Погрузчики максимал: Погрузчики Maximal — цена 1088523 руб., купить в Москве и по всей России

Maximal ————————- Новостное письмо фев., 2017-Новости компании-Вилочные погрузчики Maximal | Китайский производитель вилочных погрузчиков, поставщик

В рамках стратегии развития «Делая оптимален для традиционных вилочных погрузчиков, особенно хорош для специальных вилочных погрузчиков », — разработка нового продукта вилочного погрузчика с боковой загрузкой, отвечающего требованиям рынка, который будет официально запущен примерно в апреле 2017 года.

Вилочный погрузчик с боковой загрузкой с уникальным характеристики — не нужно поворачивать первую операцию позже, имеет значительные преимущества при обработке длинномерных грузов, широко используемых в узко-канальный склад.

Первый прототип оснащен двигателем Deutz (EU Ⅳ). Maximal будет и дальше разрабатывать модели сжиженного нефтяного газа и электрические модели с различными моделями мачты и грузоподъемностью, чтобы удовлетворить потребности клиентов во всем мире.

За подробностями обращайтесь к продавцу.

Maximal Parts Business

Очевидно, что спрос на запасные части растет вместе с ростом продаж вилочных погрузчиков, Maximal рассматривает продажу запчастей как важную часть торгового бизнеса.В начале 2017 года компания Maximal поставила более 1000 наименований запасных частей в количестве более 10 000 единиц в качестве нашего резервного запаса для удовлетворения потребностей отечественных и зарубежных клиентов. Кроме того, Maximal расширит продажи запчастей для вилочных погрузчиков других марок. Maximal нацелен на улучшение обслуживания запчастей и сокращение сроков доставки.

Если у вас есть какие-либо потребности в запчастях для вилочных погрузчиков, свяжитесь со своим специалистом по запчастям или по адресу [email protected], мы ответим вам в первый раз.

Информация о складских вилочных погрузчиках

Ниже приведены максимальные складские вилочные погрузчики до 20 февраля.для справки.

(Примечание: приведенная ниже информация о складских вилочных погрузчиках обновляется ежемесячно, в то время как информация об аистах меняется время от времени, поэтому продавцы могут получать информацию о запасах в реальном времени.)

Экспортный заказ китайского вилочного погрузчика Справочная статистика

(январь 2017 г.)

Примечание:

Если вам нужны данные для заказа в другой стране, пожалуйста, свяжитесь с нами.

Центр новостей Maximal Forklift

Для отдела продаж

[email protected]

Для запасных частей

[email protected]

Факс: 0086-571-28001569

Телефон для Америки ： 0086-571 -28815951 Европа ： 0086-571-28205156

Азия 0086-571-28935028 Африка ： 0086-571-28205157

MAX420 | Вестендорф

Подробнее о продукте

16 БОЛЬШИХ ПРЕИМУЩЕСТВ

Других парней просто нет!

1) НАКОНЕЦ, загрузчик, который подходит как надо!

Westendorf имеет новый гладкий дизайн погрузчика, который создан не только для внешнего вида.Дело не в том, что мы тратим все это время на то, чтобы погрузчик выглядел хорошо. Дело в том, что когда что-то работает так хорошо, хорошо выглядеть естественно. Форма соответствует функции благодаря гладким и прочным рычагам, скрывающим все гидравлические линии. Обтекаемый профиль обеспечивает беспрепятственный обзор, а рельефная куртка стильно защищает линии.

2) Меняем навесное оборудование с сиденья трактора!

С соединителем дистанционного управления вы улыбнетесь и похлопаете себя по плечу за разумную и выгодную покупку.Сохраняйте тепло зимой или прохладу летом, потому что теперь вы можете менять навесное оборудование, не покидая кабины, не вставая с сиденья трактора. Больше не нужно выбивать упорные штифты или рычаги, которые нужно поддеть, просто меняйте насадки одним нажатием кнопки.

3) Простое соединение ВСЕХ шлангов с помощью ОДНОГО рычага

Гидравлические соединения на фронтальном погрузчике всегда были сложными и беспорядочными… до сих пор! Запатентованная система Flat Face Hydra-Snap ™ правильно подсоединяет гидравлические и электрические соединения одновременно с поворотом ручки.А когда вы закончите работу с погрузчиком, все подключения легко снимаются и защищаются от мусора.

4) Максимально увеличьте свободу трактора

Прочная система монтажных кронштейнов Max исключает опасные подножки и дополнительные спуски с трактора. Чтобы установить погрузчик Freedom Mount ™ , просто опустите ковш на землю, поверните замки Smart-Locks и используйте гидравлическую мощность погрузчика для демонтажа погрузчика. Монтаж также прост: просто въезжайте, и погрузчик автоматически блокируется Smart-Locks на тракторе с помощью рычага Max Grip .Вы можете сесть или снять погрузчик с трактора менее чем за минуту! Нет инструментов! Нет булавок! Нет стендов! Никаких хлопот!

См. Их все на www.loader4U.com

СТАНДАРТНЫЙ ПАКЕТ ПОГРУЗЧИКА

3-дюймовые гидроцилиндры Smart-Pac без линий, 3-1 / 2-дюймовые гидроцилиндры Smart-Pac для бессточного подъема, Hydraulic Freedom-Mount ™, Smart-Lock, стандартный набор кронштейнов, комплект шлангов, Hydra-Snap ™, смазка из-под — Концевые пальцы, указатели высоты вращения и уровня, 84-дюймовый ковш большой емкости, муфты дистанционного управления и решетка радиатора на большинстве приспособлений.

ОПЦИИ И ОБНОВЛЕНИЯ ПАКЕТА

3rd Steel Line, Level UP Advantage, Комфортная езда, полностью электронный клапан и джойстик, а также полный набор приспособлений.

Разделение труда между загрузчиками PCNA в репликации ДНК и установлением сплоченности сестринских хроматид

Резюме

Одновременно с репликацией ДНК хромосомный когезиновый комплекс устанавливает сплоченность между вновь реплицированными сестринскими хроматидами.Несколько связанных с вилкой репликации «факторов установления сплоченности», включая многофункциональный комплекс Ctf18-RFC, помогают этому процессу пока что неизвестными способами. Здесь мы показываем, что роль Ctf18-RFC в когезии сестринских хроматид коррелирует с загрузкой PCNA, но отделима от его роли в контрольной точке репликации. Ctf18-RFC загружает PCNA с небольшим предпочтением ведущей цепи, которая необходима для репликации ДНК. Напротив, канонический комплекс Rfc1-RFC предпочтительно загружает PCNA на отстающую цепь, которая является критической для репликации ДНК, но незаменима для сцепления сестринских хроматид.Последующим эффектором Ctf18-RFC является ацетилирование когезина, которое мы помещаем на позднюю стадию созревания репликации. Наши результаты предполагают, что Ctf18-RFC обогащает и уравновешивает уровни PCNA на вилке репликации, помимо потребностей репликации ДНК, чтобы способствовать установлению слипчивости сестринских хроматид и, возможно, другим пострепликативным процессам.

Ключевые слова: Сегрегация хромосом, сцепление сестринских хроматид, установление когезии, репликация ДНК, фактор репликации C, Rfc1, Ctf18, PCNA, Eco1, S.cerevisiae

Введение

Физическое соединение двух реплицированных молекул геномной ДНК, известное как сцепление сестринских хроматид, необходимо для точного разделения генетической информации на дочерние клетки. Сцепление сестринских хроматид опосредуется хромосомным когезиновым комплексом, большим белковым кольцом, образованным из двух субъединиц спиральной спирали, Smc1 и Smc3, субъединицы клейзина Scc1 и дополнительных субъединиц, содержащих повтор HEAT, Scc3 и Pds5. Топологическое захват двух сестринских молекул ДНК этими когезиновыми кольцами формирует основу сцепления сестринских хроматид (Nasmyth and Haering, 2009, Peters and Nishiyama, 2012, Uhlmann, 2016).У почкующихся дрожжей cohesin загружается в хромосомы в поздней фазе G1, которая происходит в широких областях, свободных от нуклеосом, с помощью комплекса загрузчика cohesin Scc2-Scc4 (Muñoz et al., 2019). Когезин перемещается из этих сайтов загрузки под действием активной транскрипции и накапливается в сайтах конвергентной терминации транскрипции (Davidson et al., 2016, Glynn et al., 2004, Ленгронн и др., 2004, Ocampo-Hafalla et al., 2016). ). Перед репликацией ДНК когезин динамически поворачивается на хромосомах, его разгрузка облегчается Pds5 вместе с его субстехиометрическим партнером по связыванию Wapl (Chan et al., 2012, Герлих и др., 2006, Лопес-Серра и др., 2013, Мураяма и Ульманн, 2015).

