам с трансплантацией h560 и два раза в неделю голым мышам с трансплантацией BGC-823 через i.п. инъекции в течение трех недель.
Рост опухоли во время лечения измеряли штангенциркулем, а объемы оценивали по следующей формуле: объем опухоли (мм ³ ) = л × Вт ² × 0,5, где л длина и Вт ширина. После того, как все эксперименты были завершены, мышей умерщвляли и измеряли массу опухоли. Все эксперименты на животных проводились строго в соответствии с рекомендациями Комитета по этике экспериментов на животных Пекинского института фармакологии и токсикологии в отношении ухода за животными, обращения с ними и прекращения их содержания.
Гистологический анализ
В конце периода лечения у мышей вырезали опухолевые ткани, фиксировали в 4% параформальдегиде, заливали в парафин и готовили срезы ткани (4 мм) [44]. Затем нарезали срезы толщиной 4 мкм и окрашивали CD31, каспазой 3 или Ki 67. Реакцию иммуногистохимии проводили с помощью набора субстратов DAB перед контрастным окрашиванием слайдов гематоксилином и эозином (H&E).
Обработка данных и статистический анализ
Анализ данных для всех HCA был проведен, как сообщалось ранее [41].Все данные из экспериментов in vitro были выражены как среднее значение ± SD для трех независимых экспериментов. Значения IC ₅₀ были рассчитаны с помощью программного обеспечения Origin 6.1. Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA) с использованием программного обеспечения SPSS 11.5 (* P <0,05, ** P <0,01, *** P <0,001).
Сокращения MIA, агент, ингибирующий микротрубочки; HCA, анализ высокого содержания; SRB, сульфородамин B; HUVEC, эндотелиальные клетки пупочной вены человека; TPCK, тозилфенилаланинхлорметилкетон; FCM, проточная цитометрия; I, интенсивность флуоресценции; А — область флуоресцентных точек; ММП, митохондриальный мембранный потенциал; MnSOD – супероксиддисмутаза марганца; NMP, проницаемость ядерной мембраны; КМ, Куньмин; HE, гематоксилин и эозин; ИГХ, иммуногистохимия; HCI, изображение с высоким содержанием; АФК, активные формы кислорода; ЯМР, ядерный магнитный резонанс; МС, масс-спектрометрия; ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография; ДАБ, диаминобензидин; ТХУ, трихлоруксусная кислота; КТ, комнатная температура; PBS, фосфатно-солевой буфер; EGFP, белок с усиленной зеленой флуоресценцией; ТРУБЫ, Пиперазин-1,4-бисэтансульфокислота; EGTA, этиленбис(оксиэтиленнитрило)тетрауксусная кислота; HEPES, 4-(2-гидроксиэргил)пиперазин-1-эрансульфоновая кислота; ДМСО, диметилсульфоксид; ИК, скорость ингибирования; я. п., внутрибрюшинно.
Вклад авторов Фан Гуань и Лили Ван задумали и разработали исследование. Фан Гуань, Ци Чжан, Жуй Дин, Лонг Лонг, Вэй Ли, Фейфей Ли, Линна Ли и Дексуань Ян провели эксперименты. Фан Гуан, Руй Дин, Вэй Чен, Лили Ван проанализировали данные и написали статью. Lili Wang, Wei Chen, Feifei Li и Shoujun Yuan просмотрели и отредактировали рукопись. Лан Се предоставил тестовый состав. Все авторы прочитали и одобрили рукопись.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
ФИНАНСИРОВАНИЕ
Работа выполнена при поддержке Национального крупного проекта по науке и технике Министерства науки и технологий Китая (грант № 2012ZX09301-001, 2012ZX09301003) и Национального фонда естественных наук Китая (грант № 81430090) .
ССЫЛКИ
1. Giannakakou P, Sackett D, Fojo T. Тубулин/микротрубочки: все еще перспективная мишень для новых химиотерапевтических агентов.J Natl Cancer Inst. 2000 г. ; 92: 182-183.
2. Джордан М.А., Уилсон Л. Микротрубочки как мишень для противоопухолевых препаратов. Нат Рев Рак. 2004 г.; 4: 253-265.
3. Райзер А.Л., Джайлз Ф.Дж., Муберри С.Л. Динамика микротрубочек как мишень в онкологии. Лечение рака, версия 2009 г.; 35: 255-261.
4. Джордан М.А., Уилсон Л. Микротрубочки как мишень для противоопухолевых препаратов. Нат Рев Рак. 2004 г.; 4: 253-265.
5. Дюмонте С., Джордан М.А. Агенты, связывающие микротрубочки: динамичная область терапии рака.Nat Rev Drug Discov. 2010 г.; 9: 790-803.
6. Чен Л.С., Шумахер Х.Р. Подагра: обзор, основанный на доказательствах. Дж. Клин Ревматол. 2008 г.; 14: С55-62.
