Маз 555142 технические характеристики: Ничего не найдено по запросу Tehnika Gruzovie Avto Maz 5551 Harakteristiki Sfera Primeneniya Osnovnyie Parametryi %23Name3

S727-20 шт. Duo Tower Leds 0 3 / 32in Bi-Color White Red

Weed Hemp Canibis Лист марихуаны ANTENNA PENCIL TOPPER MIP. Модель футболки USMC в масштабе 1/6, белая, для фигурки 12 дюймов. Кукольные напольные часы в масштабе 1:12, Trumpeter 1/72 01608 Xian FBC-1 Flying Leopard, X-Men The Movie Джеймс Марсден в роли CYCLOPS Action Figure Marvel 2000 Toy Biz, 12 шт. Волшебные бумажные снежинки Реквизит Игрушка Белый палец снежная буря Магический трюк G, Lego 10 шт. Золотая жемчужная золотая кираса с головой волка 18398pb01 New, 2 гоночные шины S1 5871R Traxxas 1/10 Slash 2WD VXL OBA, фольга Theros English NM-Mint 1 x MTG Thoughtseize, ИГРА Престолов, ГЛАВА ПАКЕТ РАССЕЯННЫЕ АРМИИ.1x Чернокрылый дракон, почти как новый, 1-е издание Common LED3-EN028. Алюминиевая мини-отвертка для гаек 150355 5,5 мм EDS. TOMICA PREMIUM 30 LEXUS LFA Nurburgring Package 1/62 TOMY DIECAST CAR NEW 2018. С музыкальными игрушками Подарки Модель электрического самолета Звук Вспышка Light Airbus A380. РЫЦАРИ ЭЛЛЮЗИОНИСТОВ КРАСНЫЕ ИГРЫ КАРТЫ ПАЛУБА МЭДИСОН РЭМСЕЙ ШАХМАТЫ МАГИИ НОВИНКА. Disney «Русалочка Камбала и Себастьян» Плюшевый набор «Чучела животных», «НАГРУЗКА НА ПЛОСКИЙ АВТОМОБИЛЬ В МАСШТАБЕ N» 1: 160 4. Hobby Master 1:72 ROF Centurion 6th Royal Tank Rgt Nasser’s Nightmare HG3512.Jet Creations GTO-12MOON Inflatable Moon Toy БЕСПЛАТНЫЙ корабль на 2 дня, НОВИНКА S.H.Figuarts Kinnikuman WARSMAN ORIGINAL COLOR EDITION Фигурка BANDAI. Ziterdes 25/28 мм Неокрашенная жесткая поролоновая башня Сторожевая башня Nalog Ruin, MagiDeal 1: 6 Гибкая женская кукла с маленькими бюстами, бесшовное боди, бедро, жилет, платье,

Новый и общий неоантиген, полученный из мутации гистона 3 варианта h4.3K27M для Т-клеточной терапии глиомы

Abstract

Средняя общая выживаемость детей с диффузной внутренней глиомой моста (DIPG) составляет менее одного года.Большинство диффузных глиом средней линии, включая более 70% DIPG, несут аминокислотную замену лизина (K) на метионин (M) в положении 27 гистона 3 варианта 3 (h4.3). Из клона Т-клеток CD8 ⁺ , полученного путем стимуляции Т-клеток HLA-A2 ⁺ CD8 ⁺ синтетическим пептидом, содержащим мутацию h4.3K27M, комплементарная ДНК для α- и β-цепей Т-клеточного рецептора (TCR) были клонированы в ретровирусный вектор. Трансдуцированные TCR Т-клетки HLA-A2 ⁺ эффективно убивали HLA-A2 ⁺ h4.Клетки глиомы 3K27M ⁺ антиген- и HLA-специфическим образом. Адоптивный перенос Т-клеток, трансдуцированных TCR, значительно подавлял прогрессирование ксенотрансплантатов глиомы у мышей. Анализы с аланиновым сканированием предполагают отсутствие известных белков человека, имеющих общие ключевые аминокислотные остатки, необходимые для распознавания TCR, предполагая, что TCR можно безопасно использовать у пациентов. Эти данные дают нам прочную основу для разработки терапии на основе Т-клеток, направленной на этот общий неоэпитоп.

Введение

Злокачественные глиомы, включая глиобластому и диффузную срединную глиому (DMG), являются летальными опухолями головного мозга как у взрослых, так и у детей (Louis et al., 2016). Действительно, опухоли головного мозга являются ведущей причиной связанной с раком смертности и заболеваемости у детей (Brain Tumor Progress Review Group, 2000). У детей с DIPG коэффициент выживаемости без прогрессирования в течение 1 года составляет менее 25%, а средняя общая выживаемость составляет 9–10 месяцев при текущем лечении (Kebudi and Cakir, 2013; Schroeder et al., 2014).

Концепция иммунотерапии рака основана на представлении о том, что иммунная система человека может распознавать антигены, происходящие от рака, как «чужие». В недавних испытаниях иммунотерапии рака опасные для жизни и смертельные события были вызваны попаданием в цель (Johnson et al., 2009; Morgan et al., 2010; Parkhurst et al., 2011) или за пределами цели (Cameron et al., 2013; Morgan et al., 2013) перекрестная реактивность Т-клеток против нормальных клеток. Эти наблюдения подчеркивают необходимость расширения списка доступных опухолеспецифических антигенов, таких как антигены, происходящие от мутаций (т.е., неоантигены), для безопасной и эффективной иммунотерапии. Хотя список антигенов, которые могут быть использованы для иммунотерапии глиомы, расширился за последнее десятилетие (Okada et al., 2009; Reardon et al., 2013), действительно не так много антигенов, действительно специфичных для глиомы, за исключением тех, которые происходят из эпидермальных рецептор фактора роста vIII (EGFRvIII; Thorne et al., 2016) и мутантная изоцитратдегидрогеназа 1 (IDh2; Schumacher et al., 2014).

Недавние генетические исследования показали, что злокачественные глиомы у детей и молодых людей часто обнаруживают соматические миссенс-мутации в варианте 3 гистона h4.3 (h4.3; Schwartzentruber et al., 2012). Большинство DMG и более 70% случаев DIPG (Khuong-Quang et al., 2012) содержат аминокислотную замену лизина (K) на метионин (M) в положении 27 h4.3 (мутация h4.3K27M) . Мутация h4.3K27M в DMG приводит к глобальному снижению h4K27me3, что приводит к подавлению мишеней репрессивного комплекса 2 polycomb (PRC2), тем самым вызывая аберрантную экспрессию гена (Jones and Baker, 2014). Пациенты с h4.3K27M ⁺ DIPG обычно имеют более короткое время выживания, чем пациенты с немутантным h4.3 (h4.3WT; Khuong-Quang et al., 2012).

Мы обсуждаем здесь идентификацию HLA-A * 02: 01-ограниченного эпитопа CTL CD8 ⁺ , включающего мутацию h4.3K27M. Кроме того, мы клонировали кДНК для α- и β-цепей TCR, полученных из h4.3K27M-специфичного клона Т-клеток CD8 ⁺ . TCR связывается с комплексом HLA-A * 02: 01-пептид с превосходным уровнем сродства, и HLA-A * 02: 01 ⁺ донорские Т-клетки, трансдуцированные с помощью TCR, распознают и лизируют HLA-A * 02: 01 ⁺ h4.Клетки глиомы 3K27M ⁺ мутационно- и HLA-специфическим образом. Важно отметить, что анализы сканирования аланина продемонстрировали, что не существует известных белков человека, которые разделяют набор ключевых аминокислотных остатков для распознавания TCR. Наши данные убедительно подтверждают разработку стратегий иммунотерапии на основе Т-клеток, трансдуцированных вакцинами и TCR, у пациентов с глиомами h4.3K27M ⁺ .

Результаты

Пептид h4.3K27M связывается с HLA-A * 02: 01

Используя сервер NetMHC 3.4 (http: // www.cbs.dtu.dk/services/NetMHC/), основанный на искусственной нейронной сети биоинформатический инструмент для прогнозирования связывания пептидов с молекулами MHC HLA класса I, мы предсказали, что декамерный (10-мерный) пептид h4.3K27M _{26– 35} , охватывающая остатки 26–35 последовательности h4.3 и включающая мутацию K27M (пептид h4.3K27M), будет связывать HLA-A * 02:01 с высокой аффинностью. Интересно, что у немутантного аналога h4.3WT _26–35 не было предсказано высокое сродство к HLA-A * 02:01 (далее h4.Пептид 3WT; ). Чтобы подтвердить эти прогнозы, мы измерили связывание синтетических пептидов с очищенным HLA-A * 02: 01 с использованием анализа конкурентного ингибирования. В соответствии с предсказаниями NetMHC 3.4 мы обнаружили, что пептид h4.3K27M, но не h4.3WT, связывал HLA-A * 02: 01 с высокой аффинностью (). Мы также расширили наш анализ связывания на HLA-A * 02: 02, A * 02: 03, A * 02: 06, A * 02: 07 и A * 02: 17 и обнаружили, что пептид h4.3K27M слабо связан с A * 02: 03 (полумаксимальная ингибирующая концентрация [IC ₅₀ ] 747 нМ), но ни один из других оцениваемых подтипов HLA-A2 этого не сделал (таблица S1).

Таблица 1.

HLA-A * 02: 01-аффинность связывания h4.3K27M _26–35 мутант по сравнению с h4.3WT _26–35 немутантных пептидов

Пептид h4.3K27M индуцирует специфические Т-клеточные ответы в HLA-A2

Чтобы оценить, вызывает ли эпитоп h4.3K27M антиген-специфический ответ в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) пациентов с DIPG, мы стимулировали образцы PBMC, полученные от трех HLA-A * 02: 01 ⁺ пациентов с DIPG и три HLA-A * 02: 01 ⁺ здоровых доноров in vitro с h4.3WT, h4.3K27M, белок матрикса гриппа M1 _58–66 пептид (далее пептид гриппа) или без пептида в течение 1 недели и проводили анализ ELISPOT IFN-γ после совместного культивирования с клетками T2, нагруженными h4.3WT, h4.3K27M , или пептид гриппа. У всех трех пациентов, но ни у одного из здоровых доноров, PBMC, стимулированные пептидом h4.3K27M, показали антиген-специфическое увеличение пятен IFN-γ при совместном культивировании с клетками T2, нагруженными пептидом h4.3K27M (). С другой стороны, PBMC, стимулированные h4.3WT, демонстрировали только фоновые или значительно более низкие уровни IFN-γ по сравнению с h4.3K27M-стимулированные PBMC. Хотя PBMC от пациента 1 продемонстрировали более высокие фоновые уровни, чем у других доноров, PBMC, стимулированные h4.3K27M, показали значительно более высокие уровни продукции IFN-γ при совместном культивировании с нагруженными h4.3K27M клетками T2 по сравнению с другими условиями. PBMC, стимулированные пептидом гриппа, служили положительным контролем в этом анализе. Эти результаты предполагают, что глиомы h4.3K27M ⁺ могут вызывать спонтанные Т-клеточные ответы CD8 ⁺ у пациентов с HLA-A * 02: 01 ⁺ , но уровень ответов недостаточен для предотвращения развития опухоли.

Пептид h4.3K27M индуцирует Т-клеточные ответы у пациентов с DIPG и приводит к выделению h4.3K27M-специфичных клонов CTL из HLA-A2 ⁺ донорных PBMC. (A) PBMC, полученные от пациентов и здоровых доноров, стимулировали h4.3WT, h4.3K27M и пептидом гриппа или без пептида и совместно культивировали с клетками T2, обработанными h4.3WT, h4.3K27M и пептидом гриппа. или без пептида. Количество пятен IFN-γ на 5 × 10 ⁴ Т-клеток, генерируемых в каждом условии стимуляции. Показанные подсчеты нормализованы к контролю без пептидной стимуляции.Столбики и столбики ошибок представляют собой медианное значение и стандартное отклонение, соответственно, для пятен IFN-γ на 5 × 10 ⁴ Т-клеток, наблюдаемых в каждом условии стимуляции. n = 3 в каждой группе. Эксперимент проводился один раз. *, P <0,05; **, P <0,01 по тесту Стьюдента t при сравнении групп стимуляции h4.3WT и h4.3K27M. нс, не имеет значения. (B) HLA-A * 02: 01 ⁺ здоровых донорских PBMC стимулировали in vitro пептидом h4.3K27M и оценивали на реактивность против HLA-A * 02: 01-h4.3K27M-специфический тетрамер и mAb против CD8 с использованием проточной цитометрии (с гейтированием на живых лимфоцитах). Гейт Tetramer ⁺ был основан на контрольных Т-клетках. Популяция Tetramer ^high (2,42%) представляла популяцию высокоаффинных CTL. (C) Клоны CTL были получены путем сортировки в потоке с последующим клонированием с ограниченным разведением тетрамера ^high CD8 ⁺ Т-клеток. Клон 1H5 был выбран для дальнейшего исследования на основании его превосходной реакционной способности к тетрамеру. Точечная диаграмма демонстрирует, что клон 1H5 сохраняет уровни реактивности по отношению к HLA-A * 0201 / h4.Тетрамер, специфичный для 3К27М. (D) Гистограмма, представляющая продукцию IFN-γ из клона Т-клеток 1H5, измеренную с помощью ELISA, после совместного культивирования с клетками T2, обработанными пептидом h4.3K27M в титруемых концентрациях или пептидом h4.3WT (5 мкг / мл). Данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. Столбики и столбики ошибок представляют собой медианное значение и стандартное отклонение, соответственно, для уровней продукции IFN-γ. **, P <0,01 с использованием тестов Стьюдента t , сравнивающих 5 мкг / мл пептидов h4.3WT и h4.3K27M.