Во время репликации ДНК происходят два важных изменения. Во-первых, вместо захвата одной ДНК, когезин скрепляет две сестринские ДНК. Это может быть достигнуто, если реплисома была способна реплицироваться через кольца когезина. Альтернативно, когезин временно теряет контакт с ДНК и перезагружается за вилкой репликации. Это может происходить путем последовательного захвата продукта репликации двухцепочечной ведущей цепи с последующим захватом соседнего одноцепочечного сегмента отстающей цепи.Оба пути не исключают друг друга (Murayama et al., 2018). Во-вторых, ацетилирование двух консервативных остатков лизина Smc3 с помощью Eco1 cohesin acetyltransferase стабилизирует охват когезином двух сестринских ДНК (Rolef Ben-Shahar et al., 2008, Ünal et al., 2008, Zhang et al., 2008). Ацетилирование Smc3 останавливает Pds5-Wapl-зависимое высвобождение ДНК, тем самым устанавливая прочное сцепление сестринских хроматид. Ацетилирование Smc3 не только предотвращает выход ДНК, но и препятствует дальнейшему входу ДНК. Следовательно, время ацетилирования Smc3 должно быть тесно связано с захватом сестринской ДНК.Основания для этого еще не выяснены.

В дополнение к эссенциальной Eco1 acetyltransferase, несколько несущественных компонентов реплисом вносят вклад в установление слипчивости сестринских хроматид. К ним относятся центр взаимодействия белка Ctf4, который рекрутирует геликазу Chl1. Chl1, в свою очередь, осуществляет прямой контакт с cohesin во время установления слипчивости (Hanna et al., 2001, Samora et al., 2016, Skibbens, 2004). Комплекс медиатора прогрессии репликации Mrc1-Tof1-Csm3 и контрольных точек также необходим для эффективного установления когезии (Mayer et al., 2004, Сюй и др., 2004). Его функции пока неизвестны, как и комплекс Ctf18-RFC (Mayer et al., 2001), являющийся предметом нашего настоящего исследования. Дефицит любого из вышеуказанных факторов установления когезии приводит к нарушению ацетилирования Smc3 (Borges et al., 2013). Следовательно, все факторы установления когезии могут совместно регулировать реакцию ацетилирования когезина. Альтернативно, факторы установления когезии д. Действовать по-разному, чтобы облегчить захват сестринских хроматид, что, в свою очередь, может быть предпосылкой для ацетилирования cohesin.Понимание их молекулярных механизмов необходимо, чтобы понять, как слипчивость сестринских хроматид устанавливается во время репликации ДНК.

Ctf18-RFC является членом семейства Replication Factor-C (RFC), белковых комплексов, которые загружают и разгружают скользящие зажимы ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA). PCNA участвует во множестве транзакций ДНК, в частности как фактор процессивности для ДНК-полимераз, но также как стыковочная платформа для множества других ферментов процессинга нуклеиновых кислот (Ohashi and Tsurimoto, 2017).RFC представляют собой пентамерные АТФазы AAA ⁺ . Четыре небольших субъединицы, от Rfc2 до Rfc5, являются общими для всех RFC. Один из паралогов больших субъединиц, Rfc1, Elg1 или Ctf18, дает комплексам их имена и идентичности (дополнительная большая субъединица Rad24 образует комплекс RFC, который функционирует со специализированным скользящим зажимом для контрольной точки повреждения ДНК). Rfc1-RFC — это наиболее изученный и единственный существенный комплекс RFC. Его привязка к ключам PCNA открывает один из интерфейсов тримеров PCNA. Rfc1-RFC распознает 3′-концы праймера, и последовательный гидролиз АТФ его субъединицами высвобождает зажим на ДНК (Bowman et al., 2004). In vitro , Rfc1-RFC способен катализировать как загрузку, так и разгрузку PCNA, хотя в репликационных вилках его основная роль, как полагают, заключается в загрузке PCNA на отстающую цепь для удлинения праймера с помощью ДНК-полимеразы δ. Переработка PCNA после завершения созревания фрагмента Окадзаки считается задачей Elg1-RFC, специализированного разгрузчика PCNA (Kang et al., 2019, Kubota et al., 2013).

Ctf18-RFC уникален тем, что Ctf18 имеет две дополнительные субъединицы, Ctf8 и Dcc1 (Mayer et al., 2001). Ctf18-RFC участвует как в загрузке, так и в разгрузке PCNA (Bermudez et al., 2003, Bylund and Burgers, 2005). Кроме того, Ctf18-RFC формирует часть контрольной точки репликации ДНК, которая обеспечивает активацию киназы контрольной точки Rad53 в ответ на остановку репликационной вилки (Crabbé et al., 2010, Naiki et al., 2001). Дальнейшие роли Ctf18-RFC в поддержании теломерного хроматина и стабильности триплетных повторов ДНК были задокументированы (Gellon et al., 2011, Hiraga et al., 2006). Хотя Ctf18-RFC также распознает концы праймеров, дополнительное нацеливание обеспечивается субъединицей Dcc1, которая, как сообщается, связывает как одноцепочечную ДНК (оцДНК), так и двухцепочечную ДНК (дцДНК), а также ДНК-полимеразу ε (Pol ε) ( Grabarczyk et al., 2018, Murakami et al., 2010, Wade et al., 2017). Взаимодействие Dcc1 с Pol ε открывает возможность того, что Ctf18-RFC выполняет по крайней мере часть своей функции на ведущей цепи (Fujisawa et al., 2017). Однако неизвестно, связаны ли и как какие-либо из вышеперечисленных свойств с ролью Ctf18-RFC в слипчивости сестринских хроматид.

Здесь мы используем почкующиеся дрожжи, чтобы исследовать роль Ctf18-RFC в установлении сплоченности. Мы обнаружили, что Ctf18-RFC загружает PCNA с небольшим предпочтением ведущей цепи, обеспечивая пул PCNA, который функционально отличается от PCNA, загруженного Rfc1-RFC.Эксперименты, которые исследуют мотив взаимодействия Eco1 с PCNA, согласуются с моделью, в которой Ctf18-RFC-нагруженная PCNA рекрутирует ацетилтрансферазу в место после репликационной вилки для установления сцепления сестринских хроматид.

Результаты

Уровни PCNA коррелируют с установлением сплоченности

Ранее мы обнаружили Ctf18 с помощью иммунопреципитации хроматина (ChIP) в остановившихся репликационных вилках после лечения гидроксимочевиной (HU) (Ленгронн и др., 2006), что согласуется с ролью Ctf18-RFC. в сигнализации контрольной точки репликации.Чтобы оценить локализацию Ctf18-RFC во время неоспоримой прогрессии репликационной вилки, когда обычно имеет место установление когезии, мы повторили Ctf18 ChIP в клетках, прогрессирующих синхронно через S-фазу после остановки и высвобождения α-фактора феромона. На рисунке S1A показано, что Ctf18 может совпадать с областями включения аналога нуклеотида бромдезоксиуридина (BrdU), подтверждая, что Ctf18-RFC присутствует в ответвлениях репликации во время ненарушенной S-фазы.

Наши предыдущие результаты показали, что уровни PCNA снижаются на вилках репликации с остановкой HU, лишенных Ctf18 (А; Ленгронн и др., 2006). Мы снова повторили этот анализ, используя клетки, прогрессирующие через синхронную S-фазу после ареста и высвобождения α-фактора. PCNA ChIP с последующей количественной ПЦР в реальном времени (ChIP-qPCR) выявила существенное снижение уровней PCNA в ответвлениях репликации, лишенных Ctf18 (рисунок S1C). Это говорит о том, что Ctf18-RFC функционирует как сетевой загрузчик PCNA как при остановленных вилках репликации, так и во время непрерывного развития вилок репликации.

Удаление Elg1 компенсирует отсутствие Ctf18

(A) Распределение PCNA в отсутствие Ctf18 и / или Elg1.Клетки синхронизировались в G1 и высвобождались в среду, содержащую HU. Иммунопреципитаты хроматина PCNA гибридизовали с матрицами Affymetrix GeneChip S. cerevisiae Tiling 1.0R. Интенсивности сигналов по отношению к образцу полногеномной ДНК показаны вдоль хромосомы 6. Указываются источники репликации, выбранные для последующего количественного анализа.

(B) Как и в (A), но иммунопреципитаты хроматина из PCNA, меченного эпитопом FLAG на N-конце, анализировали с помощью количественной ПЦР в реальном времени с использованием пар праймеров на раннем (ARS605, 606 и 607) и позднем ( ARS609) ориджин репликации.Показаны средние значения ± SE из трех независимых экспериментов.