7. Оноре С., Камат К., Брагер Д., Хорвиц С.Б., Уилсон Л., Бриан С., Джордан М.А. Синергическое подавление динамики микротрубочек дискодермолидом и паклитакселом в клетках немелкоклеточной карциномы легкого. Рак Рез. 2004 г.; 64: 4957-4964.
8. Дюмонте С., Джордан М.А. Агенты, связывающие микротрубочки: динамичная область терапии рака. Nat Rev Drug Discov. 2010 г.; 9: 790-803.
9. Kampan NC, Madondo MT, McNally OM, Quinn M, Plebanski M. Паклитаксел и его развивающаяся роль в лечении рака яичников. Биомед Рез Инт. 2015 г.; 2015: 413076.
10. Canta A, Chiorazzi A, Cavaletti G. Тубулин: мишень для противоопухолевых препаратов в раковых клетках, а также в периферической нервной системе. Курр Мед Хим. 2009 г.; 16: 1315-1324.
11. Редди М.В., Акула Б., Козенца С.К., Ли К.М., Маллиреддигари М.Р., Паллела В.Р., Суббайя Д.Р., Удофа А., Редди Э.П.(Z)-1-арил-3-ариламино-2-пропен-1-оны, высокоактивные стимуляторы полимеризации тубулина: синтез, взаимосвязь структура-активность (SAR), полимеризация тубулина и исследования ингибирования клеточного роста. J Med Chem. 2012 г.; 55: 5174-5187.
12. Fortin S, Wei L, Moreau E, Lacroix J, Cote MF, Petitclerc E, Kotra LP, C-Gaudreault R. Дизайн, синтез, биологическая оценка и взаимосвязь между структурой и активностью замещенного фенила 4-(2- оксоимидазолидин-1-ил)бензолсульфонаты в качестве новых ингибиторов тубулина, имитирующих комбретастатин А-4. J Med Chem. 2011 г.; 54: 4559-4580.
13. Chaplin DJ, Hill SA, Pettit GR. Доклиническая оценка комбретастатина А4 фосфата: препарат, избирательно повреждающий новообразование сосудов опухоли. Энн Онкол. 1998 год; 9: 77-77.
14. Симан Д.В. Уникальные характеристики сосудистой сети опухоли и доклинические данные о ее избирательном разрушении агентами, разрушающими опухолевые сосуды. Лечение рака, ред. 2011 г.; 37: 63-74.
15. Нильсен Т., Бенцен Л., Педерсен М., Трамм Т., Райкен П.Ф., Буссинк Дж., Хорсман М.Р., Остергаард Л.Фосфат комбретастатина А-4 влияет на объем и распределение размеров сосудов опухоли, что оценивается с помощью визуализации размера сосудов на основе МРТ. Клин Рак Рез. 2012 г.; 18: 6469-6477.
16. Клют К., Накос Э., Тасаки С., Нгуен Д.П., Бандер Н.Х., Тагава С.Т. Конъюгаты антитело-лекарственное средство на основе ингибитора микротрубочек для лечения рака. Onco нацеливается на Ther. 2014; 7: 2227-2236.
17. Сиверс Э.Л., Сентер П.Д. Конъюгаты антитело-лекарственное средство в терапии рака. Анну Рев Мед. 2013; 64: 15-29.
18. Джордан М.А.Механизм действия противоопухолевых препаратов, взаимодействующих с микротрубочками и тубулином. Противораковые агенты Curr Med Chem. 2002 г.; 2: 1-17.
19. Bhattacharyya B, Wolff J. Стимуляция флуоресценции при связывании колхицина с тубулином. Proc Natl Acad Sci U S A. 1974; 71: 2627-2631.
20. Лу И, Чен Дж, Сяо М, Ли В, Миллер ДД. Обзор ингибиторов тубулина, взаимодействующих с сайтом связывания колхицина. Фарм Рез. 2012 г.; 29: 2943-2971.
21. Сакетт Д.Л., Варма Дж.К. Молекулярный механизм действия колхицина: индуцированное локальное разворачивание бета-тубулина.Биохимия. 1993 год; 32: 13560-13565.
22. Сакетт Д.Л. Агенты сайта барвинка индуцируют структурные изменения в тубулине, отличные от изменений, индуцированных агентами сайта колхицина, и антагонистические по отношению к ним. Биохимия. 1995 год; 34: 7010-7019.
23. Мусаккио А, Лосось ЭД. Контрольная точка шпиндельного узла в пространстве и времени. Nat Rev Mol Cell Biol. 2007 г.; 8: 379-393.
24. Kondoh M, Usui T, Nishikiori T, Mayumi T, Osada H. Индукция апоптоза путем разборки микротрубочек с помощью противоопухолевого соединения пиронетина.Биохим Дж. 1999; 340 (часть 2): 411-416.