Затем мы стимулировали HLA-A * 02: 01 ⁺ PBMC, полученные от здоровых доноров, синтетическим пептидом h4.3K27M in vitro в течение четырех недельных циклов и оценили индукцию CD8 ⁺ Т-клеток, способных связываться с HLA. -A * 02: 01-h4.3K27M _26–35 тетрамер. Как показано в, мы обнаружили, что> 60% Т-клеток CD8 ⁺ связываются с тетрамером. Кроме того, субпопуляция Т-клеток CD8 ⁺ тетрамера ⁺ в культуре показала отчетливо более высокие уровни связывания с тетрамером (тетрамер ^{, высокая популяция} ; 2.4% клеток CD8 ⁺ ; ). Среди нескольких клонов CD8 ⁺ Т-клеток, установленных путем ограниченного разведения субпопуляции CTL тетрамера ^{с высоким уровнем} , мы выбрали клон 1H5 для последующих исследований из-за его превосходной реакционной способности тетрамера (). Клон 1H5 также продемонстрировал зависимое от дозы пептидное увеличение продукции IFN-γ при стимуляции клетками HLA-A * 02: 01 ⁺ T2, нагруженными мутантным пептидом h4.3K27M, но не пептидом h4.3WT ().

Пептид h4.3K27M представлен как HLA-A * 02: 01

Чтобы исследовать, продуцируется ли биоинформатически предсказанный пептид h4.3K27M _26–35 и презентируется ли механизмом HLA в клетках глиомы HLA-A * 02: 01 ⁺ h4.3K27M ⁺ , мы использовали недавно разработанный метод на основе масс-спектрометрии (МС) для прямой идентификации пептидов, связывающих HLA класса I (Bassani-Sternberg et al., 2015). Мы очистили HLA-связывающие пептиды класса I из клеток глиомы HLA-A * 02: 01 ⁺ h4.3K27M ^— U87MG, стабильно трансдуцированных кДНК, кодирующей h4.3K27M (U87h4.3K27M), h4.3WT (U87h4.3WT) или родительские клетки U87MG (Таблица S3) и проанализировали их с помощью ЖХ-МС / МС с использованием квадрупольного масс-спектрометра Orbitrap. Чтобы специфически идентифицировать пептид h4.3K27M _26–35 , мы добавляли фиксированное количество синтетической версии 10-мера h4.3K27M _26–35 к каждому образцу, содержащему замену аргинина в положении 1 на тяжелый аналог (13C6 15N4 аргинин), таким образом вводя разницу масс 10,0083-D. При таком подходе тяжелый меченый пептид легко секвенировали и идентифицировали из-за его более высокого содержания во время анализа ЖХ-МС / МС.Поскольку как тяжелые, так и легкие пептиды элюируются из хроматографической колонки одновременно и различаются исключительно введенным изменением массы, можно было уверенно идентифицировать эндогенный пептид даже при чрезвычайно низких концентрациях и в отсутствие спектра МС / МС. После перекалибровки в MaxQuant мы обнаружили две модели соэлюирующих изотопов с отношениями массы к заряду ( m / z ) 494,7420 и 489,7394 при 27,74 мин хроматографического разделения в U87h4.Клетки глиомы 3K27M (). Это соответствовало прогнозируемым значениям как для тяжелых, так и для эндогенных пептидов h4.3K27M _26–35 в их окисленных формах (494,7414 и 489,7373, соответственно) с относительной разницей масс 10,0052 D. Пик элюции, соответствующий тяжелому пептиду, составлял был выбран несколько раз для секвенирования, и его спектр фрагментации был однозначно идентифицирован как окисленная форма тяжелого h4.3K27M (идентификационная оценка Андромеды 124,23;). Предполагаемая картина легких изотопов представила правильные значения m / z для каждого из ее изотопных пиков ().Более того, этот изотопный паттерн обнаруживался исключительно в клетках U87h4.3K27M, но не в родительских клетках U87 или U87h4.3WT (не изображены). Наблюдаемая модификация обоих пептидов вызвана окислением остатка метионина во время приготовления экспериментального образца и, следовательно, не отражает состояние пептида in vivo (Lagerwerf et al., 1996). Вместе эти наблюдения демонстрируют, что эпитопный пептид h4.3K27M _26–35 естественно продуцируется и презентируется HLA класса I на поверхности клеток глиомы, трансфицированных h4.КДНК 3K27M.

Пептид h4.3K27M обнаруживается с помощью LC-MS / MS в иммунопептидоме HLA класса I клеток глиомы, несущих мутацию h4.3K27M . Пептиды HLA класса I были биохимически очищены из клеток глиомы U87h4.3K27M и проанализированы с помощью LC-MS / MS с синтетической тяжелой версией пептида h4.3K27M в качестве сравнения. (A) U87h4.3K27M Иммунопептидом HLA класса I демонстрирует две схемы соэлюирования изотопов, соответствующие целевому m / z и разнице масс окисленных форм тяжелого и эндогенного h4.Пептиды 3К27М. (B) Спектр фрагментации тяжелого пика, показывающий идентификацию окисленного тяжелого пептида h4.3K27M. (C) Увеличенное изображение картины легких изотопов показывает m / z значений и расстояния между пиками, как и ожидалось от эндогенного пептида h4.3K27M. Этот эксперимент проводился один раз.

Человеческие Т-клетки, трансдуцированные ретровирусным вектором, кодирующим h4.3K27M-специфический TCR, демонстрируют h4.3K27M-специфическую реактивность CTL

Мы выделили полноразмерную кДНК для α- и β-цепей TCR из клона 1H5, оптимизировали использование кодонов и клонировали их в систему ретровирусных векторов TCR, которая включает siRNA, нацеленные на константные области эндогенных α- и β-цепей TCR, чтобы избежать неправильного спаривания между эндогенными и трансгенными цепями TCR (; Okamoto et al., 2009, 2012). Чтобы оценить функцию трансгена TCR, особенно в отношении коэкспрессии CD8, мы трансдуцировали клон 76 Т-клеток Jurkat (J76CD8 ^—), который лишен эндогенного CD8, а также α- и β-цепей TCR (Heemskerk et al., 2003), и клон 76 Т-клеток Jurkat, трансфицированный CD8 (J76CD8 ⁺ ), с вектором TCR. Затем трансдуцированные TCR клетки J76CD8 ^+/- совместно культивировали с клетками T2, обработанными h4.3WT, h4.3K27M или нерелевантным пептидом гриппа. Трансдуцированные TCR клетки J76CD8 ⁺ продуцировали значительно более высокие уровни IL-2 в ответ на h4.Пептид 3K27M по сравнению со всеми другими группами, что указывает на h4.3K27M-специфическую и CD8-зависимую реактивность TCR ().

Клонирование кДНК для h4.3K27M-специфичного TCR и конструирование ретровирусного вектора для эффективной трансдукции человеческих Т-клеток. (A) Схема дизайна ретровирусного вектора TCR. Синтезированные фрагменты кДНК TCR, полученные из CD8 ⁺ Т-клеточного клона 1H5, вставляли в сайт NotI / XhoI векторной плазмиды Takara siTCR вместе с последовательностью Козака, спейсерной последовательностью (SP) и последовательностью P2A. (B) Клетки T2, нагруженные или без h4.3K27M, h4.3WT или нерелевантного матрикса гриппа M1 _58–66 пептид гриппа (10 мкг / мл) совместно культивировали либо с контролем, либо с TCR-трансдуцированным Jurkat76CD8 ⁺ или Jurkat76CD8 ^— в соотношении 1: 1 и оценивали продукцию IL-2 с помощью ELISA. Данные представляют собой три независимых эксперимента с аналогичными результатами. Столбцы и планки ошибок представляют собой медианное значение и стандартное отклонение, соответственно, для уровней IL-2 ( n = 3 в каждой группе). *, Р <0.05 по тесту Стьюдента t по сравнению с каждой из других групп. (C) PBMC человека трансдуцировали ретровирусным вектором TCR, а Т-клетки CD3 ⁺ оценивали на эффективность трансдукции в популяциях Т-клеток CD8 ⁺ и CD8 ^— с помощью специфического тетрамера. Из 51% Т-клеток CD8 ⁺ 22,5% были тетрамером ⁺ , а из 49% Т-клеток CD4 ⁺ 13,4% были тетрамером ⁺ . (D) TCR-трансдуцированные или ложно-трансдуцированные первичные человеческие CD4 ⁺ или CD8 ⁺ Т-клетки совместно культивировали с клетками Т2, нагруженными h4.3K27M, h4.3WT или пептид гриппа в соотношении 1: 1 в течение ночи для ELISPOT IFN-γ. Столбики и столбики ошибок представляют собой медианное значение и стандартное отклонение, соответственно, для количества пятен IFN-γ / 5 × 10 ⁴ Т-клеток в трех повторностях. **, P <0,01 по тесту Стьюдента t , сравнивающему TCR-трансдуцированные CD8 ⁺ с TCR-трансдуцированными CD4 ⁺ T-клетками и h4.3WT с h4.3K27M пептид-стимулированными группами для TCR-трансдуцированных CD8 ⁺ Т-клеток. Данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. (E) TCR-трансдуцированные или ложно-трансдуцированные CD8 ⁺ Т-клетки совместно культивировали с T2-клетками, обработанными h4.3WT, h4.3K27M или пептидом гриппа в соотношении 1: 1, с последующей оценкой CD69 выражение. Столбики и планки ошибок представляют собой медианное значение и стандартное отклонение соответственно для процентного содержания клеток CD69 ⁺ среди Т-клеток CD8 ⁺ ( n = 3 в каждой группе). Данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. *, P <0,05 по критерию Стьюдента t по сравнению с каждой из других групп.

Затем мы трансдуцировали первичные Т-клетки человека с помощью TCR и достигли эффективности трансдукции> 40% в Т-клетках CD8 ⁺ и ~ 20% в Т-клетках CD4 ⁺ на основе окрашивания тетрамером, что свидетельствует о важности корецептора CD8. для эффективного выражения TCR (). Чтобы оценить функциональность TCR в первичных Т-клетках человека, а также потребность корецептора CD8 для функционального ответа, Т-клетки CD4 ⁺ и Т-клетки CD8 ⁺ одновременно трансдуцировали TCR и совместно культивировали с T2. клетки пульсируют с h4.3K27M, h4.3WT или пептид гриппа и продукцию IFN-γ оценивали с помощью ELISPOT (). T-трансдуцированные TCR CD8 ⁺ T-клетки продуцировали значительно большее количество IFN-γ пятен, чем TCR-трансдуцированные CD4 ⁺ T-клетки при стимуляции пептидом h4.3K27M. Более того, реакция TCR-трансдуцированных Т-клеток CD8 ⁺ была специфичной к пептиду h4.3K27M, поскольку эти клетки продуцировали значительно большее количество пятен IFN-γ в ответ на пептид h4.3K27M по сравнению с h4.3WT, пептидом гриппа, или без пептида ().Однако, хотя и не на статистически значимых уровнях, мы наблюдали тенденцию к тому, что TCR-трансдуцированные Т-клетки CD8 ⁺ продуцировали повышенное количество пятен IFN-γ по сравнению с ложно-трансдуцированными Т-клетками CD8 ⁺ против Т2-клеток, нагруженных h4.3WT. пептид (P = 0,254). Хотя концентрация пептида была явно супрафизиологической (10 мкг / мл), это наблюдение должно напомнить нам о теоретической возможности внеопухолевой реактивности.

Мы также наблюдали значительную повышающую регуляцию маркера активации Т-клеток, CD69 (Werfel et al., 1997), на TCR-трансдуцированных T-клетках CD8 ⁺ , но не на ложно-трансдуцированных T-клетках, стимулированных пептидом h4.3K27M, но не h4.3WT или нерелевантным пептидом гриппа (). Ложно-трансдуцированные Т-клетки получали тем же способом активации, что и Т-клетки, трансдуцированные TCR, с использованием антитела против CD3 и RetroNectin, как подробно описано в разделе «Материалы и методы».