(C) Клетки указанных генотипов были синхронизированы в G1 и высвобождены в среду, содержащую нокодазол, чтобы вызвать остановку митоза. Сцепление сестринских хроматид оценивали в отмеченном GFP локусе URA3 в указанные моменты времени. Показаны средние значения ± SE из трех независимых экспериментов.

(D) То же, что и в (C), но ацетилирование Smc3 контролировали вестерн-блоттингом с использованием антитела, специфичного к ацетил-Smc3 (AcSmc3).Общие уровни Smc3 определялись по его эпитопу Pk и служили в качестве контроля загрузки. Отношение AcSmc3 / Smc3-Pk нормализовали к таковому в клетках дикого типа через 45 мин. Показаны средние значения ± SE из трех независимых экспериментов.

См. Рисунки S1A и S1B для подтверждения связывания Ctf18 и загрузки PCNA на вилках, проходящих через ненарушенную фазу S, и рисунки S2A – S2E для экспериментов, разделяющих функцию Ctf18 в слипчивости сестринских хроматид и контрольную точку репликации.

Чтобы выяснить, функционирует ли Ctf18-RFC в установлении когезии сестринских хроматид в качестве загрузчика PCNA, мы спросили, может ли инактивация разгрузчика PCNA Elg1-RFC компенсировать отсутствие Ctf18.Мы выполнили ChIP против PCNA с последующим анализом микрочипов для визуализации хромосомного распределения (A), а также количественной ПЦР в реальном времени для измерения его уровней (B). Это подтвердило повышенные уровни PCNA в репликационных вилках в клетках, лишенных Elg1 (Kubota et al., 2015). Примечательно, что снижение PCNA, наблюдаемое в клетках ctf18Δ , было обращено в клетках, лишенных как Ctf18, так и Elg1. Уровни PCNA в репликационных вилках в клетках ctf18Δ elg1Δ были равны или выше, чем в контроле дикого типа.

Чтобы оценить влияние уровней PCNA на установление когезии сестринских хроматид, мы снова синхронизировали клетки, используя арест и высвобождение α-фактора. После прохождения через S-фазу клетки останавливали митоз обработкой нокодазолом. Мы визуализировали слипание сестринских хроматид tetO-массива, интегрированного в локус URA3 на хромосоме 5, связанного слитыми белками tetR-GFP (Michaelis et al., 1997). Как и ожидалось (Mayer et al., 2001), клетки, лишенные Ctf18, обнаруживают заметный дефект когезии сестринских хроматид (C).Напротив, клетки, лишенные Elg1, не обнаруживают дефекта когезии по сравнению с контролем дикого типа. Поразительно, что дефект когезии клеток ctf18Δ был существенно снижен в клетках, лишенных как Ctf18, так и Elg1.

Чтобы проанализировать установление когезии сестринских хроматид дополнительным способом, мы использовали вестерн-блоттинг для анализа ацетилирования Smc3 во время S-фазы. Как было замечено ранее, ацетилирование Smc3 нарушено в клетках ctf18Δ (D; Borges et al., 2013). Напротив, ацетилирование Smc3 превышало уровни дикого типа в клетках elg1Δ .Ацетилирование достигало, по крайней мере, уровней дикого типа в клетках, лишенных как Ctf18, так и Elg1. Это подтверждает, что дефект когезии в клетках, лишенных Ctf18, может быть устранен дополнительным удалением Elg1. Учитывая антагонистическое влияние Ctf18- и Elg1-RFC на PCNA, это открывает возможность того, что уровни PCNA в репликационной вилке являются лимитирующим детерминантом для установления слипчивости сестринских хроматид. Эти результаты согласуются и могут объяснить наблюдение, что elg1Δ частично устраняет дефект когезии у термочувствительного штамма eco1-1 (Maradeo and Skibbens, 2009).

Отдельные функции Ctf18-RFC в контрольной точке репликации и в сестринской хроматидной когезии

Ctf18-RFC функционирует как часть контрольной точки репликации ДНК, сигнальной сети, которая активирует киназу контрольной точки Rad53 в ответ на остановку вилки репликации (Crabbé et al. , 2010, Naiki et al., 2001). Поэтому мы задались вопросом, требуется ли функция контрольной точки репликации для установления сплоченности. Как мы видели выше, сцепление сестринских хроматид восстанавливается в клетках, лишенных как Ctf18, так и Elg1.В отличие от этого, чувствительность к росту на среде, содержащей HU, усиливается в клетках ctf18Δ elg1Δ (рис. S2A). Фосфорилирование Rad53 в ответ на лечение HU, что является признаком активации контрольной точки, слабо затрагивается в клетках, лишенных Ctf18 или Elg1, но почти полностью отменяется в клетках, лишенных обоих (рис. S2B), что согласуется с предыдущими сообщениями (Bellaoui et al., 2003, Ben- Aroya et al., 2003, Kanellis et al., 2003). Тот факт, что когезия сестринских хроматид в клетках ctf18Δ восстанавливается путем удаления Elg1, но реакция контрольной точки репликации ухудшается, предполагает, что функция когезии сестринской хроматиды Ctf18-RFC отличается от ее роли в контрольной точке репликации.

Разделительные роли Ctf18-RFC в сцеплении сестринских хроматид и контрольной точке репликации также стали очевидны в экспериментах, в которых мы анализировали АТФазу Ctf18. Мутации мотива Walker A в остатке, важном для связывания АТФ (Ctf18 ^K189E [Bylund and Burgers, 2005] или Ctf18 ^K189A [Okimoto et al., 2016]), ранее использовались, чтобы предположить, что АТФаза Ctf18 важна для контрольная точка репликации и in vitro разгрузка PCNA. Мы подтвердили чувствительность HU клеток ctf18 ^K189E (рисунок S2C).Напротив, те же самые клетки ctf18, ^{, K189E} были полностью приспособлены к установлению слипчивости сестринских хроматид (фигура S2D), тем самым разделяя две функции.

Мы заметили, что уровни белка Ctf18 ^K189E были заметно ниже, чем уровни белка Ctf18 дикого типа (фигура S2E), что позволяет предположить, что мутация ctf18 ^K189E нарушает стабильность белка. Поэтому мы разработали две альтернативные мутации АТФазы, более консервативное изменение Ctf18 ^K189R , а также Ctf18 ^{D240A, E241A} , изменяющее два важных остатка в мотиве Walker B.И Ctf18 ^K189R , и Ctf18 ^{D240A, E241A} показали улучшенную стабильность белка. Уровни PCNA на ответвлениях репликации были лишь незначительно снижены в клетках ctf18 ^K189R по сравнению с клетками ctf18Δ (фигура S2F). Сцепление сестринских хроматид не было нарушено в клетках ctf18, ^K189R и ctf18 ^{D240A, E241A} , и они показали устойчивый к HU рост (рисунки S2C и S2D). Чувствительность HU, наблюдаемая в клетках ctf18, ^{, K189E} , вероятно, была связана с пониженной стабильностью Ctf18.Контрольная точка репликации может быть более чувствительной к уровням Ctf18-RFC по сравнению с установлением сплоченности. Эти результаты также предполагают, что комплекс Ctf18-RFC сохраняет функциональность, даже если его большая субъединица неспособна гидролизовать АТФ, подобно тому, что наблюдается с Rfc1-RFC (Schmidt et al., 2001).

Ctf18-RFC-Loaded PCNA и Cohesion Establishment

Мы должны рассмотреть возможные косвенные объяснения восстановления когезии в ctf18Δ клетках путем удаления Elg1. Клетки, лишенные Elg1, демонстрируют повреждение ДНК и нестабильность генома (Bellaoui et al., 2003, Ben-Aroya et al., 2003, Johnson et al., 2016, Kanellis et al., 2003). Установление сцепления, индуцированное повреждениями ДНК (Ström et al., 2007, Ünal et al., 2007), может быть усилено в отсутствие Elg1 и компенсировать дефектное установление связанного с репликацией сцепления. Поэтому мы искали дополнительные способы проверить, ограничивают ли уровни PCNA установление сплоченности. Мы воспользовались открытием, что Elg1-RFC-зависимая разгрузка PCNA требует предварительного лигирования фрагмента Окадзаки лигазой Cdc9 (Kubota et al., 2015). Истощение Cdc9 с использованием индуцируемого ауксином дегрона частично восстанавливало уровни PCNA в репликационных вилках в ctf18Δ клетках (рисунок S2F). Он также частично спасает сцепление сестринских хроматид, а также ацетилирование Smc3 (A и 2B). Следовательно, даже в присутствии Elg1 предотвращение разгрузки PCNA путем сокращения лигирования фрагментов Okazaki улучшает сцепление сестринских хроматид.