25. Drago-Ferrante R, Santulli A, Di Fiore R, Giuliano M, Calvaruso G, Tesoriere G, Vento R. Низкие дозы паклитаксела сильно индуцируют апоптоз в клетках Y79 ретинобластомы человека за счет повышающей регуляции E2F1. Int J Oncol. 2008 г.; 33: 677-687.
26. Вайнер Дж.Л., Бюлер А.В., Уотли В.Дж., Харрис Р.А., Данвидди Т.В. Колхицин является конкурентным антагонистом рекомбинантных рецепторов гамма-аминомасляной кислоты А человека. J Pharmacol Exp Ther. 1998 год; 284: 95-102.
27.Sgonc R, Gruber J. Обнаружение апоптоза: обзор. Опыт Геронтол. 1998 год; 33: 525-533.
28. Рауш О. Скрининг высокого содержания клеток. Curr Opin Chem Biol. 2006 г.; 10: 316-320.
29. Чен С.М., Мэн Л.Х., Дин Дж. Новые противораковые агенты, ингибирующие микротрубочки. Мнение эксперта по расследованию наркотиков. 2010 г.; 19: 329-343.
30. Bollag DM, McQueney PA, Zhu J, Hensens O, Koupal L, Liesch J, Goetz M, Lazarides E, Woods CM. Эпотилоны, новый класс агентов, стабилизирующих микротрубочки, с таксолоподобным механизмом действия.Рак Рез. 1995 год; 55: 2325-2333.
31. Дженкинс Дж.Л. Открытие лекарств: переосмысление клеточной реакции на лекарства. Nat Chem Biol. 2013; 9: 669-670.
32. Wang XF, Guan F, Ohkoshi E, Guo W, Wang L, Zhu DQ, Wang SB, Wang LT, Hamel E, Yang D, Li L, Qian K, Morris-Natschke SL, et al. Оптимизация 4-(N-циклоамино)фенилхиназолинов как нового класса ингибиторов полимеризации тубулина, нацеленных на сайт колхицина. J Med Chem. 2014; 57: 1390-1402.
33. Гарсайд Х., Марко К.Ф., Чеснат-Спилман Дж., Фостер А.Дж., Мутас Д., Кенна Дж.Г., Уорриор У., Боуз Дж., Баумгартнер Дж.Оценка использования параметров визуализации для обнаружения гепатотоксичности, вызванной соединением, в 384-луночных культурах клеток HepG2 и криоконсервированных первичных гепатоцитах человека. Токсикол In Vitro . 2014; 28: 171-181.
34. Fojo AT, Adelberg DE. (2010). Агенты, нацеленные на микротрубочки. В: Figg WD, Chau CH и Small EJ, ред. Медикаментозное лечение рака предстательной железы. (Нью-Йорк: Springer New York), стр. 179–194.
35. Кандас Д., Ли Дж.Дж. MnSOD в регуляции потенциала реакции на окислительный стресс посредством притока митохондриальных белков.Антиоксидный окислительно-восстановительный сигнал. 2014; 20: 1599-1617.
36. Wu J, Jiang H, Luo S, Zhang M, Zhang Y, Sun F, Huang S, Li H. Опосредованное каспазой расщепление белка C53/LZAP вызывает аномальное связывание микротрубочек и разрыв ядерной оболочки. Сотовый рез. 2013; 23: 691-704.
37. Шинохара А., Огава Х., Огава Т. Белок Rad51, участвующий в репарации и рекомбинации у S. cerevisiae, представляет собой RecA-подобный белок. Клетка. 1992 год; 69: 457-470.
38. Эфферт Т., Фу Ю.Дж., Зу Ю.Г., Шварц Г., Конкималла В.С., Винк М.Молекулярно-целевая терапия опухолей натуральными продуктами традиционной китайской медицины. Курр Мед Хим. 2007 г.; 14: 2024-2032 гг.
39. Скехан П., Сторенг Р., Скудиеро Д., Монкс А., МакМахон Дж., Вистика Д., Уоррен Дж. Т., Бокеш Х., Кенни С., Бойд М. Р. Новый колориметрический анализ цитотоксичности для скрининга противоопухолевых препаратов. J Natl Cancer Inst. 1990 г.; 82: 1107-1112.
40. Vichai V, Kirtikara K. Колориметрический анализ сульфородамина B для скрининга цитотоксичности. Нат Проток. 2006 г.; 1: 1112-1116.
41. Лонг Л., Ли В., Чен В., Ли Ф.Ф., Ли Х., Ван Л.Л. Динамические цитотоксические профили сернистого иприта в клетках кожи человека, определенные многопараметрическим анализом высокого содержания. Токсикологическое исследование. 2016; 5: 583-593.
42. Bush TL, Payton M, Heller S, Chung G, Hanestad K, Rottman JB, Loberg R, Friberg G, Kendall RL, Saffran D, Radinsky R. AMG 900, низкомолекулярный ингибитор киназ aurora, потенцирует активность агентов, нацеленных на микротрубочки, в моделях метастатического рака молочной железы человека.}}