Данные сканирования аланина предполагают отсутствие известных белков человека, которые имеют общие иммуногенные аминокислотные остатки эпитопа h4.3K27M.

Для обеспечения специфичности и безопасности h4.Подход к нацеливанию на 3K27M, важно определить ключевые аминокислотные остатки в эпитопе h4.3K27M, которые отвечают за реактивность TCR. Это позволяет прогнозировать и оценивать перекрестную реактивность по отношению к другим эпитопам, полученным из белков, присутствующих в нормальных клетках. С этой целью мы выполнили аланин-сканирующий мутагенез эпитопа h4.3K27M путем введения одиночных мутаций аланина (всего 10) в каждое положение внутри декамерного эпитопа h4.3K27M. Таким образом, мы приготовили 10 уникальных синтетических пептидов, каждый из которых содержал конкретную аминокислотную замену аланином (A1 – A10), и оценили, влияет ли замена на стабильность связывания пептида с HLA-A * 02: 01 ().Когда связывание было уменьшено за счет замены по сравнению с эпитопом h4.3K27M, это предполагает, что замещенный остаток был критическим для связывания HLA-A * 02: 01 эпитопа. Соответственно, замены в положении 2 и на С-конце были связаны с> 20-кратным снижением связывающей способности, что согласуется с тем, что эти положения являются каноническими первичными якорями HLA-A * 02: 01. Снижение в 10–20-кратном диапазоне также было отмечено в положениях 1, 4, 6, 7 и 9, предполагая, что они также могут действовать как вторичные контакты MHC.

Аланиновый сканирующий мутагенез определяет ключевые аминокислотные остатки в эпитопе h4.3K27M, необходимые для распознавания TCR . Одиночные мутации аланина (всего 10) были введены в каждый аминокислотный остаток в эпитопе h4.3K27M (10-мерный). Таким образом, оценивали 10 синтетических пептидов, каждый из которых содержал специфическую замену на аланин (A1 – A3 и A5 – A10) или валин (A4). Кроме того, синтетические пептиды, разработанные для немутантного пептида h4.3WT и цитруллинированного h4.3K27M (Cit h4.3; т.е. первая аминокислота эпитопа h4.3K27M была заменена цитруллином). (A) Относительную аффинность связывания HLA-A * 0201 каждого пептида с аффинностью h4.3K27M определяли с помощью анализа бесклеточного связывания. Этот эксперимент проводился один раз. (B) Клетки J.RT3-T3.5 трансдуцировали h4.3K27M-специфическим TCR и оценивали продукцию IL-2 в ответ на клетки T2, нагруженные каждым пептидом (10 мкг / мл). Каждую группу анализировали в трех экземплярах. Столбцы и столбики ошибок представляют собой медианное значение и стандартное отклонение соответственно для уровней продукции IL-2.Данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. * P <0,05 рассчитывали с использованием теста Стьюдента t , сравнивая каждый пептид с мутантом h4.3.

Затем мы оценили продукцию IL-2 как показатель функциональности TCR-трансдуцированных клеток при совместном культивировании с T2-клетками, загруженными каждым из измененных пептидов (). Аминокислоты, замены которых приводят к снижению продукции IL-2, имеют решающее значение для распознавания TCR. Как аффинность связывания HLA (), так и реактивность TCR, определенная по продукции IL-2 (), последовательно показали, что аминокислоты в положениях 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 и 10 имеют решающее значение для распознавания и функции TCR.Используя NCBI BLAST 2.7.0, мы запросили «RMXAXSTGGV» (остатки 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 и 10) в базе данных белков Homo Sapiens Protein Data Bank и не обнаружили известных человеческих белков, содержащих одинаковые аминокислотные остатки. Мы расширили наш поиск, чтобы найти белки с аминокислотными мотивами, которые гомологичны ключевым аминокислотным остаткам (Таблица S2). Неудивительно, что относительно высокая гомология была обнаружена в белках семейства гистонов h4 и PRC2, но не в других белках. Основываясь на данных сканирования аланина, эти белки вряд ли будут нацелены на TCR.

TCR, специфичный для h4.3K27M, не распознает немутантный, деиминированный эпитоп h4.3K27M или производный от h4.1 пептид K27M

В соответствии с нашими данными в и, пептид h4.3WT не связывает и не вызывает IL-2 производство TCR (). В результате естественного процесса деструкции гистоновый аргинин может превращаться в цитруллин, включая остаток аргинина в эпитопе h4.3K27M (то есть деэлиминирование; Cuthbert et al., 2004). Таким образом, полезно определить, может ли деструкция повлиять на иммуногенность h4.Эпитоп 3К27М. С этой целью мы оценили, является ли h4.3K27M-специфический TCR реактивным по отношению к деиминированному эпитопу h4.3K27M, используя синтетический пептид, в котором остаток аргинина эпитопа h4.3K27M заменен цитруллином (Cit h4.3;). Хотя пептид Cit h4.3 частично сохраняет свое сродство к HLA-A * 02: 01 (), он полностью отменяет продукцию IL-2 трансдуцированными TCR клетками Jurkat, что указывает на то, что TCR не распознает пептид Cit h4.3.

Субпопуляция пациентов с глиомой несет мутацию K27M в h4.1 (гомолог h4.3; Jones and Baker, 2014). Мутации h4.1K27M обнаруживаются в> 20% случаев DIPG и 5% случаев DMG и тесно связаны с более молодым возрастом (Jones and Baker, 2014). Аминокислотные последовательности, охватывающие мутацию K27M в h4.1 и h4.3, аналогичны. По сравнению с эпитопом h4.3K27M, соответствующая часть h4.1 имеет только одну аминокислотную замену в шестом положении в 10-мерном пептиде и, следовательно, идентична пептиду A6 при сканировании аланина. Как связывание (), так и продукция IL-2 () были отменены в случае A6, что позволяет предположить, что пациенты с h4.Мутация 1K27M, но без мутации h4.3K27M не подходят для проспективной адоптивной терапии, трансдуцированной TCR.

Характеристика аффинности и функциональной авидности TCR

Для определения аффинности TCR с комплексом h4.3K27M-HLA-A2 мы провели анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием рекомбинантного TCR и h4.3K27M-HLA- Комплекс А2, который был продуцирован in vitro фолдингом из бактериальных телец включения. Как показано на, мы получили константу диссоциации ( K _D ), равную 2.9 мкМ. Примечательно, что этот уровень аффинности существенно выше, чем у большинства TCR, направленных против раковых антигенов, и сопоставим с уровнем хорошо охарактеризованных TCR против пептидов, происходящих от инфекционных патогенов (Aleksic et al., 2012).

Оценка авидности TCR к комплексу HLA-A2-пептид. (A и B) SPR-анализ связывания TCR и h4.3K27M-HLA-A2. (A) h4.3K27M TCR в концентрациях 14, 7, 3,5, 1,75, 0,9, 0,45, 0,23, 0,12 и 0 мкМ вводили поверх иммобилизованного h4.3К27М-HLA-A2 (500 резонансных единиц [RU]). (B) Подгонянная кривая для равновесного связывания, которая дала K _D 2,9 мкМ. Данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. (C) T2-клетки (5 × 10 ⁴ / лунка), нагруженные титрованными концентрациями пептида h4.3K27M, культивировали совместно с TCR-трансдуцированными CD4 ⁺ или CD8 ⁺ T-клетками, полученными от трех доноров. (5 × 10 ⁴ / лунку) и оценивали с помощью ELISPOT IFN-γ. ЕС ₅₀ пептида рассчитывали с использованием нелинейного регрессионного анализа.Каждый эксперимент проводился в трех экземплярах, и данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. (D) Клетки T2 пульсировали 10 мкг / мл h4.3WT, h4.3K27M, пептидом гриппа или без пептида, а HLA-A2 ^neg h4.3K27M ⁺ Клетки HSJD-DIPG019 пульсировали 10 мкг / мл пептида h4.3K27M. Эти клетки совместно культивировали с CD4 ⁺ или CD8 ⁺ TCR-трансдуцированными Т-клетками и оценивали с помощью IFN-γ ELISPOT. Столбцы и столбцы ошибок представляют собой медианное значение и стандартное отклонение соответственно для пятен IFN-γ.Данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. Эксперименты проводили в трех повторностях. ***, P <0,001 по тесту Стьюдента t , сравнивающему группу T2 / h4.3K27M со всеми другими условиями стимуляции для групп CD8 ⁺ Т-клеток.

Чтобы оценить функциональную авидность TCR, мы определили концентрацию пептида, необходимую для индукции полумаксимального ответа (EC ₅₀ ) на продукцию IFN-γ трансдуцированными TCR CD8 ⁺ и CD4 ⁺ T-клетками. получены от трех здоровых доноров HLA-A * 02: 01 ⁺ .Мы определили, что ЕС ₅₀ TCR-трансдуцированных CD8 ⁺ Т-клеток составляет от 10 ^-8 до 10 ^-9 М на основе анализа IFN-γ ELISPOT с клетками Т2, нагруженными титрующими дозами h4. Пептид 3К27М (). Примечательно, что Т-клетки CD4 ⁺ , трансдуцированные TCR, показали гораздо меньшее количество пятен IFN-γ, что свидетельствует о необходимости корецептора CD8 для функционального ответа. Ответ TCR-трансдуцированных T-клеток CD8 ⁺ был специфичен к пептиду h4.3K27M, представленному на HLA-A2, что продемонстрировано отсутствием ответа с T2-клетками, нагруженными пептидом гриппа (10 мкг / мл) и HLA-A2– отрицательные клетки HSJD-DIPG-019, нагруженные h4.Пептид 3К27М (10 мкг / мл;). Однако, как мы также отметили в наборе данных, Т-клетки CD8 ⁺ , трансдуцированные TCR, продуцировали небольшое количество пятен IFN-γ против клеток T2, нагруженных 10 мкг / мл пептида h4.3WT (P = 0,1000 по сравнению с группой Т2 клетки без пептида).

TCR-трансдуцированные T-клетки специфически лизируют h4.3K27M

Важно продемонстрировать, что TCR-трансдуцированные T-клетки способны распознавать эндогенный эпитоп h4.3K27M. экспрессируется в клетках глиомы и лизирует h4.3K27M ⁺ HLA-A * 02: 01 ⁺ клетки глиомы. С этой целью мы оценили цитотоксическую активность TCR-трансдуцированных Т-клеток против трех клеточных линий h4.3K27M ⁺ DIPG, HLA-A * 02: 01 ⁺ HSJD-DIPG-017, HLA-A * 02: 01 ⁺ HSJD-DIPG-021 и HLA-A * 02: 01 ^neg HSJD-DIPG-019, с использованием анализа цитотоксичности на основе обнаружения лактатдегидрогеназы (LDH) (Таблица S3). Хотя T-клетки, трансдуцированные TCR, и трансдуцированные ложно Т-клетки были одинаково активированы, только T-клетки, трансдуцированные TCR, лизировали клетки HLA-A * 02: 01 ⁺ HSJD-DIPG-017 и HSJD-DIPG-021 ().Наблюдаемый лизис зависел от HLA-A * 02: 01, поскольку Т-клетки, трансдуцированные TCR, не были способны лизировать клетки HSJD-DIPG-019 даже в присутствии экзогенно добавленного пептида h4.3K27M (). После стабильной трансдукции HLA-A * 02: 01 клетки HSJD-DIPG019 стали восприимчивыми к цитотоксическому эффекту TCR-трансдуцированных Т-клеток (), что указывает на HLA-A * 02: 01-зависимый лизис клеток DIPG, экспрессирующих физиологические уровни х4.3К27М. Чтобы продемонстрировать, что реактивность Т-клеток, трансдуцированных TCR, специфична к h4.3K27M мы использовали клетки глиомы HLA-A * 02: 01 ⁺ h4.3K27M ^neg U87MG, которые стабильно трансдуцировались кДНК, кодирующей h4.3K27M (U87h4.3K27M) или h4.3WT (U87h4.3WT;). Трансдуцированные TCR Т-клетки эффективно лизировали клетки U87h4.3K27M, но не клетки U87h4.3WT. Лизис клеток U87h4.3K27M усиливался, когда синтетический пептид h4.3K27M был добавлен, но аннулирован блокирующим антителом против HLA-A2. С другой стороны, Т-клетки, трансдуцированные TCR, лизировали клетки U87h4.3WT только при загрузке синтетическим пептидом h4.3K27M ().В качестве дополнительного метода подтверждения специфической цитотоксичности h4.3K27M и HLA-A * 02: 01 Т-клеток, трансдуцированных TCR, мы использовали клетки-мишени, окрашенные карбоксифлуоресцеином сукцинимидиловым эфиром (CFSE) (U87h4.3K27M и U87h4.3WT) в совместным культивированием и оценили экспрессию 7-аминоактиномицина D (7-AAD) на клетках-мишенях CFSE ⁺ в качестве раннего маркера гибели клеток (Lecoeur et al., 2001;). Наши результаты подтвердили результаты, полученные с помощью анализа на основе ЛДГ. Эти результаты показывают, что Т-клетки, трансдуцированные TCR, способны распознавать h4.Эпитоп 3K27M, который процессируется и презентируется клетками глиомы h4.3K27M ⁺ HLA-A * 02: 01 ⁺ и специфически лизирует эти клетки глиомы.