Удержание отстающей цепи PCNA способствует установлению сплоченности

(A) Клетки указанных генотипов были синхронизированы в G1 и обработаны ауксином в течение 2 часов для истощения Cdc9 перед высвобождением в среду, содержащую нокодазол.Сцепление сестринских хроматид оценивали по GFP-маркированному локусу URA3 . Показаны средние значения ± SE из трех независимых экспериментов.

(B) То же, что и в (A), но ацетилирование Smc3 количественно определяли относительно общих уровней Smc3. Показаны средние значения ± SE из трех независимых экспериментов.

См. Рисунок S3 для дальнейшего анализа роли PCNA в установлении сплоченности.

Вышеупомянутый эксперимент показал, что восстановление PCNA, независимо от удаления Elg1, способствует слипанию сестринских хроматид.Однако нелигированные фрагменты Окадзаки после истощения Cdc9 сами по себе вызывают сигнал повреждения ДНК. Для более непосредственного выяснения того, отвечает ли установление сплоченности, вызванного повреждением ДНК, за восстановление сплоченности в клетках ctf18Δ , мы удалили ключевой компонент пути установления сплоченности, вызванного повреждением, — киназу контрольной точки Chk1 (Heidinger-Pauli et al., 2008). ). Сцепление сестринских хроматид было восстановлено в клетках ctf18Δ elg1Δ независимо от присутствия или отсутствия Chk1 (фигура S2G).Это предполагает, что установление сплоченности, вызванное повреждением ДНК, не было источником спасения сплоченности.

В другом возможном сценарии отсутствие Ctf18-RFC приводит к снижению уровней PCNA, но дефект когезии может быть вызван другой, пока неизвестной функцией Ctf18-RFC. Восстановление PCNA с помощью делеции Elg1 или истощения Cdc9, в свою очередь, может спасти сплоченность по причине, не связанной с исходной потерей PCNA. PCNA, которая накапливается в отсутствие Elg1, может отличаться от загруженной Ctf18 PCNA и обеспечивать установление когезии посредством реакции обхода.Если делеция Elg1 вызывает обходную реакцию установления слипчивости, такая реакция должна также улучшать слипчивость в отсутствие др. Факторов установления слипчивости. Поэтому мы проанализировали когезию в отсутствие Tof1 или Ctf4, двух факторов установления когезии, которые действуют параллельно с Ctf18 (Xu et al., 2007). Делеция ELG1 в штамме tof1Δ привела к увеличению уровней PCNA, но это не улучшило сцепление сестринских хроматид (фигура S3A). В случае ctf4Δ когезия сестринских хроматид дополнительно ухудшилась в клетках ctf4Δ elg1Δ .Хотя мы не знаем причину этого повышенного дефекта когезии, эти результаты вместе подтверждают, что отсутствие Elg1 не запускает общий механизм обхода, который устанавливает когезию сестринских хроматид.

Комплекс Ctf18-RFC включает субъединицы Ctf8 и Dcc1, которые одинаково важны для сцепления сестринских хроматид, как и сам Ctf18 (Mayer et al., 2001; Figure S3B). Если пониженные уровни PCNA в отсутствие Ctf18 действительно вызывают дефект когезии, то можно ожидать, что уровни PCNA будут сходным образом снижены в отсутствие Ctf8 или Dcc1.Однако Ctf8 и Dcc1 не требуются для загрузки и выгрузки in vitro PCNA с помощью Ctf18-RFC (Bermudez et al., 2003, Bylund and Burgers, 2005). Чтобы проверить, требуются ли Ctf8 и Dcc1 для загрузки in vivo PCNA, мы выполнили PCNA ChIP в штаммах, лишенных Ctf18, Ctf8 или Dcc1. Мы обнаружили аналогичное снижение уровней PCNA в каждом случае (рисунок S3B). Эти результаты предполагают, что Ctf8 и Dcc1 необходимы для загрузки in vivo PCNA с помощью Ctf18-RFC, и согласуются с идеей, что Ctf18-RFC действует в когезии сестринских хроматид как загрузчик PCNA.

В качестве последнего, прямого теста на роль PCNA в установлении сплоченности мы ввели мутацию интерфейса тримеров PCNA, pol30 ^C81R , которая дестабилизирует PCNA на хроматине (Johnson et al., 2016, Lau et al., 2002). pol30 ^{Клетки C81R} демонстрировали заметный дефект когезии, а также небольшое, но воспроизводимое снижение ацетилирования Smc3 (Фигуры S3C и S3D). И то, и другое можно улучшить, удалив Elg1. Это обеспечивает дополнительную линию доказательств того, что PCNA непосредственно участвует в установлении слипчивости сестринских хроматид.Роль PCNA в установлении сплоченности ранее предполагалась дефектами сплоченности, наблюдаемыми в клетках pol30-104 , и дефектом их синтетического роста в сочетании с аллелем eco1 ^ctf7-203 (Moldovan et al., 2006, Skibbens et al. др., 1999). Наши результаты теперь обеспечивают обоснование того, как Ctf18-RFC действует в слипчивости сестринских хроматид, увеличивая уровни PCNA на репликационных вилках.

Rfc1-RFC способствует репликации ДНК, но не сцеплению сестринских хроматид

Если PCNA является ограничивающим фактором для установления когезии, то комплекс Rfc1-RFC может также вносить вклад в сцепление сестринских хроматид путем загрузки PCNA.Чтобы проанализировать это, мы создали индуцируемый ауксином аллель degron субъединицы Rfc1, rfc1-aid . Уровни Rfc1 оставались едва обнаруживаемыми после добавления ауксина, и рост клеток был существенно затруднен (Фигуры S4A и S4B). Мы синхронизировали клетки с помощью ареста α-фактора и после истощения Rfc1 проанализировали прогрессирование S-фазы с помощью анализа содержания ДНК с помощью сортировки клеток с активацией флуоресценции (FACS). По сравнению с клетками дикого типа или ctf18Δ , клетки rfc1-aid показали значительно замедленную дупликацию содержимого ДНК (A).Это согласуется с важной ролью Rfc1, но в меньшей степени Ctf18, во время репликации ДНК. Чтобы исследовать причину медленной репликации после истощения Rfc1, мы проанализировали включение BrdU во вновь синтезированную ДНК с помощью иммунопреципитации и анализа микрочипов (B). Раннее инициирование происхождения после истощения Rfc1 было сравнимо с контролем дикого типа, но расширение следов BrdU со временем было медленнее (C). Rad53 был фосфорилирован, и поздняя инициация ориджина была подавлена ​​(B и S4C), что указывает на активацию контрольной точки репликации из-за остановки вилки.Это предполагает ключевую роль Rfc1-RFC во время фазы элонгации репликации ДНК.

Rfc1-RFC способствует репликации ДНК, но не сплочению сестринских хроматид

(A) Клетки были синхронизированы в G1, и Rfc1 истощался в течение 2 часов обработкой ауксином перед высвобождением в синхронную прогрессию через S-фазу. Репликацию ДНК контролировали с помощью анализа содержания ДНК FACS.

(B) Клетки синхронизировали в G1 и высвобождали в среду, содержащую BrdU. Клетки собирали в указанные сроки, и иммунопреципитаты BrdU гибридизовали с Affymetrix GeneChip S.cerevisiae Тайлинг массивов 1.0R. Интенсивности сигналов по отношению к образцу полногеномной ДНК, нормализованные к средней интенсивности пиков BrdU, показаны вдоль хромосомы 8. Указаны исходные положения.

(C) Коробчатые диаграммы ширины пиков BrdU, полученные из (B) из 52 ранних источников в указанные моменты времени.

(D) Клетки были арестованы в G1, и Rfc1 был истощен в течение 2 часов обработкой ауксином перед высвобождением в HU-содержащую среду для ранней остановки S-фазы. Иммунопреципитаты хроматина FLAG-PCNA анализировали с помощью кПЦР с парами праймеров вокруг ARS607.Показаны средние значения ± SE из четырех независимых экспериментов.

(E) Клетки были синхронизированы в G1 и высвобождены в среду, содержащую нокодазол. Сцепление сестринских хроматид оценивали по GFP-маркированному локусу URA3 . Показаны средние значения ± SE из трех независимых экспериментов.

(F) То же, что и в (E), но ацетилирование Smc3 определяли количественно относительно общих уровней Smc3. Показаны средние значения ± SE из трех независимых экспериментов.

См. Рисунок S4 для дальнейшей характеристики штамма rfc1-aid .