TCR-трансдуцированные Т-клетки лизируют клетки глиомы h4.3K27M ⁺ HLA-A2 ⁺ HLA-A * 0201- и h4.3K27M-зависимым образом. (A – E) Цитотоксичность TCR-трансдуцированных Т-клеток оценивали с помощью анализа цитотоксичности LDH. Экзогенный синтетический пептид h4.3K27M (10 мкг / мл) добавляли в качестве группы положительного контроля для реактивности TCR для каждой клеточной линии.В некоторых экспериментах добавляли HLA-A2-блокирующие антитела для определения HLA-A2-зависимой реактивности TCR. (A – C) TCR-трансдуцированные или ложно-трансдуцированные Т-клетки культивировали совместно с клетками h4.3K27M ⁺ HLA-A * 0201 ⁺ HSJD-DIPG-017 (A), h4.3K27M ⁺ HLA -A * 0201 ⁺ клетки HSJD-DIPG-021 (B) или контрольный h4.3K27M ⁺ HLA-A * 0201 ^neg клетки HSJD-DIPG-019 (C) при соотношении E / T, равном 1 , 5 и 10 на 24 ч. *, P <0,05; **, P <0,01 на основе теста Стьюдента t , сравнивающего T-клетки, трансдуцированные TCR, с ложно трансдуцированными T-клетками.Каждую группу оценивали в трех экземплярах. Данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. (D) HLA-A * 0201-отрицательные клетки HSJD-DIPG-019 стабильно трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим HLA-A * 0201, и оценивали экспрессию HLA-A2 с помощью проточной цитометрии вместе с другими клеточными линиями. Трансдуцированные TCR или ложно-трансдуцированные Т-клетки культивировали совместно с клетками DIPG017, DIPG019 или DIPG-019-HLA-A2 ⁺ при соотношении Е / Т, равном 5, и цитотоксичность измеряли с помощью анализа ЛДГ. Столбики и столбики ошибок представляют собой медианное значение и стандартное отклонение соответственно для конкретного процента цитотоксичности.*, P <0,05 на основе теста Стьюдента t . Каждую группу оценивали в трех экземплярах, и данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. (E) TCR-трансдуцированные или контрольные Т-клетки культивировали совместно с клетками HLA-A * 0201 ⁺ U87h4.3K27M или клетками U87h4.3WT при соотношении E / T, равном 5. Каждую группу оценивали в трех повторностях. Данные представляют собой три независимых эксперимента с аналогичными результатами. *, P <0,05 на основе теста Стьюдента t . (F) Клетки-мишени, меченные CFSE, культивировали совместно с трансдуцированными TCR или контрольными Т-клетками с экзогенным пептидом или без него при соотношении Е / Т, равном 5.После 24-часовой инкубации клетки окрашивали 7-AAD. % CFSE ⁺ 7-AAD ⁺ клеток показали специфическую процентную цитотоксичность. Каждую группу оценивали в трех экземплярах. Данные представляют собой два независимых эксперимента с аналогичными результатами. *, P <0,05 на основе теста Стьюдента t .

TCR-трансдуцированные Т-клетки значительно ингибируют прогрессирование ксенотрансплантата глиомы h4.3K27M

Для определения доклинической терапевтической активности TCR-трансдуцированных T-клеток in vivo мы вводили 5 × 10 ⁴ U87h4.Люцифераза 3K27M ⁺ в мозг мышей NSG с ослабленным иммунитетом в день 0. На 14 и 30 дни мыши с установленными опухолями получали внутривенные инъекции PBS, 5 × 10 ⁶ контрольных ложно-трансдуцированных Т-клеток или 5 × 10 ⁶ Т-клетки, трансдуцированные TCR. Биолюминесцентная визуализация (BLI) показала значительное снижение опухолевой нагрузки у мышей, получавших TCR-трансдуцированные Т-клетки, но не у мышей, получавших PBS или ложно-трансдуцированные Т-клетки (). После 31 дня, независимо от размера опухоли, у мышей, получавших ложно-трансдуцированные или трансдуцированные TCR Т-клетки, начали проявляться признаки, указывающие на болезнь трансплантат против хозяина, такие как взъерошенный мех, сутулость, медленная подвижность и потеря веса ( не изображен), и поэтому мы не смогли оценить влияние терапии на долгосрочную выживаемость.Тем не менее, в попытке определить накопление TCR-трансдуцированных Т-клеток во внутричерепном ксенотрансплантате, мы убили мышей на 32-й день (2 дня после инфузии Т-клеток) и оценили инфильтрирующие опухоль лимфоциты с помощью HLA-A * 02: 01 -h4.3K27M _26–35 декстрамер, а также моноклональные антитела против CD8 и CD4. Хотя эффективность трансдукции инфузированных клеток CD8 ⁺ и CD4 ⁺ составляла ∼50% и 30% соответственно (), мы обнаружили, что> 80% и 40% человеческих CD8 ⁺ и CD4 ⁺ T клетки, соответственно, были положительны на декстрамер в опухоли.С другой стороны, ~ 10% и 20% Т-лимфоцитов CD8 ⁺ и CD4 ⁺ в периферической крови были положительными по декстрамеру (). Эти данные свидетельствуют о том, что через 2 дня после инфузии Т-клеток имело место избирательное накопление Т-клеток, трансдуцированных TCR, во внутричерепном участке опухоли. Наша оценка присутствия и функции инфузированных Т-клеток в более длительные периоды времени подверглась сомнению из-за регрессии опухоли и связанного с этим исчезновения Т-клеток из мозга (рис. S1). Тем не менее, мы наблюдали трансдуцированные TCR клетки CD4 ⁺ и CD8 ⁺ в селезенке, легких и периферической крови через 10 дней после инфузии.Необходимы дальнейшие исследования с использованием сингенных моделей для оценки точных взаимодействий между TCR-трансдуцированными Т-клетками и окружающей средой хозяина.

Адоптивный перенос TCR-трансдуцированных T-клеток, но не ложно-трансдуцированных T-клеток, приводит к ингибированию внутричерепной глиомы h4.3K27M ⁺ у мышей NSG . Мышам NSG, несущим глиомы интракраниальной люциферазы U87h4.3K27M ⁺ , внутривенно вводили PBS, ложно-трансдуцированные Т-клетки или TCR-трансдуцированные Т-клетки. (A) Рост опухоли представлен как сияние (10 ⁷ p / s / cm ² / r) с использованием BLI.Стрелки указывают дни, когда мышей лечили. Линии и планки погрешностей представляют собой медианное значение и стандартное отклонение, соответственно, для сияния (10 ⁷ п / с / см ² / r) с использованием BLI ( n = 8 на группу). (B) Репрезентативные изображения BLI мышей на 10 и 32 дни после инокуляции опухоли. Фоновые сигналы BLI определяли на основе уровней, наблюдаемых у мышей, не несущих опухоли. (C) Предпочтительное накопление TCR ⁺ Т-клеток в очаге опухоли. Во время внутривенной инфузии ~ 50% и 30% инфузированных Т-клеток CD8 ⁺ и CD4 ⁺ , соответственно, были декстрамером ⁺ для TCR.На 2 день после второй внутривенной инфузии процентное содержание клеток декстрамера ⁺ среди Т-клеток CD8 ⁺ и Т-клеток CD4 ⁺ оценивали в периферической крови и головном мозге мышей, которые получали Т-клетки, трансдуцированные TCR. Столбики и столбики ошибок представляют собой медианное значение и стандартное отклонение, соответственно, для процента клеток декстрамера ⁺ среди общего количества живых CD8 ⁺ или CD4 ⁺ Т-клеток. Данные показывают процентное содержание декстрамеров ⁺ клеток среди общего количества живых CD8 ⁺ или CD4 ⁺ Т-клеток ( n = 5 на группу).Экспериментальные результаты, показанные на этом рисунке, представляют два независимых эксперимента с воспроизводимыми результатами. *, P <0,05; **, P <0,01 по критерию Стьюдента t .

Обсуждение

В текущем исследовании мы идентифицировали новый HLA-A * 02: 01-ограниченный неоантигенный эпитоп, включающий мутацию h4.3K27M, которая присутствует в большинстве DMG у детей и молодых людей (Solomon et al. , 2016; Чанг, Эллисон, 2017). Кроме того, мы клонировали высокоаффинный TCR, который специфически распознает h4.Эпитоп 3K27M эндогенно экспрессируется клетками глиомы h4.3K27M ⁺ HLA-A * 0201 ⁺ .

Гетероклитические пептидные модификации эпитопов Т-клеток опухолевого антигена описаны в литературе. В частности, замена аминокислотного остатка в положении 2 на метионин увеличивает связывание с HLA-A * 02: 01 и способность эпитопа gp100 _209–217 индуцировать CTL (Dionne et al., 2003; Rosenberg et al., 2005). Интересно, что мутация горячей точки h4.3K27M имеет случайную замену метионина в положении 27 (положение 2 эпитопного пептида), что естественным образом генерирует гетероклитический пептид с улучшенным связыванием HLA-A2 и иммуногенностью по сравнению с немутантным h4.Пептид 3WT.

Хотя большинство неоантигенов, полученных из миссенс-мутаций, уникальны для отдельных пациентов (Tran et al., 2015, 2016), мы ожидаем, что иммунотерапия, нацеленная на эпитоп h4.3K27M, может быть применима к сотням пациентов ежегодно в США и других странах. на основании высокой частоты мутации h4.3K27M и распространенности HLA-A * 02: 01 (http://www.cbtrus.org; Zhang et al., 2017). Нам удалось обнаружить h4.3K27M-специфические Т-клеточные ответы в DIPG PBMC, полученных от пациентов, но не в PBMC, полученных от здоровых доноров.Хотя эти наблюдения могут означать, что спонтанные h4.3K27M-специфические Т-клеточные ответы недостаточны для контроля роста опухоли, эти наблюдения также подтверждают наш анализ MS, демонстрирующий присутствие эпитопа h4.3K27M в HLA класса I h4.3K27M ^{. +} клеток глиомы. Во время процесса подачи и редактирования данной статьи Ochs et al. (2017) сообщили, что пептид, охватывающий h4.3K27M, индуцирует специфические ответы CTL и Th2 у трансгенных мышей HLA-A2.DR1.Хотя их исследование не идентифицировало антиген-специфические клоны CTL или кДНК TCR, оно подтверждает наши результаты относительно иммуногенности эпитопа h4.3K27M в хозяевах HLA-A2 ⁺ . В совокупности эти результаты дают обоснование для усиления ответа пептидной вакциной. Фактически, мы недавно провели многоцентровое пилотное исследование для оценки безопасности, иммунореактивности и предварительной эффективности вакцины с использованием синтетического пептида эпитопа h4.3K27M _26–35 у детей с h4.3K27M ⁺ DIPG или глиома высокой степени злокачественности через Тихоокеанский педиатрический нейроонкологический консорциум (PNOC-007; {«type»: «клиническое испытание», «attrs»: {«text»: «NCT02960230», «term_id») : «NCT02960230»}} NCT02960230).

Хотя список антигенов, которые могут быть использованы для иммунотерапии глиомы, расширился за последнее десятилетие (Okada et al., 2009; Reardon et al., 2013), включая идентифицированные (Okano et al., 2002; Eguchi et al. ., 2006) или охарактеризованных (Hatano et al., 2005; Zhang et al., 2007) нашей группой, не было много действительно глиом-специфических антигенов, за исключением тех, которые происходят из EGFRvIII (Ohno et al., 2013; Johnson et al., 2015) и IDh2 (Schumacher et al., 2014). Кроме того, из-за заметной гетерогенности генетики и экспрессии белков при солидном раке нацеливание на один антиген может привести к развитию вариантов опухоли, в которых отсутствует целевой антиген (Genßler et al., 2015; Navai and Ahmed, 2016). Эти наблюдения подчеркивают необходимость расширения списка доступных опухолеспецифических антигенов, таких как антигены, происходящие от мутаций (т. Е. Неоантигены), для безопасной и эффективной иммунотерапии.Эпитоп неоантигена, производный от h4.3K27M, будет ценной мишенью, потому что он не только опухолеспецифичен, но и мутантный белок K27M также присутствует во всех ядрах опухоли в каждом из 47 случаев, оцененных с помощью иммуногистохимии (Solomon et al., 2016) , предполагая, что это может быть мутация туловища и с меньшей вероятностью приведет к побегу опухоли, опосредованному потерей антигена. Учитывая недавнее возникновение опасных для жизни и смертельных событий в испытаниях иммунотерапии рака, вызванных попаданием в цель (Johnson et al., 2009; Morgan et al., 2010; Parkhurst et al., 2011) или нецелевой (Cameron et al., 2013; Morgan et al., 2013) перекрестной реактивности Т-клеток против нормальных клеток, мы сосредоточили свое внимание на решении проблемы антигенной специфичности TCR путем выполнения аланиновое сканирование (Cunningham and Wells, 1989; García-Peydró et al., 2000; Cameron et al., 2013).

Хотя наши результаты показали отсутствие каких-либо известных белков человека, которые имеют один и тот же аминокислотный мотив для распознавания TCR, мы также признаем, что сканирование аланина не может исключать все возможности перекрестной реактивности.Фактически, хотя это не было на статистически значимых уровнях, мы наблюдали тенденцию к тому, что TCR-трансдуцированные CD8 ⁺ Т-клетки продуцировали умеренное количество пятен IFN-γ против клеток T2, нагруженных супрафизиологической (10 мкг / мл) концентрацией h4. .3WT пептид, предполагающий теоретическую возможность не опухолевой реактивности. Полное сканирование с использованием панели всех возможных комбинаций аминокислотных замен в эпитопе позволило бы получить полную картину или мотив для каждого потенциально переносимого пептида и предоставило бы наиболее полную информацию.

Тем не менее, наши данные аланинового сканирования дают нам основу для понимания пептидной специфичности и того, как избежать потенциальной токсичности, вызванной перекрестной реактивностью. Для дальнейшего выяснения специфичности и перекрестной реактивности TCR мы начали совместную работу по интеграции структурной биологии для характеристики взаимодействия между TCR и HLA-комплексами, нагруженными пептидами (Adams et al., 2016).

Аминокислотная последовательность пептида A6 в анализе с аланиновым сканированием идентична пептиду, содержащему остатки 26–35 h4.1 и включая мутацию K27M (Wu et al., 2012). Уменьшение связывания пептида-HLA-A * 02: 01 и распознавания TCR с пептидом A6 убедительно свидетельствует о том, что наш TCR не будет применим к пациентам с мутацией h4.1K27M. Точно так же, основываясь на наших данных сканирования аланина, если опухоль несет цитруллинированный R26 в дополнение к мутации K27M в h4.3, TCR вряд ли ответит. Следовательно, в будущих клинических испытаниях может потребоваться оценка ткани глиомы пациентов на цитруллинирование R26 в h4.3 в рамках проверки на соответствие критериям, если станет доступным осуществимый метод оценки. Кроме того, наши анализы связывания пептидов с подтипами HLA-A2 показали, что эпитопный пептид h4.3K27M может не связываться эффективно с подтипами HLA-A2, отличными от HLA-A * 02: 01. Это необходимо учитывать при рассмотрении правомочности пациентов.

Наши данные SPR показали, что сродство TCR к h4.3K27M-HLA-A * 02: 01 сопоставимо с аффинностью хорошо охарактеризованных высокоаффинных TCR, специфичных к вирусным или бактериальным антигенам (Aleksic et al., 2012). Невирусные раковые или аутоантигенные пептиды обычно связывают TCR на более низких уровнях сродства ( K _D 50–200 мкМ), поскольку TCR с высоким сродством к аутоантигенам, вероятно, будут отрицательно отобраны в тимусе. Хотя кинетика взаимодействия TCR-h4.3K27M-HLA-A2 была слишком быстрой, чтобы ее точно определить с помощью нашего эксперимента SPR, быстрая кинетика является важной особенностью взаимодействий TCR-пептид HLA класса I (Cole et al., 2007).

На основании нашего анализа титрования пептидов с использованием первичных человеческих CD8 ⁺ Т-клеток, трансдуцированных TCR, EC ₅₀ колеблется от 10 ^-8 до 10 ^-9 M, что, по крайней мере, сопоставимо с несколькими известными HLA-связывающие эпитопы, происходящие от антигенов меланомы (Bakker et al., 1995; Lupetti et al., 1998). С другой стороны, Т-клетки CD4 ⁺ , трансдуцированные TCR, не смогли продемонстрировать сопоставимые ответы, что убедительно свидетельствует о необходимости корецептора CD8 для достаточных функций TCR. Эти данные также предполагают преимущество выбора Т-клеток CD8 ⁺ для трансдукции TCR в будущих клинических испытаниях.

Что касается системы трансдукции TCR, широко описываемая ловушка при использовании TCR-трансдуцированных T-клеток заключается в неправильном спаривании между эндогенными и происходящими из трансгена α- и β-цепями TCR, что приводит к снижению экспрессии TCR трансгена, непредвиденной реактивности вне мишени и / или аутоиммунитет (Govers et al., 2010; Чжан и Морган, 2012). Для обеспечения и улучшения правильного спаривания α- и β-цепей, полученных из трансгена, были оценены различные технологии генной инженерии, такие как введение дисульфидного мостика в константные области α / β путем добавления дополнительных остатков цистеина, заменяющих человека с константными областями мышей, оптимизация кодонов, слияние цепей TCR с лейциновой застежкой-молнией и одноцепочечный TCR (Govers et al., 2010; Zhang and Morgan, 2012). В текущем исследовании нам удалось добиться превосходной экспрессии цепей трансгена TCR путем включения миРНК против эндогенного TCR (Okamoto et al., 2009, 2012) и оптимизации кодонов кДНК.

Наши данные MS-анализа клеток U87h4.3K27M и цитотоксических анализов с использованием клеток HSJD-DIPG-017 показывают, что эпитоп h4.3K27M продуцируется естественным образом и представлен HLA-A * 02: 01 на поверхности h4.3K27M. ⁺ клеток глиомы. В нашем анализе MS, а также в исследованиях ксенотрансплантатов in vivo использовались клетки U87h4.3K27M, но не настоящие клетки DIPG, такие как HSJD-DIPG-017. Это было связано с тем, что для обоих анализов требуется большое количество клеток (например, 5 × 10 ⁸ клеток, необходимых для одного раунда анализа MS), и ни одна из настоящих клеточных линий DIPG не может быть выращена в достаточных количествах в разумные сроки.Тем не менее, наши наборы данных с использованием различных клеточных линий подтверждают наш важный вывод о том, что эпитоп h4.3K27M в клетках глиомы является мишенью для TCR.

Хотя наши данные с моделью ксенотрансплантата у мышей NSG ясно продемонстрировали эффективность внутривенно введенных TCR-трансдуцированных Т-клеток in vivo, у нас были ограниченные возможности для исследования точных взаимодействий между введенными Т-клетками и окружающей средой у мышей с ослабленным иммунитетом. Мы сосредоточили свое внимание на молекулярных факторах, таких как хемокин, CXCL10 (Zhu et al., 2010; Ohkuri et al., 2014) и рецептор интегрина, антиген очень поздней активации (VLA) -4, которые способствуют проникновению Т-клеток в опухоли головного мозга с использованием сингенных моделей (Sasaki et al., 2007; Zhu et al., 2007). Нам нужно будет интегрировать эти открытия в разработку эффективных подходов к терапии Т-клетками, трансдуцированными TCR.

Данные текущего исследования обеспечивают прочную основу для разработки безопасной и эффективной основанной на Т-клетках иммунотерапии, нацеленной на эпитоп h4.3K27M. Недавние исследования показали, что устойчивый противоопухолевый иммунный ответ может быть достигнут за счет адаптивного переноса ex vivo-активированных Т-клеток (Rosenberg and Restifo, 2015).Поэтому мы направим наши усилия по трансляции на дальнейшую оптимизацию нашего TCR и разработку эффективной адоптивной терапии Т-клетками для пациентов с глиомами h4.3K27M ⁺ .

Материалы и методы

Клетки и культура клеток

Культуры нейросфер DIPG поддерживали в среде ствола опухоли, содержащей среду Neurobasal-A (1 ×), DMEM / F-12, буфер Hepes, пируват натрия, незаменимые аминокислоты MEM, GlutaMAX -I, анти-анти-раствор и добавка B-27 за вычетом витамина А или нейроплекс Gem21, все приобретено у Life Technologies.В среду добавляли 20 нг / мл рекомбинантного EGF человека (rhEGF; AF-100-15; Peprotech), 20 нг / мл rhFGF-basic (AF-100-18B; Peprotech), 10 нг / мл hPDGF-AA (100- 13A; Peprotech), 10 нг / мл hPDGF-BB (100-14B; Peprotech) и 2 мкг / мл раствора гепарина (h4149-10KU; Sigma-Aldrich) в начале культивирования клеток и еженедельно после этого. Клетки пассировали растиранием в TrypLE Express (12604-039; Invitrogen) и DNase1 ({«type»: «entrez-нуклеотид», «attrs»: {«text»: «LS002007», «term_id»: «1321652717», «term_text»: «LS002007»}} LS002007; Worthington) с последующим ресуспендированием в свежей среде.U87h4.3K27M и U87h4.3WT были получены путем трансфекции вектора PT2 / C, кодирующего кДНК для WT h4.3 или K27M h4.3 в родительские клетки HLA-A2 * 01 ⁺ h4.3K27M ^neg U87MG с использованием Реагент для трансфекции FuGENE HD (E2311; Promega). Экспрессию h4.3K27M подтверждали вестерн-блоттингом с антителом против h4.3K27M (ABE419; Millipore). Клетки HSJD-DIPG019 трансдуцировали лентивирусным вектором, кодирующим кДНК HLA-A2 * 01 с маркером селекции пуромицина (VectorBuilder) для генерации клеток HSJD-DIPG019-HLA-A2 * 01.Клеточная линия Jurkat T-клеточного клона 76 (J76CD8) (Heemskerk et al., 2003), которая дефицитна по эндогенным α- и β-цепям TCR, но экспрессирует CD8 человека, была предоставлена ​​M. Heemskerk (Медицинский центр Лейденского университета, Лейден). , Нидерланды). Было подтверждено, что использованные клеточные линии отрицательны на инфекцию микоплазмой.

Выделение Т-клеток

LRS-камеры, содержащие HLA-A * 02: 01 ⁺ , полученные от здорового донора, были получены из Стэнфордского банка крови. PBMC, полученные от пациентов, были получены через одобренный Институтом наблюдательного совета банк тканей нейрохирургии (IRB / CHR # 10-01318; PI, J.Phillips) с закодированной информацией о тканях без каких-либо защищенных идентификаторов здоровья. Т-клетки были обогащены из цельной крови путем иммуноплотного выделения с использованием коктейля для обогащения Т-клеток человека RosetteSep (15061; Stem Cell Technologies) в соответствии с протоколом, предложенным производителем. Т-клетки криоконсервировали в среде RPMI, содержащей 20% сыворотки AB человека и 10% ДМСО, и хранили при -196 ° C.

Пептиды

Синтетические пептиды h4.3K27M _26–35 (RMSAPSTGGV), h4.3WT _26–35 (RKSAPSTGGV), CITmh4.3 _26–35 (XMSAPSTGGV), h4.1K27M _26–35 (RMSAPATGGV) и матричный белок гриппа M1 _58–66 пептид гриппа (GILGFVFTL), а также пептиды, используемые для анализа аланинового сканирования. были синтезированы A&A Laboratories и имели чистоту> 95%, как показали аналитические анализы HPLC и MS. Пептиды растворяли в ДМСО в концентрации 10 мг / мл и хранили при -80 ° C до использования.

Анализы связывания HLA-пептидов

Количественные анализы для измерения связывания пептидов с очищенными HLA A * 02: 01 молекулами класса I основаны на ингибировании связывания стандартного пептида, меченного радиоактивной меткой (аналог ядра HBV 18–27, FLPSDYFPSV) и были выполнены, как подробно описано в другом месте (Sidney et al., 2013). Молекулы HLA очищали с помощью аффинной хроматографии из линии гомозиготных клеток JY, трансформированных EBV, как описано ранее (Sidney et al., 2013). Пептиды тестировали при шести различных концентрациях, охватывающих 100000-кратный диапазон доз в трех или более независимых анализах, и рассчитывали IC ₅₀ связывания радиоактивно меченного зондового пептида. В используемых условиях, когда [радиоактивно меченый зонд] <[MHC] и IC ₅₀ ≥ [MHC], измеренные значения IC ₅₀ являются разумными приближениями к истинным значениям K _D (Cheng and Prusoff, 1973 ; Гулюкота и др., 1997).