Затем мы измерили влияние истощения Rfc1 на уровни PCNA в вилках репликации. Они были уменьшены примерно до половины, аналогично тому, что мы наблюдали в клетках ctf18Δ (D). Затем мы оценили последствия для установления сплоченности. К нашему удивлению, сцепление сестринских хроматид не было затронуто истощением Rfc1 (E и 3F). Более того, истощение Rfc1 на фоне ctf18Δ не увеличивало когезию или дефекты ацетилирования Smc3, а также не задерживалось в дальнейшем репликация ДНК (E, 3F и S4D).Это предполагает разные роли Ctf18- и Rfc1-RFC. Хотя оба комплекса загружают PCNA, они, по-видимому, загружают разные пулы PCNA. PCNA, загруженная Rfc1-RFC, важна для репликации ДНК, но не для слипания сестринских хроматид. Напротив, загруженная Ctf18-RFC PCNA незаменима для массовой репликации ДНК, но играет главную роль во время установления слипчивости.

Обратите внимание, что этот сценарий меняется при отсутствии как Ctf18, так и Elg1. В этом случае Rfc1-RFC предоставляет единственный источник PCNA, который в отсутствие Elg1-RFC получает возможность способствовать установлению сплоченности.Об этом мы поговорим ниже.

Взаимодействие Pol ε необходимо для функции Ctf18-RFC

Ctf18-RFC взаимодействует через свою субъединицу Dcc1 с большой субъединицей Pol2 ведущей цепи ДНК-полимеразы, Pol ε (Grabarczyk et al., 2018, Murakami et al., 2010 ). Мы поэтому исследовали, важно ли взаимодействие Pol ε для функции Ctf18 в слипчивости сестринских хроматид. Основываясь на кристаллической структуре Dcc1 в комплексе с Pol2, мы ввели точечные мутации в Dcc1 или Pol2, которые нарушают это взаимодействие in vitro (Grabarczyk et al., 2018). Мы подтвердили, что эти мутации, Dcc1 ^{K364A, R367A, R380A} и Pol2 ^{E318A, D334A, D368A} (короткий Dcc1 ^KRR и Pol2 ^EDD ; A), нарушают взаимодействие Ctf18-RF1492 с Pol2 v. (Рисунок S5). Затем мы использовали ChIP-qPCR для оценки последствий этих мутаций для привлечения Ctf18-RFC к вилкам репликации. Клетки, экспрессирующие Dcc1 ^KRR или Pol2 ^EDD , показали сниженные уровни Ctf18-RFC на HU-синхронизированных вилках репликации, но Ctf18-RFC оставался четко определяемым в обоих случаях (B).Уровни PCNA были снижены в клетках Dcc1 ^KRR , но они оставались заметно выше, чем в отсутствие Ctf18 (рисунок S2F), что согласуется с наблюдением, что Pol2 стимулирует загрузку PCNA с помощью Ctf18-RFC (Fujisawa et al., 2017). В совокупности это предполагает, что взаимодействие Pol ε способствует, но не является единственным средством, с помощью которого Ctf18-RFC рекрутируется в вилки репликации.

Взаимодействие Pol ε необходимо для функции Ctf18-RFC

(A) Схема взаимодействия Ctf18 с большой субъединицей Pol2, Pol2.

(B) Клетки были синхронизированы в G1 и высвобождены в HU-содержащую среду для ранней остановки S-фазы. Обогащение Ctf18, близкое к раннему (ARS606 и 607) и позднему (ARS609) началу репликации, количественно определяли с помощью ПЦР в реальном времени. Показаны средние значения ± SE из трех независимых экспериментов.

(C) Клетки были синхронизированы в G1 и высвобождены в среду, содержащую нокодазол. Сцепление сестринских хроматид оценивали по GFP-маркированному локусу URA3 . Показаны средние значения ± SE из трех независимых экспериментов.

(D) То же, что и в (C), но ацетилирование Smc3 определяли количественно относительно общих уровней Smc3. Показаны средние значения ± SE из трех независимых экспериментов.

(E) 10-кратные серийные разведения указанных штаммов наносили на чашки с агаром с дрожжевым экстрактом и пептон-декстрозой (YPD), не содержащие или не содержащие 100 мМ HU.

См. Рисунок S5 для дальнейшей характеристики Pol2 ^EDD и Dcc1 ^KRR .

Затем мы проанализировали важность взаимодействия Pol ε для сцепления сестринских хроматид.В отличие от отсутствия Ctf18, Dcc1 ^KRR и Pol2 ^EDD не оказывали очевидного влияния на когезию сестринских хроматид или ацетилирование Smc3 (C и 4D). Кроме того, штаммы, экспрессирующие Dcc1 ^KRR или Pol2 ^EDD , росли на среде, содержащей HU, почти равной контролю дикого типа, в отличие от клеток dcc1Δ , которые проявляют выраженную чувствительность к HU (E). Это указывает на то, что взаимодействие Pol ε не является существенным для функции Ctf18-RFC в слипчивости сестринских хроматид и в контрольной точке репликации.Дополнительные механизмы нацеливания реплисом, вероятно, содержатся в комплексе Ctf18-RFC, и их, по-видимому, достаточно для поддержки его основных функций.

Распределение Ctf18- и Rfc1-RFC по ведущей и отстающей цепям

Чтобы установить, где Ctf18- и Rfc1-RFC действуют на вилке репликации, мы использовали обогащение и секвенирование зарождающейся ДНК, ассоциированной с белками (eSPAN; Yu et al., 2014). Этот метод использует включение BrdU для маркировки зарождающихся прядей. ChIP против интересующего белка сопровождается денатурацией ДНК и иммуноочисткой цепи, содержащей BrdU.Затем его местоположение и многожильность определяется с использованием протокола секвенирования, специфичного для цепи. Белок, который ассоциируется с ведущими цепями, будет извлекать последовательности цепей Крика выше и последовательности цепей Уотсона ниже точки начала репликации (A) и наоборот для белка, обогащенного на отстающих цепях. Как сообщалось, Rfc1 обнаруживает выраженное смещение отстающей цепи на HU-синхронизированных репликационных вилках (Yu et al., 2014). Напротив, Ctf18 показал заметное смещение ведущей цепи (B). Мы повторили eSPAN, используя раннюю временную точку S-фазы культур, проходящих через ненарушенный клеточный цикл после синхронизации α-фактора (C).Это подтвердило преимущественное распределение Ctf18 и Rfc1 по ведущей и отстающей цепям соответственно.

Ctf18 и Rfc1 распределяются по ведущей и отстающей нитям

(A) Схема eSPAN, объединяющая ChIP с секвенированием зарождающейся ДНК, специфичной для цепи.

(B) Клетки синхронизировали в G1 и высвобождали в среду, содержащую BrdU и HU. ДНК, выделенная с помощью BrdU-IP, ChIP против Ctf18 или Rfc1, и ChIP с последующим BrdU-IP (eSPAN), подвергалась специфическому для цепи секвенированию.Показаны показания Уотсона (красный) и Крика (зеленый) вокруг ARS508, а также усредненное смещение цепочки, нормализованное к показаниям BrdU, окружающее 92 ранних, хорошо разделенных источника.

(C) Анализ Ctf18 и Rfc1 eSPAN в клетках, синхронизированных в G1 и выпущенных в синхронную S-фазу прогрессии в среде, содержащей BrdU, в течение 26 мин.

(D) Анализ Ctf18 eSPAN в клетках Pol2 ^EDD , синхронизированных в G1 и высвобожденных в среду, содержащую BrdU и HU.

См. Рисунок S6 для анализа ctf18 и Rfc1 eSPAN в ячейках, не имеющих их соответствующих аналогов.

Чтобы определить, является ли взаимодействие Pol ε ответственным за смещение ведущей цепи Ctf18-RFC, мы повторили Ctf18 eSPAN на фоне Pol2 ^EDD . Смещение ведущей нити стало менее выраженным, но все же заметным (D). Мы пришли к выводу, что Ctf18-RFC предпочтительно взаимодействует с ведущей цепью, предпочтение, которое усиливается, но не зависит исключительно от его взаимодействия с Pol ε.

Ctf18-RFC является неотъемлемой частью балансировки уровней PCNA между ведущей и отстающей цепями

Далее мы исследовали, как комплексы RFC формируют распределение PCNA в ответвлениях репликации.Мы выполнили PCNA eSPAN в ранней S-фазе после блока и высвобождения альфа-фактора. Сообщалось, что PCNA обогащается на отстающей цепи в этих условиях, как ожидалось из-за частой загрузки PCNA во время синтеза фрагмента Okazaki (Yu et al., 2014). Вопреки этим ожиданиям, мы воспроизводимо не обнаружили смещения цепи, что указывает на равное распределение PCNA как в ведущей, так и в отстающей цепи (). Это можно объяснить двумя техническими отличиями от предыдущего эксперимента. Мы использовали антитело против α-PCNA для преципитации немодифицированного PCNA (Yu et al., 2014) вместо слияния метки эпитопа с С-концом PCNA, регион, который, как известно, важен для функции PCNA (Kelman et al., 1999). Кроме того, наш эксперимент проводился при 25 ° C вместо 16 ° C, что могло изменить динамику загрузки или разгрузки PCNA. Наши результаты предполагают, что равные количества PCNA присутствуют на ведущих и отстающих цепях ненарушенных вилок репликации ДНК.