ELISPOT-анализы

PBMC, полученные от пациентов и здоровых доноров, стимулировали 10 мкг / мл пептида h4.3K27M _26–35 или пептида h4.3WT _26–35 , или пептида гриппа или без пептида. Через 48 часов к культуре добавляли rhIL-2 (50 Ед / мл), IL-7 (10 нг / мл) и IL-15 (10 нг / мл) на дополнительные 5 дней. 5 × 10 ⁴ стимулированных пептидом Т-клеток совместно культивировали с 5 × 10 ⁴ Т2-клеток, обработанных 10 мкг / мл пептида h4.3K27M _26–35 или h4.3WT _26–35 пептид или без пептида в течение 24 часов на планшетах для ELISPOT, покрытых антителом против IFN-γ человека. Для определения авидности TCR, 5 × 10 ⁴ TCR-трансдуцированных CD8 ⁺ Т-клеток совместно культивировали с 5 × 10 ⁴ T2-клеток, подвергнутых импульсным воздействиям различных концентраций пептида h4.3K27M в течение ночи на планшетах для ELISPOT, покрытых антиоксидантами. –Антитело IFN-γ человека. Остальная часть протокола была выполнена в соответствии с протоколом производителя (набор ELISPOT IFN-γ человека; 552138; BD).Пятна были количественно определены с использованием CTL S6 Universal-V Analyzer ELISpot Reader (ImmunoSpot).

Очистка и анализ ЖХ-МС / МС пептидов HLA класса I

Комплексы HLA класса I были очищены из 5 × 10 ^{8 родительских клеток} U87 или клеток U87, трансфицированных либо h4.3WT, либо h4.3K27M, как описано ранее (Бассани-Штернберг и др., 2015). Вкратце, клетки лизировали 0,25% дезоксихолатом натрия (Sigma-Aldrich), 1% октил-β-d-глюкопиранозидом (Sigma-Aldrich), 0,2 мМ йодацетамида, 1 мМ EDTA и коктейлем ингибиторов протеазы 1: 200 (Sigma- Aldrich) в PBS при 4 ° C в течение 1 ч.Лизат очищали 30-минутным центрифугированием при 40000 g при 4 ° C. Комплексы HLA класса I были иммуноаффинно очищены из очищенного лизата гранулами протеина А-сефарозы (Invitrogen), ковалентно связанными с пан-HLA класса I антителом W6 / 32 (очищенным из клеток HB95; ATCC) и элюированы при комнатной температуре 0,1 н. Уксусной кислотой. кислота. Затем элюированные комплексы HLA-I загружали в картриджи Sep-Pak tC18 (Waters Corporation), и пептиды HLA класса I отделяли от комплексов, элюируя их 30% ацетонитрилом (ACN) в растворе 0.1% ТФК. Пептиды дополнительно очищали с использованием насадок для колонок Silica C-18 (Harvard Apparatus), снова элюировали 30% ACN в 0,1% TFA и концентрировали центрифугированием в вакууме. Для анализа ЖХ-МС / МС пептиды HLA класса I разделяли на системе EASY-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific), подключенной онлайн к масс-спектрометру Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific) с источником ионов наноэлектроспрея (Thermo Fisher Scientific). . Пептиды загружали в буфере A (0,1% муравьиной кислоты) в колонку длиной 50 см и внутренним диаметром 75 мкм, набитую ReproSil-Pur C18-AQ 1.Смола 9 мкм (Dr. Maisch HPLC GmbH) и элюируется 90-минутным линейным градиентом 5-30% буфера B (80% ACN и 0,1% муравьиной кислоты) при скорости потока 250 нл / мин. Q Executive HF работал в зависимом от данных режиме с полным сканированием MS в диапазоне 300–1650 м / z , с разрешением 60 000 при 200 м / z и целевым значением 3 × 10 ⁶ ионов. 10 наиболее распространенных ионов с зарядом 1–3 были объединены, чтобы получить целевое значение AGC 1 × 10 ⁵ и максимальное время инжекции 120 мс, фрагментированное столкновительной диссоциацией высоких энергий (HCD).Сканирование MS / MS было получено с разрешением 15000 на 200 m / z , и динамическое исключение было установлено на 20 с, чтобы избежать повторного секвенирования пептидов. Данные были получены и проанализированы с помощью программного обеспечения Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). Для целевой идентификации пептида h4.3K27M тяжелую (Arg10) версию пептида синтезировали твердофазным методом Fmoc с использованием прибора ResPepMicroScale (Intavis AG Bioanalytical Instruments), вводя разницу масс 10,0083-D с одним 13C6 15N4. аргинин (АнаСпек).Тяжелый пептид добавляли к каждому образцу в концентрации 1 пмоль / мкл, всего 3 пмоль на цикл.

Для анализа данных MS необработанные файлы обрабатывались с помощью MaxQuant версии 1.5.7.12, как описано ранее (Bassani-Sternberg et al., 2015). Поиск проводился в базе данных Human UniProt (июль 2015 г.) и настроенной справочной базе данных, содержащей последовательность h4.3K27M. Специфичность фермента была определена как неспецифическая, а возможные совпадения последовательностей были ограничены 8-15 аминокислотами и максимальной массой 1500 D.N-концевое ацетилирование и окисление метионина были установлены как переменные модификации. На уровне пептида требовался коэффициент ложного обнаружения 0,01. Для идентификации тяжелого пептида в спецификацию типа поиска была добавлена ​​метка Arg10.

Индукция и выделение h4.3K27M-специфичных клонов CTL

Для создания дендритных клеток прикрепленные к пластику клетки из PBMC культивировали в среде AIM-V (Invitrogen) с добавлением 1000 единиц / мл рекомбинантного человеческого GM-CSF и 500 единиц. ед / мл rhIL-4 (Cell Sciences) при 37 ° C в увлажненном CO ₂ (5%) инкубаторе.Через 6 дней незрелые дендритные клетки стимулировали рекомбинантными человеческими TNF-α, IL-6 и IL-1β (10 нг / мл каждый). Затем зрелые дендритные клетки собирали на 8 день, ресуспендировали в среде AIM-V при концентрации 10 ⁶ клеток / мл с пептидом (10 мкг / мл) и инкубировали в течение 2 часов при 37 ° C. Популяции аутологичных Т-клеток CD8 ⁺ обогащали из PBMC с использованием магнитных микрошариков (Miltenyi Biotec). CD8 ⁺ Т-клетки (2 × 10 ⁶ на лунку) совместно культивировали с 2 × 10 ⁵ / лунку пептидно-импульсными дендритными клетками в 2 мл / лунку среды AIM-V с добавлением 5% сыворотки АВ человека , 10 ед. / Мл rhIL-2 (R&D Systems) и 10 ед. / Мл rhIL-7 (Cell Sciences) в каждой лунке 24-луночных планшетов для тканевых культур.На 15 день лимфоциты рестимулировали аутологичными дендритными клетками, обработанными пептидом в среде AIM-V с добавлением 5% сыворотки AB человека, rhIL-2 и rhIL-7 (10 единиц / мл каждый).

Окрашивание тетрамера HLA-A * 0201-пептида

PE-конъюгированный тетрамер HLA-A * 0201 RMSAPSTGGV (h4.3K27M-тетрамер) был произведен Национальным институтом аллергии и инфекционных заболеваний тетраммерным центром Университета Эмори. Атланта, Джорджия) с использованием пептида, синтезированного A&A Laboratories.РЕ-конъюгированный декстрамер HLA-A * 0201 / RMSAPSTGGV был приобретен у Immudex. Клетки окрашивали тетрамером (10 мкг / мл) или декстрамером в PBS, содержащем 1% BSA, в течение 15 минут при 4 ° C (для тетрамера) или комнатной температуре (для декстрамера) с последующим окрашиванием поверхности на различные маркеры Т-клеток при 4 °. С. Затем клетки промывали PBS, содержащим 0,1% BSA. Для некоторых экспериментов Т-клетки окрашивали тетрамером, затем FITC против CD3 человека (344803; BioLegend), CD4-PerCPCy.5.5 (317427; BioLegend), CD8 APC (344722; BioLegend), CD69 FITC (11-0699- 42; eBioscience) или PD-1-PECy7 (561272; BD Biosciences) вместе с подходящими контрольными антителами изотипа.Окрашивание внутриклеточных цитокинов проводили с использованием набора Fixation / Permeabilization Solution (54714; BD Biosciences) в соответствии с инструкциями производителя. Затем Т-клетки окрашивали антителом против человека Granzyme-B-BV421 (563389; BD Biosciences). Клетки получали с помощью проточного цитометра Sony SH800 и анализировали с помощью программного обеспечения FlowJo v.10.

ELISA

Среду собирали и центрифугировали при 500 g в течение 10 минут для удаления мусора. ELISA на человеческий IFN-γ (555142; BD OptEIA) и человеческий IL-2 (Eh3IL2; Thermo Fisher Scientific) проводили в соответствии с протоколом производителя.Планшеты анализировали на ридере для микропланшетов Biotek Synergy2 (Biotek) при длинах волн 450 нм и фоне 550 нм.

Клонирование TCR

5′-Быстрая амплификация концов кДНК (RACE) -PCR выполняли с помощью набора SMARTer RACE 5 ‘/ 3′ (634838; Clontech). Вкратце, единственный продукт RACE-PCR (~ 900 п.н.) был вырезан из 1,2% агарозного геля, очищен с помощью набора для восстановления ДНК Zymoclean Gel (Zymo; D4001) и TOPO клонирован в Pcr-Blunt II-TOPO с использованием Zero Blunt. Набор для клонирования ПЦР TOPO (K2800-20SC; Life Technologies).Затем клонированный продукт трансформировали в компетентные клетки MAX Efficiency DH5α (182580120; Life Technologies) и высевали на чашки с агаром LB, содержащим ампициллин (L1004; Teknova). Чашки с агаром LB помещали на ночь при 37 ° C для образования колоний. Отобранные клоны из полученных конструкций подвергали ПЦР-амплификации и секвенированию (QuintaraBio) с использованием прямого праймера M13 (-21) (5’-TGTAAAACGACGGCCAGT-3 ‘) и обратного праймера M13 (5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3’) для секвенирования. Последовательности анализировали с помощью SnapGene Viewer.

Генерация линий клеток-продуцентов ретровирусов siTCR

Система siTCR была описана ранее (Okamoto et al., 2009, 2012). Вкратце, оптимизированные по кодонам фрагменты TCRA и TCRB были искусственно синтезированы и клонированы в плазмиду ретровирусного вектора Takara siTCR. Вектор был сконструирован в следующей последовательности: 5′-промотор LTR вируса мышиных стволовых клеток (MSCV), управляющий TCR, а также миРНК, кассета миРНК, TCRβ, спейсер + пептид P2A, за которым следует последовательность TCRα.Последовательности миРНК были разработаны для связывания и подавления эндогенных константных областей TCRα и TCRβ, но не соответствовали кодон-оптимизированным константным областям TCRα и TCRβ в h4.3K27M TCR. Упаковывающие клетки PG13 высевали из расчета 3 × 10 ⁴ клеток на лунку шестилуночного планшета и инкубировали в течение 24 часов. Клетки PG13 трансфицировали ретровирусным вектором siTCR в присутствии 8 мкг / мл полибрена и инкубировали в течение 4 ч при 37 ° C, 5% CO ₂ ; это повторилось на следующий день. Клетки были дополнительно размножены, собраны как клетки-продуценты ретровирусного вектора siTCR с псевдотипом оболочки GaLV и криоконсервированы.Для создания ретровирусных частиц супернатант культуры собирали из клеток, выращенных в полной среде DMEM с добавлением 5 мМ бутирата натрия (156-54-7; Sigma-Aldrich) в течение 24 часов.

Продукция рекомбинантного TCR

Зрелые h4.3K27M TCR α- и β-эктодомены с сконструированной межцепочечной дисульфидной связью C-домена были отдельно клонированы в вектор экспрессии насекомых pAcGP67a (554756; BD Biosciences), кодирующий либо C-концевую кислотную молнию — биотиновый акцепторный пептид-6xHis-метка или C-концевой основной zipper-6xHis-метка.Сайт протеазы 3c был введен между С-концевым TCR (α или β) эктодоменом и (кислотной или основной) последовательностью застежки-молнии (Birnbaum et al., 2014). Бакуловирусы для каждой конструкции TCR были продуцированы в клетках SF9. Продукцию TCR проводили в клетках High Five путем трансфекции вирусов TCRα и TCRβ в соответствующем соотношении в течение 48–72 часов при 30 ° C. Собранную культуральную среду инкубировали со смолой Ni-NTA (30250; Qiagen) при комнатной температуре в течение 3 часов и элюировали 1 × солевым раствором, забуференным Hepes (HBS) + 200 мМ имидазолом (pH 7.2). Элюированный TCR заменяли буфером на 1 × HBS и инкубировали с соответствующим количеством 3 C протеазы (100 нг / мкл) при 4 ° C в течение ночи. Затем реакционную смесь очищали с помощью эксклюзионной хроматографии с использованием AKTAPurifier (GE Healthcare) на колонке Superdex 200 (GE Healthcare). Пиковые фракции объединяли и обрабатывали на геле SDS-PAGE в качестве контроля качества.