RFC-комплексы уравновешивают уровни PCNA на вилках репликации

Анализ PCNA eSPAN был выполнен в указанных фоновых напряжениях, как в.Клетки были синхронизированы в G1 и выпущены в синхронную S-фазу прогрессии в среде, содержащей BrdU, в течение 26 мин. Показано усредненное смещение цепи, нормализованное к показаниям BrdU, окружающее ранние, хорошо разделенные источники.

Elg1, как полагают, разгружает PCNA после завершения синтеза фрагмента Окадзаки. Как и ожидалось (Yu et al., 2014), после удаления Elg1, PCNA стала заметно обогащаться на отстающих цепях (). Напротив, истощение Rfc1 приводит к заметной потере PCNA из отстающей цепи и последующему обогащению на ведущей цепи.Это подтверждает доминирующую роль Rfc1-RFC в загрузке PCNA во время синтеза фрагмента Окадзаки. Это также подтверждает наличие значительных количеств PCNA на ведущей цепи, которые становятся доступными в отсутствие Rfc1-RFC.

В клетках ctf18Δ PCNA приобрела заметное смещение в сторону отстающей цепи (). Это подтверждает роль Ctf18-RFC в загрузке ведущей цепи PCNA. Однако смещение отстающей цепи было относительно небольшим, учитывая значительную количественную потерю PCNA из репликационных вилок в клетках ctf18Δ (B).Вероятное объяснение состоит в том, что Ctf18-RFC загружает PCNA как на ведущую, так и на отстающую нити, отдавая предпочтение ведущей нити.

Альтернативное объяснение небольшого смещения PCNA отстающей цепи в клетках ctf18Δ состоит в том, что Rfc1-RFC берет на себя загрузку PCNA ведущей цепи. Чтобы проверить, компенсируют ли RFC-комплексы друг друга, мы выполнили Rfc1 и Ctf18 eSPAN в отсутствие друг друга. Смещение отстающей цепи Rfc1 не изменялось в отсутствие Ctf18, и в равной степени смещение ведущей цепи Ctf18-RFC не зависело от истощения Rfc1 (фигура S6A).Это делает маловероятным, что Rfc1 компенсирует Ctf18-RFC при загрузке ведущей цепи PCNA, подчеркивая различные функции двух комплексов RFC.

Наконец, мы рассмотрели, как удаление Elg1 восстанавливает уровни PCNA в ответвлениях репликации, в которых отсутствует Ctf18-RFC. Удаление Elg1 может восстановить ведущую цепь PCNA на этом фоне. Однако это было не так. Смещение отстающей цепи PCNA в клетках ctf18Δ было значительно увеличено в клетках ctf18Δ elg1Δ , и оно даже превысило сильное смещение, наблюдаемое в клетках elg1Δ (фиг. S6B).Это указывает на то, что слипчивость сестринских хроматид спасается в клетках ctf18Δ elg1Δ в первую очередь за счет увеличения уровней PCNA на отстающей цепи.

Функция Ctf18-RFC вызывает ацетилирование когезина

С целью получить более глубокое понимание загруженной Ctf18-RFC PCNA, мы искали ее нижестоящий эффектор в сцеплении сестринских хроматид. Eco1 cohesin acetyltransferase была связана с PCNA (Skibbens et al., 1999). Вырожденный пептид, взаимодействующий с PCNA (PIP-бокс), был идентифицирован в Eco1 (A; Moldovan et al., 2006, Song et al., 2012). Однако в этом PIP-боксе отсутствуют два ключевых ароматических остатка, и обнаруженные физические взаимодействия между Eco1 и PCNA трудно воспроизвести. Недавно в качестве альтернативного рецептора Eco1 на реплисоме была предложена геликаза MCM (Иванов и др., 2018, Минамино и др., 2018). Мы поэтому спросили, лежит ли ацетилирование cohesin ниже по течению от Ctf18-RFC во время установления слипчивости.

Eco1 взаимодействует с PCNA на поздней стадии репликации

(A) Схема Eco1 и его PIP-бокса, а также слитых конструкций, полученных с мутантным белком PIP-бокса (Eco1 ^-pip ).

(B) 10-кратные серийные разведения культур MET3pr-eco1-aid наносили на среду без метионина или на среду YPD, содержащую ауксин, для подавления экспрессии Eco1 и индукции его деградации. Указанные белки дополнительно экспрессировались под контролем промоторов Eco1 или PCNA соответственно.

(C) MET3pr-eco1-aid Клетки , экспрессирующие указанные дополнительные белки, были синхронизированы в G1, лишены эндогенного Eco1 и высвобождены для синхронной прогрессии клеточного цикла.Ацетилирование Smc3 анализировали методом вестерн-блоттинга. Scc1 служил маркером развития клеточного цикла, а глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (G6PD) служила контролем нагрузки.

(D) 10-кратные серийные разведения культур MET3pr-eco1-aid , которые, кроме того, содержали слияния Eco1pip с указанными белками в их соответствующих локусах эндогенных генов, наносили на указанные среды.

См. Фигуру S7 для демонстрации того, что Ctf18 нацелен на ацетилирование когезина, для анализа взаимодействия Eco1-PCNA и для уровней экспрессии белков слияния Eco1 ^-pip .

Если эффектором Ctf18-RFC является Eco1, то Ctf18 должен стать несущественным в генетическом фоне дрожжей, в котором ацетилирование когезина больше не происходит. Eco1 модифицирует два консервативных лизина Smc3. Клетки, в которых оба из них заменены аргинином или аспарагином, являются нежизнеспособными. Однако смешанный мутант аргинина-аспарагина ( SMC3, ^{K112R, K113N} ) позволяет пролиферацию клеток в отсутствие Eco1 (Borges et al., 2010). SMC3 ^{Клетки K112R, K113N} обнаруживают нарушенную когезию сестринских хроматид, но присутствие или отсутствие Ctf18 больше не влияет на когезию на этом фоне (фигура S7A).Обобщая наблюдения, что ацетилирование когезина снижается в отсутствие Ctf18 (D) и что Ctf18 больше не влияет на установление слипчивости в штамме SMC3, ^{K112R, штамм K113N} , можно предположить, что Ctf18-RFC функционирует выше ацетилирования когезина. В соответствии с ацетилированием cohesin в качестве функциональной мишени для Ctf18-RFC, дефект слипчивости в ctf18Δ клетках устраняется путем удаления разгрузчика cohesin Wapl, которому противодействует ацетилирование (Borges et al., 2013).

Eco1 функционирует с PCNA после вилки репликации

Поскольку нам и другим не удалось обнаружить физическое взаимодействие между PCNA и Eco1 с помощью традиционной коиммунопреципитации, мы использовали альтернативный подход для исследования PIP-бокса Eco1. Мы ввели две точечные мутации в вырожденный мотив QxxL бокса PIP, заменив его на AxxA (Eco1 ^-pip ). Eco1 ^-pip не смог дополнить функцию Eco1 и вызвал выраженный дефект когезии сестринских хроматид (B и S7B), что согласуется с более ранними сообщениями (Moldovan et al., 2006). Если Eco1 PIP-бокс действительно опосредует взаимодействие PCNA, мы должны иметь возможность заменить его PIP-боксом другого белка. Поэтому мы создали 15 аминокислот с N-конца лигазы Cdc9, включая ее консенсусную последовательность PIP-бокса QxxLxxFF, на N-конец Eco1 ^-pip . Это, но не слияние варианта AxxAxxAA той же самой последовательности, восстанавливает рост клеток и сцепление сестринских хроматид (B и S7B). В следующем тесте мы слили Eco1 ^-pip непосредственно с PCNA. Опять же, это наделило Eco1 ^-pip способностью поддерживать рост клеток и сцепление сестринских хроматид.Слияние PCNA-Eco1 ^-pip также восстанавливает ацетилирование Smc3, которое теряется в клетках, экспрессирующих Eco1 ^-pip (C). Вместе эти результаты согласуются с возможностью того, что вырожденный PIP box Eco1 действительно нацелен на PCNA, чтобы способствовать слипанию сестринских хроматид.