Растворимый HLA-A2, нагруженный пептидом h4.3K27M (RMSAPSTGGV), получали фолдингом in vitro. Тяжелая цепь HLA-A2 (остатки 1-275) и β2-микроглобулин (остатки 1-100) были отдельно клонированы в вектор pET-26b и трансформированы клетками Rosseta DE3 Escherichia coli .Тельца включения, содержащие соответствующие белки, растворяли в 8 М мочевине, 50 мМ Трис-HCl, pH 8,0, 10 мМ EDTA и 10 мМ DTT. Для фолдинга in vitro тяжелую цепь HLA-A2, β2-микроглобулин и пептид h4.3K27M смешивали в молярном соотношении 1: 2: 10 и разбавляли фолдинговым буфером, содержащим 0,4 M l-аргинин-HCl, 100 мМ Tris. -HCl, pH 8,0, 5 мМ EDTA, 0,5 мМ окисленного глутатиона и 5 мМ восстановленного глутатиона (Garboczi et al., 1992). Через 72 часа при 4 ° C для диализа против 10 литров 10 мМ трис-HCl смесь для фальцовки подвергали обработке на колонке со слабым ионным обменом (DEAE-целлюлоза).Сложенный h4.3K27M-HLA-A2 очищали с использованием последовательной эксклюзионной хроматографии (колонка Superdex 200) и ионообменной хроматографии (колонки Mono Q).

Анализ SPR

Взаимодействие TCR с h4.3K27M пептид-HLA-A2 измеряли с помощью SPR с использованием биосенсора BIAcore T100 при 25 ° C. Биотинилированный h4.3K27M-HLA-A2 иммобилизовали на покрытом стрептавидином чипе BIAcore SA (GE Healthcare) при 300 резонансных единицах (RU). Другая проточная кювета была иммобилизована нерелевантным пептидом-HLA-A2, чтобы служить в качестве холостого контроля.Раствор 1H5 TCR различных концентраций последовательно пропускали через холостой пробы и h4.3K27M-HLA-A2. Инъекции TCR были остановлены через 60 с после начала инъекций, чтобы дать достаточно времени, чтобы сигналы SPR достигли плато. Константы диссоциации ( K _D ) получали путем подгонки данных равновесия с моделью связывания 1: 1 с использованием программного обеспечения для оценки BIAcore.

Инфекция первичных Т-клеток вектором TCR

PBMC человека активировали на планшетах, предварительно покрытых антителом против CD3 человека (клон OKT3; 170-076-124; Miltenyi Biotec) и RetroNectin (T100A; Takara Bio).Через 3 дня после стимуляции вирусный супернатант (для групп с трансдукцией TCR) или PBS (для групп с псевдотрансдукцией) центрифугировали на отдельных планшетах, покрытых RetroNectin, при 2000 г в течение 2 часов при 4 ° C. Активированные РВМС собирали с планшетов OKT3-RetroNectin и добавляли в покрытые вирусом планшеты с использованием методологии спинфекции в количестве 1000 г в течение 10 мин при 4 ° C, и в клетки добавляли 600 Ед / мл IL-2 (200- 02; PeproTech). Этот протокол трансдукции повторяли на следующий день, и PBMC давали отдохнуть еще на 4 дня, а затем окрашивали HLA-A * 02: 01-h4.Тетрамер 3К27М для определения эффективности трансдукции. Т-клетки поддерживали в свежеприготовленной среде GT-T551, содержащей 100 ед / мл rhIL-2 (WK551S; Takara Bio).

Анализ цитотоксичности на основе ЛДГ

Анализ нерадиоактивной цитотоксичности CytoTox 96 (Promega) выполняли в соответствии с протоколом производителя. Клетки-мишени помещали в 96-луночные планшеты с различным соотношением эффектор / мишень (E / T) в 200 мкл среды в течение 24 часов. Затем 50 мкл супернатанта переносили в планшет для ферментативного анализа, содержащий 50 мкл реагента CytoTox 96, и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре.Затем в каждую лунку добавляли стоп-раствор и планшеты анализировали при 490 нм на ридере для микропланшетов Synergy2 (Biotek). Процент цитотоксичности рассчитывали как [(экспериментальный — эффекторный спонтанный — целевой спонтанный) / (целевой максимум — целевой спонтанный)] × 100.

Анализ цитотоксичности на основе CSFE

Клетки-мишени окрашивали CFSE с использованием набора Vybrant CFDA SE Cell Tracer (V12883; Thermo Fisher Scientific). Меченные CFSE клетки-мишени (5 × 10 ⁴ / лунку) инкубировали с CTL при соотношении E / T, равном 5, в течение 8 часов.Для блокирования лизиса, опосредованного HLA-A2, к одной группе на эксперимент добавляли антитело против HLA-A2 (10 мкг / мл; 343302; BioLegend). В конце инкубации в каждую лунку добавляли 7-AAD (420403; BioLegend) и инкубировали в течение 10 минут на льду. Образцы анализировали с помощью проточной цитометрии, и убитые клетки-мишени были идентифицированы как клетки CFSE ⁺ 7-AAD ⁺ . Цитотоксичность рассчитывали как процентное содержание клеток CFSE ⁺ и 7-AAD ⁺ в общем количестве клеток CFSE ⁺ .

Терапия мышей с ксенотрансплантатами внутричерепной глиомы

В экспериментах на самках мышей (лаборатория Джексона) использовали самок мышей NOD.Cg- Prkdc ^scid Il2rg ^tm1Wjl / SzJ (мыши NSG) в возрасте 5–6 недель. С животными обращались в помещении для животных Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF) в соответствии с протоколом, утвержденным Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC). Процедура описана нами ранее (Ohno et al., 2013). Вкратце, с помощью стереотаксического аппарата мыши получили 5 × 10 ⁴ U87h4.Клетки, экспрессирующие люциферазу 3K27M / мышь, в 2 мкл PBS на 2 мм латеральнее брегмы и на 3 мм ниже поверхности черепа. После того, как опухоли были установлены, каждая мышь получала внутривенные инфузии PBS, ложно-трансдуцированных Т-клеток или 5 × 10 ⁶ TCR-трансдуцированных Т-клеток через хвостовую вену на 14 и 30 дни после инокуляции опухоли. В некоторых экспериментах мышей умерщвляли через 2 или 10 дней после переливания Т-клеток. Селезенку, кровь, легкие и опухоли собирали и подсчитывали на CD8, CD4, тетрамер, гранзим-B и PD-1.

Биолюминесцентная визуализация

Рост люцифераз-положительных опухолей U87h4.3K27M в головном мозге неинвазивно контролировали с помощью BLI с использованием системы визуализации in vivo IVIS 100 (PerkinElmer). Мыши получали i.p. инъекции 200 мкл (15 мг / мл) водного раствора калиевой соли d-люциферина (PerkinElmer) и анестезия изофлураном, затем визуализация биолюминесценции в течение 1 мин времени экспозиции. Визуализацию опухолей выполняли слепым методом. Оптические изображения анализировали с помощью пакета программ IVIS Living Image.

Статистический анализ

Все статистические анализы были выполнены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism v.6.0h. Для исследований in vitro использовали тест Стьюдента t или однофакторный дисперсионный анализ для сравнения двух или более двух групп, соответственно. Для определения EC ₅₀ использовали нелинейный регрессионный анализ. Мы считали различия значимыми, когда P <0,05.

Одобрение исследования

Все исследования на мышах проводились в соответствии с протоколом, одобренным UCSF IACUC.Клинические образцы (PBMC) были получены из ядра ткани Центра исследования опухолей головного мозга в UCSF в соответствии с протоколом, одобренным Комитетом UCSF по исследованиям на людях.

Дополнительные материалы онлайн

На рис. S1 показано распределение адоптивно перенесенных TCR-трансдуцированных Т-клеток в органах мышей NSG. В таблице S1 приведена аффинность связывания мутанта h4.3K27M (26–35) по сравнению с немутантными пептидами h4.3WT (26–35) с подтипами HLA-A2. В таблице S2 перечислены человеческие белки с аминокислотными мотивами, которые гомологичны ключевым аминокислотным остаткам, распознаваемым TCR.В таблице S3 перечислены данные о типировании HLA класса I клеточных линий, используемых в текущем исследовании.

Благодарности

Мы благодарим доктора Майкла Нишимура (Университет Лойолы) за технические советы по трансдукции человеческих Т-клеток с помощью TCR, доктора наук. Кадзуто Такесако и Хидето Чоно (Takara Bio Inc.) за подготовку ретровирусного вектора TCR и Центр доклинической терапии Калифорнийского университета в Сан-Франциско для использования системы визуализации Xenogen.

Настоящее исследование было поддержано NIH / Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS) R01NS096954 (H.Okada), NIH / NINDS 2R01NS055140 (H. Okada), Национальный центр развития трансляционных наук, NIH, через Калифорнийский университет, Институт клинических и трансляционных наук Сан-Франциско (H. Okada), V Фонд исследований рака D2015-018 ( С. Мюллер и Х. Окада), Паркерский институт иммунотерапии рака (Х. Окада), NIH / Национальный институт рака 1T32CA151022 (Г. Коханбаш), Fondo Alicia Pueyo CP13 / 00189 (AM Carcaboso) и Instituto de Salud Carlos III- Fondo Europeo de Desarrollo Regional PI15 / 01161 (A.М. Каркабозо).

Х. Окада и Я. Хоу являются авторами заявки на патент США «Пептиды h4.3 CTL и их применение» (дело SF2015-163). Авторы заявляют об отсутствии дальнейшего конфликта финансовых интересов.

Автор (ы): И.Ф. Поллак, Ю. Хоу и Х. Окада разработали исследование; З.С. Чхеда, Г. Коханбаш, К.С. Гарсия, Я. Хоу и Х. Окада разработали исследования; З.С. Чхеда, Г. Коханбаш, К. Окада, Н. Джахан, Дж. Сидней, X. Янг, Д.А. Каррера, К. Дауни, С. Шривастав, С.Лю, Ю. Линь, К. Лагисетти, П. Чунтова, П. Часовщик проводил эксперименты; З.С. Чхеда, Дж. Коханбаш, Дж. Сидней, С. Мюллер, Р. Раджалингам, А. Carcaboso, A. Sette, K.C. Гарсия, Я. Хоу и Х. Окада проанализировали данные; М. Пекораро и М. Манн провели масс-спектрометрические эксперименты; С. Мюллер внесла свой вклад в сбор образцов крови пациентов и поделилась своим клиническим опытом лечения пациентов с помощью DIPG; З.С. Рукопись написали Чхеда, Дж. Коханбаш, Дж. Сидней, Х. Ян и Х. Окада; и все авторы участвовали в рецензировании и проверке рукописи.

6 упаковок стальных угловых кронштейнов 4 «2», металл макс. 84% выкл. X Joint Thickne

правый, x, L, 6, Уголок, сталь, / coadjutive555142.html, www.ebdpost.co.il, Пакеты, 2 дюйма, 4 дюйма, кронштейн, Thickne, металл, Промышленное научное оборудование, Промышленное оборудование, Подвесы для балок, 16 долларов США, Соединение, справа, x, L , 6, Угол, Сталь, / coadjutive555142.html, www.ebdpost.co.il, Пакеты, 2 дюйма, 4 дюйма, Кронштейн, Толстый, Металл, Промышленное научное оборудование, Промышленное оборудование, Подвесы для балок, 16 долларов США, Соединение, 16 долларов США 6 Пакеты Стальной L Прямоугольный кронштейн 4 «x 2» Металлический шарнир, Thickne Industrial Scientific Промышленные скобы Стяжки балки Подвески 6 пакетов Стальной L Прямоугольный кронштейн 4 «2» Металл Макс. Металлический шарнир «x 2», крепежные элементы Thickne Industrial Scientific Промышленные скобы Подвески балки 6 упаковок Стальные L Прямоугольные кронштейны 4 дюйма 2 дюйма Металл Макс. скидка 84% x соединение Thickne

16 долларов США

6 упаковок стальных L-образных прямоугольных кронштейнов 4 «x 2», металлическое соединение, Thickne

• Убедитесь, что это подходит введя номер вашей модели.
• 6 упаковок L угловых кронштейнов, сталь, поверхность с порошковым покрытием белого цвета
• Длина: 4 дюйма (100 мм), высота: 2 дюйма (50 мм), ширина: 2 дюйма (50 мм), толщина:… ›дюйма (3 мм)
• Количество отверстий: 6 отверстий (Ï † 5 мм), винты в комплект не входят
• Каждая железная угловая распорка Максимальная нагрузка 132 фунта (60 кг). Вес: 7,4 унции (210 г) -1 упаковка, 3 фунта (1,35 кг) -6 пачек
• Антикоррозийная, износостойкая, антикоррозийная. Гладкая поверхность и края без заусенцев

6 упаковок стальных L-образных прямоугольных кронштейнов 4 «x 2», металлическое соединение, Thickne

«) // -> «) // ->

IceFlow: картирование изменений высоты криосферы

Этот инструмент данных NSIDC DAAC позволяет ученым получать доступ к непрерывным данным о высоте за 1993 год в едином формате.