Альтернативное объяснение вышеупомянутых наблюдений состоит в том, что нацеливание на PCNA обходит потребность в мотиве QxxL, который обычно опосредует взаимодействие с другим белком. Для непосредственного изучения взаимодействия Eco1-PCNA мы иммобилизовали рекомбинантный очищенный белок His ₆ -Eco1 или His ₆ -Eco1 ^-pip на шариках Ni ²⁺ .Eco1, но не Eco1 ^-pip , удерживал PCNA из клеточных экстрактов, которые мы пропустили через эти гранулы (рисунок S7C). Эти результаты легче всего объяснить, если блок Eco1 PIP действительно задействует PCNA. Сложный характер этих клеточных экстрактов оставляет возможность того, что дополнительные факторы способствуют взаимодействию.

Зная, что мы можем восстановить функцию белка Eco1 ^-pip путем слияния его с PCNA, мы использовали аналогичный подход для определения того, где на вилке репликации должен действовать Eco1.Мы слили Eco1 ^-pip с панелью дополнительных компонентов реплисом, которые мы выбрали для представления различных мест на вилке репликации (D и S7D). Были произведены слияния с локусами эндогенных генов, чтобы гарантировать, что слитые белки заняли место своих исходных мишеней. Из 11 протестированных слияний только слияние Fen1-Eco1 ^-pip восстановило устойчивый рост клеток. Намного меньшая степень роста была обеспечена слиянием Cdc9-Eco1 ^-pip . Fen1 — это эндонуклеаза лоскута, которая действует во время созревания фрагмента Окадзаки.Подобно Cdc9, Fen1 взаимодействует с PCNA. Это указывает на то, что Eco1 занимает положение, близкое к PCNA на поздних стадиях репликации ДНК, чтобы функционировать в установлении слипчивости. Мы отмечаем, что слияние ни Eco1 дикого типа, ни Eco1 ^-pip с другим кандидатом на рецептор Eco1, геликазой MCM (Иванов и др., 2018, Минамино и др., 2018), не поддерживало рост клеток в нашем анализе.

Discussion

Ctf18-RFC, как давно известно, играет важную роль в установлении сцепления сестринских хроматид.Он участвовал в загрузке и выгрузке PCNA, а также в контрольной точке репликации, среди других функций. Если вилки будут временно останавливаться, когда они встречаются с cohesin, контрольная точка репликации может вступить в игру во время установления сцепления сестринских хроматид. Эта идея подтверждается тем фактом, что медиаторы контрольных точек репликации Mrc1, Tof1 и Csm3 также вносят вклад в установление сплоченности. Однако наше молекулярное рассечение предполагает, что Ctf18-RFC действует в когезине сестринской хроматиды отдельно от своей роли контрольной точки, скорее всего, путем загрузки PCNA.Мы обнаружили, что Eco1 является вероятным нижестоящим эффектором PCNA, и мы сужаем его место действия у почкующихся дрожжей до поздней стадии репликации ДНК.

Ctf18-RFC обогащает и уравновешивает PCNA на вилках репликации

Наш анализ показал, что PCNA равномерно распределяется между ведущими и отстающими цепями на вилках репликации ДНК. Это стало неожиданностью, поскольку считается, что PCNA функционирует преимущественно во время синтеза отстающей цепи. Примерно через каждые 150 пар оснований закладывается новый праймер фрагмента Окадзаки, который удлиняется с помощью Rfc1-RFC, PCNA и Pol δ.Синтез ведущей цепи с помощью Pol ε также облегчается с помощью PCNA, но считается, что процесс происходит на гораздо больших расстояниях. Было высказано предположение, что задержка Pol ε запускает новые раунды загрузки PCNA с помощью Ctf18-RFC в ведущей цепи (Fujisawa et al., 2017), но частота, с которой происходят такие события, неизвестна.

Хотя репликация отстающей цепи, следовательно, вероятно, использует большее количество молекул PCNA по сравнению с ведущей цепью, возникают два механизма, которые уравновешивают уровни PCNA между двумя цепями.Во-первых, Elg1-RFC выгружает PCNA из отстающей цепи после завершения созревания фрагмента Окадзаки. Во-вторых, мы обнаружили, что Ctf18-RFC добавляет значительные количества PCNA в ведущую цепь. В то время как возможные последствия ведущей цепи PCNA для репликации ДНК еще предстоит исследовать, важная роль может лежать в процессах, дополнительных к репликации ДНК. Учитывая неспособность Ctf18 поддерживать репликацию ДНК, мы предполагаем, что Ctf18-RFC загружает PCNA вдали от сайтов синтеза ДНК, возможно, пострепликативным способом.Это может увеличивать уровни PCNA, которые сохраняются после завершения репликации ДНК как на ведущей, так и на отстающей цепи.

Без Ctf18 уровни PCNA в ведущей цепи снижаются сильнее, чем в отстающей. Однако когезию можно восстановить, удалив Elg1-RFC, который вызывает накопление PCNA на отстающей цепи. Это на первый взгляд парадоксально, но может быть объяснено, если PCNA на обеих цепях может поддерживать ацетилирование cohesin и установление слипчивости, пока PCNA присутствует на подходящем расстоянии от вилки.Эта идея подтверждается наблюдением, что нацеливание Eco1 на Fen1, который действует поздно во время созревания фрагментов Okazaki, поддерживает установление сплоченности. Обратите внимание, что клетки, лишенные Elg1, демонстрируют нестабильность генома из-за чрезмерного удержания PCNA (Johnson et al., 2016). Следовательно, более низкое, но сбалансированное удерживание PCNA как на ведущих, так и на отстающих цепях может предоставить благоприятную возможность для установления слипчивости.

Отличительные особенности Rfc1-RFC, Ctf18-RFC и Elg1-RFC

Что дает трем эукариотическим RFC-комплексам, Rfc1-, Ctf18- и Elg1-RFC, их особенности? Биохимическая характеристика Rfc1- и Ctf18-RFC показала, что оба комплекса распознают концы праймеров в качестве субстрата для загрузки PCNA (Bermudez et al., 2003, Bylund and Burgers, 2005). Rfc1-RFC, но не Ctf18-RFC, может дополнительно загружать PCNA на разорванную двухцепочечную матрицу ДНК. Несмотря на это принципиальное сходство, встречаются строгие различия in vivo . Там Ctf18-RFC, по-видимому, не может распознавать концы праймеров для поддержки синтеза ДНК. Rfc1-RFC, в свою очередь, кажется неподходящим для загрузки PCNA для использования в установлении сплоченности. Комплекс Ctf18-RFC включает две дополнительные субъединицы, Ctf8 и Dcc1, которые отличают его от Rfc1-RFC.Эти субъединицы связывают Ctf18-RFC с ведущей цепью ДНК-полимеразы ε. Эксперименты по фракционированию клеток подтвердили, что рекрутирование хроматина Ctf18-RFC во время S фазы также поддерживается с помощью Ctf4 (legronne et al., 2006). Взаимодействует ли Ctf18-RFC напрямую с центром взаимодействия с реплисомой Ctf4 и вносит ли это дополнительный вклад в функцию Ctf18-RFC, еще предстоит выяснить.

Разгрузка PCNA с помощью Elg1-RFC происходит после завершения синтеза отстающей цепи путем лигирования фрагмента Окадзаки. In vitro , Elg1-RFC выгружает PCNA на концах праймера, в разрывах или из ковалентно закрытой дцДНК (Kang et al., 2019, Kubota et al., 2015). Как разгрузка in vivo следует за завершением созревания фрагмента Окадзаки, еще предстоит изучить. Последний вопрос, касающийся специфики RFC-комплексов, касается их функции в контрольной точке репликации ДНК. Три комплекса RFC вносят дополнительный вклад в передачу сигналов контрольной точки в ответ на остановку репликационной вилки (Bellaoui et al., 2003, Ben-Aroya et al., 2003, Канеллис и др., 2003). Неизвестно, важна ли сложная хореография загрузки и выгрузки PCNA для контрольной точки репликации или функция контрольной точки не зависит от загрузки и выгрузки PCNA.

События, связанные с реплисомой, завершающие репликацию хромосомы

В человеческих клетках геликаза MCM была предложена в качестве рецептора репликационной вилки для когезинацетилтрансферазы Esco2 (Иванов и др., 2018, Минамино и др., 2018). Хеликаза MCM является одним из первых компонентов реплисом, которые обнаруживают когезин.Ацетилирование когезина в это время будет стабилизировать когезин на ДНК и препятствовать дальнейшему входу или выходу ДНК. Это могло бы установить сцепление сестринских хроматид, если реплисома была способна проходить через кольца когезина. Напротив, почкующиеся дрожжи Eco1, по-видимому, действуют там, где созревание фрагмента Окадзаки происходит позади репликационной вилки. В этом месте Eco1 может быть расположен лучше для ацетилирования когезина, который подвергся новой нагрузке, охватывающей обе сестринские ДНК (Ленгронн и др., 2006, Мураяма и др., 2018). Мы предполагаем, что и прохождение реплисомы через кольца когезина, и возобновленная загрузка когезина за вилкой взаимодействуют во время установления когезии. Относительный акцент между двумя путями может различаться у разных организмов. В недавнем исследовании подчеркивается, что человеческий Esco2 также зависит от взаимодействия PCNA для своей функции (Bender et al., 2020).

De novo отложение нуклеосом после репликации ДНК зависит от комплекса сборки хроматина CAF-1, который взаимодействует с PCNA (Shibahara and Stillman, 1999).Считается, что PCNA, оставшаяся после синтеза фрагмента Окадзаки, рекрутирует CAF-1. Этот сценарий не может объяснить, как CAF-1 способствует сборке хроматина на ведущей цепи. Наше наблюдение, что Ctf18-RFC добавляет PCNA к ведущим цепям, может объяснить, как CAF-1 задействован в обеих цепях. Дефекты теломерного хроматина у почкующихся дрожжей, наблюдаемые в отсутствие Ctf18, могут быть следствием этой роли (Hiraga et al., 2006). Было бы интересно исследовать, могут ли другие пострепликативные процессы, т.е.g., репарация ДНК, связанная с репликацией, также использует сбалансированное распределение PCNA, которое помогает создать Ctf18-RFC.

Есть ли максимальное количество сверхурочных, которое мои сотрудники могут работать в неделю?

Если вы выплачиваете надлежащую компенсацию и предоставляете необходимые перерывы, нет никаких федеральных ограничений на то, сколько сверхурочной работы ваши сотрудники могут работать.

Закон о справедливых трудовых стандартах (FLSA) не устанавливает ограничения на то, сколько времени сотрудник может работать, поэтому в большинстве штатов количество часов, которые сотрудники могут работать в неделю, потенциально может достигать количества часов в неделю. неделя.

* Готовы к автоматическому ответу на расчет заработной платы? Узнайте, как начать экономить время и деньги с помощью программного обеспечения для автоматического расчета заработной платы Zenefits. *

Исключения из закона штата

В штатах Иллинойс, Нью-Йорк и Висконсин действуют законы, ограничивающие максимальное количество рабочих дней в неделе на одной работе до шести, эффективно обеспечивая служащим одним днем ​​обязательного отдыха в неделю. Но эти законы не ограничивают количество часов, которое можно проводить каждый день.

В других штатах действуют определенные ограничения.В Калифорнии сотрудников нельзя наказать или уволить за отказ работать более 72 часов в неделю. В штате Мэн работодатель не может требовать от работников сверхурочной работы более 80 часов за любой последовательный двухнедельный период.

Если вы обязываете своих сотрудников работать сверхурочно, рекомендуется перепроверить законы своего штата на предмет возможных ограничений.

Другие исключения

Законы о детском труде ограничивают количество часов, которое несовершеннолетние могут работать в день.
Несколько регулируемых отраслей (т.е. водители грузовиков или пилоты самолетов) имеют максимальную продолжительность смены.
Коллективные договоры, заключенные некоторыми профсоюзами, устанавливают ограничения на максимальное количество часов, в течение которых они могут быть вынуждены работать.

Считайте

Хотя во многих случаях закон требует, чтобы сотрудники работали сверхурочно, это, как правило, не является хорошей практикой. Качество работы сотрудников, скорее всего, резко упадет, если они будут чувствовать себя перегруженными. Кроме того, на слишком сложных должностях, вероятно, будет высокая текучесть кадров.

Полезные ссылки:

Пределы сверхурочной работы в штате Мэн — законодательный орган.Maine.gov
Принудительная и обязательная сверхурочная работа — legalmatch.com

Войдите, чтобы добавить закладку

Еще нет учетной записи? Зарегистрировать

Об авторе

Лорен Пералес

В качестве консультанта по кадрам в Zenefits Лорен предоставляет рекомендации и передовые методы компаниям любого размера по любым вопросам, связанным с кадрами и соблюдением нормативных требований.В свободное время она любит читать и гнать своих трех собак.

Найдите подходящую гусеницу для колесного погрузчика с бортовым поворотом

Поскольку на рынке доступны резиновые и стальные гусеницы, устанавливаемые поверх покрышек, конечного пользователя может немного запутать, когда придет время выбрать правильное решение для своего применения. Узнайте больше о разнице между этими двумя продуктами.

Найдите подходящую гусеницу для колесного погрузчика с бортовым поворотом

Если вы занятый предприниматель в строительстве, фермер, которому нужно выполнять свои задачи, или просто человек, которому нравится работать — даже в самых суровых условиях, мы всегда приветствуем поиск решения, которое поможет вам максимально увеличить производительность вашего погрузчика с бортовым поворотом.Именно для этого были разработаны гусеницы с шиной (OTT): иногда шины просто не могут срезать, если вам требуется дополнительный уровень сцепления или проходимости.

Поскольку на рынке имеются резиновые и стальные гусеницы, устанавливаемые поверх покрышек, конечный пользователь может запутаться, когда придет время выбрать правильное решение для своего применения. Вот почему мы сели с нашим экспертом по железнодорожным путям Эндрю Гаффни, менеджером по продукции, Америка — строительные пути. Затем мы объединили его советы, и наш OTT отслеживает особенности и преимущества в личном сравнении.Вот основные выводы.

Вот несколько дополнительных часто задаваемых вопросов о следах, установленных над шинами:

Когда следует использовать стальные гусеницы вместо резиновых гусениц над шиной?

Это всегда зависит от вашего приложения и типа поверхности, с которой вы работаете. Как правило, Steel OTT улучшает производительность вашего погрузчика с бортовым поворотом в более экстремальных условиях, от грязных поверхностей до камней или даже льда. С другой стороны, Rubber OTT лучше всего работает при минимальном воздействии на грунт и максимальной проходимости на таких поверхностях, как дерн, песок и снег.

Могу ли я использовать свой OTT-трек круглый год?

Наши инженеры Camso спроектировали обе гусеницы с накладками на шины для использования в любое время года. Они были разработаны как навесное оборудование, которое обеспечивает повышенную производительность погрузчика с бортовым поворотом в определенных областях применения. Для операторов, которые обнаруживают, что их мини-погрузчики с бортовым поворотом не работают идеально без гусениц, покрытых шинами, возможно, пришло время рассмотреть гусеничный погрузчик как постоянное решение для их применения. Рекомендуем обсудить варианты с вашим дилером оборудования.

Могу ли я использовать OTT с покрышками из пенопласта или сплошными шинами?

Мы не рекомендуем использовать шины с наполнителем из пеноматериала или сплошные шины, так как это окажет дополнительное давление на вашу гусеницу OTT.

Для получения дополнительной информации о гусеницах Camso Construction и гусеницах с защитой от шин посетите строительный раздел нашего веб-сайта.

Максимальная MFR: Складской подъемник

Максимальный MFR FGL25T-AWG3 FL1606

Мачта трехступенчатая

Вилка 42 дюйма

Двигатель Mitsubishi PSI 2,4 л

Каскадный боковой переключатель

Двухтопливное топливо — «газ или сжиженный газ»

Максимальный MFR FGL30T-AWG3 FL2112

Мачта трехступенчатая

Вилка 42 дюйма

Двигатель Mitsubishi PSI 2,4 л

Каскадный боковой переключатель

Двухтопливное топливо — «газ или сжиженный газ»

Максимальный MFR FGL35T-AWG3 FL2026

Мачта трехступенчатая

Вилка 42 дюйма

Двигатель Mitsubishi PSI 2,4 л

Каскадный боковой переключатель

Двухтопливное — «газ или сжиженный газ»

Максимальный MFR FB25-AJZ FL1648

Мачта трехступенчатая

Вилка 42 дюйма

Каскадный боковой переключатель?

Аккумулятор 48 В и зарядное устройство

Максимальный MFR FD25T-CWE3 FL1852

Два ведущих колеса

Шины пневматические пневматические

Мачта двухступенчатая

Вилка 72 дюйма

Yanmar 4TNE98 двигатель

Коробка передач с переключением под нагрузкой

Максимальный MFR FD35J-C4WE FL1656

Полный привод

Шины пневматические

Мачта трехступенчатая

Вилка 72 дюйма

Yanmar 4TNE98 двигатель

Гидростатическая трансмиссия

Портативный штабелеукладчик ESC15M45-B

Полиуретановые колеса

Мачта трехступенчатая

Вилка 42 дюйма

Регулируемые ножки

Коробка передач ZF

Аккумулятор и зарядное устройство 24 В