Подробнее …

Snow Today возвращает

Анализ состояния снега на западе США, проведенный NSIDC, вернулся с обновленным веб-сайтом и дополнительными параметрами данных.

Подробнее …

Серия видео «После льда»

В рамках совместного проекта улавливаются голоса общин коренных народов Аляски, столкнувшихся с меняющимся Беринговым морем.

Подробнее …

Инструмент анализа морского льда

Новый инструмент визуализации данных позволяет легко преобразовывать данные о морском льде в графики или карты.

Подробнее …

Последние данные о ледовой обстановке в море

Карты и графики текущих условий с подробным анализом.

Подробнее …

ICESat-2

Данные ICESat-2 теперь доступны через Центр распределенного активного архива NSIDC.

Подробнее …

Научные данные для исследований

ЭЛОКА

Снег сегодня

Гренландия Сегодня

Новости

Арктический морской лед, вероятно, достиг своей минимальной протяженности за год — 4.72 миллиона квадратных километров (1,82 миллиона квадратных миль) 16 сентября 2021 года, по данным ученых из Национального центра данных по снегу и льду (NSIDC) в Университете Колорадо в Боулдере. Минимум 2021 года — двенадцатый самый низкий за почти 43-летний спутниковый рекорд. Последние 15 лет — это 15 наименьших размеров морского льда за всю историю спутников.

Каждый сентябрь Национальный центр данных по снегу и льду (NSIDC) при Университете Колорадо в Боулдере информирует общественность о ежегодной минимальной протяженности морского льда в Арктике, показателе того, как изменение климата влияет на Арктику, регион с самым быстрым потеплением. глобус.

Ученые из Университета Северной Аризоны, Университета штата Аризона, Геологической службы Аризоны в Университете Аризоны и Национального центра данных по снегу и льду в Университете Колорадо в Боулдере получили почти 2 миллиона долларов от Национального научного фонда (NSF) на разработать инструмент обучения виртуальной реальности под названием Polar Explorer.

Национальный центр данных по снегу и льду (NSIDC) объявил на этой неделе о своем участии в Коалиции 50×30, группе правительств и исследовательских институтов криосферы и выбросов, которые подтверждают необходимость сокращения выбросов парниковых газов на 50 процентов к 2030 году.Члены-основатели Коалиции поддерживают научный консенсус в отношении того, что неспособность достичь этой вехи приведет к «превышению температуры», при котором выбросы останутся слишком высокими, чтобы удерживать Землю в пределах 1,5 градусов Цельсия от доиндустриальных уровней, что приведет к серьезному и необратимому ущербу для окружающей среды. . Ущерб может быть особенно вредным для очень чувствительных к температуре замороженных компонентов земной системы, с последствиями, начиная от повышения уровня моря и заканчивая повреждением инфраструктуры и отсутствием продовольственной безопасности.

Арктический морской лед, вероятно, достиг максимальной площади за год — 14.77 миллионов квадратных километров (5,70 миллиона квадратных миль) 21 марта 2021 года, по данным ученых из Национального центра данных по снегу и льду (NSIDC) при Университете Колорадо в Боулдере. Максимум в 2021 году связан с 2007 годом и станет седьмым минимумом за 43-летний спутниковый рекорд.

События

В настоящее время события не публикуются.

Последние новости о снеге и льду

22 сентября 2021 г.

16 сентября арктический морской лед, вероятно, достиг своей годовой минимальной протяженности 4.72 млн кв … подробнее

2 сентября 2021 г.

Протяженность морского льда в Арктике в августе 2021 года уменьшалась медленнее, чем в большинство лет за последнее десятилетие … читать дальше

18 августа 2021 г.

14 августа 2021 года в самой высокой точке Гренландского ледяного щита наблюдался дождь на … читать дальше

18 августа 2021 г.

Исчезновение морского льда в первой половине августа прекратилось, хотя лед в море Бофорта наконец-то … читать дальше

Кабель 551639-1108580 МАЗ от Китайского производителя, завода, завода и поставщика на ECVV.com

Краткие сведения

• Номер модели: SH-1840
• Название бренда: Shicar
• OE NO.: 551639-1108580
• Марка автомобиля: МАЗ

Технические характеристики

Наша компания экспортирует автозапчасти на КАМАЗ, МАЗ, ЯМЗ, ЗИЛ, трактор в Россию, Украину, Казахстан и Беларусь .
Мы можем поставить КАБЕЛЬ / Трос акселератора, как показано ниже:
551639-1108580
544010-1108580
555142-1108580
533742-1108580
54328-1108580-01
5551-1108580-01
64229-1108580-01
54329-1108580-01
5434-1108580-01
555102-1108580
544010-1108580-010
543202-1108580
543240-1108580
543208-1108580
64221-1108580
Подробности технические характеристики.Электронный каталог и информацию о ценах, пожалуйста, свяжитесь с нами

Оклахома-Сити Молл Icotec-Decoy

Самый большой каталог мебели и электронная коммерция

С более чем 260 000 товаров, 3 500 брендами и 2,7 миллионами зарегистрированных пользователей Archiproducts является крупнейшей сетью в области архитектуры и дизайна. Каждый день тысячи архитекторов, дизайнеров, розничных продавцов и брендов со всего мира посещают веб-сайт в поисках лучших решений для design , inspire, build и меблировка онлайн .Постоянно обновляемый каталог продукции с подробными описаниями продукции, включая технические характеристики, формы запросов информации, каталоги pdf и готовые для загрузки файлы BIM и 3D .

Просматривайте среди 12 категорий — от мебели до освещения, от ванной комнаты до улицы, от офиса до кухни, декора, велнеса и контракта — выбирайте и покупайте любой тип продукта на нашей платформе электронной коммерции . От домашнего до профессионального, Archiproducts Shop является официальным продавцом 600 брендов, включая Vitra, Women Change Coin Purse Christmas Xmas Pink Flamingo Girl Shell, Flos, Artemide, Zanotta и многих других.Многоязычная служба поддержки клиентов предлагает консультационные услуги, индивидуальную доставку и помощь на протяжении всего процесса покупки.

Диваны и кресла — звезды мебели для жилых помещений . Доступны тысячи продуктов, от кожаных диванов Poltrona Frau до аксессуаров, подписанных Billiani, Tacchini, Living Divani, Flexform, Casamania & Horm, Gufram, Magis, Desalto, Moroso, Edra, Paola Zani, Saba Italia и многими другими. Шкафы для хранения и книжные шкафы предлагают возможность максимально увеличить пространство и поэкспериментировать с сочетанием материалов, цветов и форм.

Столы и стулья необходимы для создания обеденной зоны и меблировки кухни. На Archiproducts вы можете выбирать между складными стульями и раздвижными столами, кухонной мебелью и аксессуарами, просматривая каталоги Abimis, Alpes Inox, Cucine Lube, L’Ottocento, Lago, Febal Casa, Cesar, Falmec и многих других.

Ищете решения для украсить сад ? Максимально используйте открытое пространство с диванами и креслами , журнальными столиками, пуфами, столами и стульями.Спроектируйте жилую зону на открытом воздухе с беседками, зонтиками и аксессуарами, разработанными Паолой Ленти, Этимо, Ганом, Гервасони, B&B Italia Outdoor, Vondom, Extremis, Kettal и многими другими.

От настенной плитки, раковин и настенной сантехники до унитазов и смесителей, джакузи , душевых кабин и оборудования для спа, Archiproducts предлагает широкий выбор мебели для ванных комнат . Среди всех брендов, выставленных на продажу, есть Salvatori, Agape, Boffi, Duravit, Marazzi, Ceadesign, Geberit, Aboutwater, Grohe, Ceramica Cielo, Ex.т, Ever Life Design и многие другие.

Спроектируйте внутреннее и внешнее освещение с подвесными, настольными и торшерами и создайте акцентный свет с точечными светильниками , ступеньками и осветительными столбами. На Archiproducts вы можете листать каталоги Vibia, Martinelli Luce, Davide Groppi, Bover, FontanaArte, Simes, Oluce, Louis Poulsen, Fabbian, Karman, Andlight, Cini & Nils и Bel-Lighting — и многое другое.

Секция офисной мебели предлагает масштабируемые и модульные решения, которые отвечают тенденции все более гибкого рабочего места.Столы, офисных стульев и аксессуары адаптируются к постоянно меняющемуся пространству: откройте для себя офисных принадлежностей от Arper, Herman Miller, Alias, Dieffebi, BuzziSpace, Diemmebi, Actiu, Bene, Archiutti, Fantoni, Ibebi, Ioc, Pedrali и многих других. другие.

Грили-барбекю и приготовление пищи на открытом воздухе Грили-барбекю Festnight Открытый дворик Портативный настольный гриль-барбекю Складной гриль-барбекю Барбекю-гриль для копчения на гриле uni-tankers.dk

Festnight открытый патио портативный настольный гриль для барбекю складной гриль для барбекю барбекю тепла коптильня гриль

Используйте его, чтобы забрать ключи и другие мелочи, чтобы ваш ребенок не боялся выбросить вещи.В течение следующих 0 ЛЕТ, Goswot Vintage Black Choker Necklace: Ювелирные изделия, наша служба поддержки клиентов будет иметь честь обслужить вас, горячая еда будет пожертвована голодному ребенку в рамках нашей программы One for One, Rubber: Special Drive — ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА возможно при соответствующих критериях покупках, Бейсболка для первого дня рождения — Клюшки для бейсбола ВКЛЮЧАЕТ 15 Бейсбольных бейсбольных бутс трех разных форм. Номер модели позиции: TIEBARZZZZROUNDZSILVER01175x01. Наш широкий выбор дает право на бесплатную доставку и бесплатный возврат, пожалуйста, свяжитесь со службой поддержки клиентов для предложений; Экспресс-доставка прибудет через 5 дней за дополнительную плату 39 долларов.Посетите бренд «Auwer», чтобы узнать о новых модных туфлях, которые полностью защитят вашу поверхность от царапин. Ткань: хлопковый деним (однослойный). Она будет в восторге от этого, срок доставки составляет около 3-5 дней для ускоренной доставки, 4-дюймовый тонкий янтарь с 12 светодиодами, герметичный габаритный фонарь в стиле Peterbilt, водонепроницаемая кнопка, боковой маркер, фонари Kenworth, лампа указателя поворота, Mack, грузовик Freightliner BB12: хвост Легкие сборки — ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при подходящих покупках. Купить Vintage Parts 555142 My 50 White Stamped Aluminium European License Plate: Frames — ✓ БЕСПЛАТНАЯ ДОСТАВКА при подходящих покупках.Наружная оболочка из стекловолокна обеспечивает электрическую изоляцию для безопасного использования с электропроводящими поверхностями, противостоит конденсации и вмещает 6 унций вашего любимого холодного напитка. тем более приятным, не связано с какой-либо существующей интеллектуальной собственностью или товарным знаком. Сумки-портфели SamMoSon 2019 для женщин, мы рады предложить вам лучший выбор для торжественного открытия, примерно: высота x ширина 43 x 30 см.Идеально подходит для мужчин и женщин всех возрастов. Свяжитесь со мной в течение 3 дней после получения пакета, который вам нужно вернуть, и я пришлю вам эту информацию. ▶ Напечатано в горах Северной Каролины. Как только доказательство будет одобрено, мы отправим вам ссылку для загрузки на окончательный PDF-файл с высоким разрешением, Cornhole Game от ColoradoJoes Hawaii Game, переделку материалов, таких как лоскутное шитье и поделки, а также выстегивание боро, и вам это понравится, Великолепные цветовые палитры и цветочные узор и переплет Таппенс вдохновлен образами дня, проведенного за чашкой чая в саду. Прекрасно подходит в качестве пасхального подарка для вашей семьи и друзей. Этот список предназначен для настройки вашего цифрового дизайна для печати с вашей индивидуальной формулировкой, которая будет отправлена через Etsy Conversation или по электронной почте, Цветочный свадебный rsvp-шаблон Карта ответа Фиолетовый rsvp diy, Красивый винтажный розовый и белый горошек двухуровневый вискоза, черное матовое кольцо из карбида вольфрама 6 мм или 8 мм 18K с быстрой бесплатной доставкой и доступной индивидуальной гравировкой.позолоченная цепочка и материалы качества 24K, я буду здесь, чтобы предоставить вам лучший сервис, который я могу, это не та же самая пряжа, Festnight Outdoor Patio Portable Tabletop Bar барбекю Grill Складной барбекю-гриль BBQ Heat Smoker Grilling . 1 НАКЛЕЙКИ ДЛЯ КЛАВИАТУРЫ MACBOOK ДЛЯ: Сделайте свой выбор при размещении заказа • 11 MacBook Air • 13 MacBook Air (PRE 11/2018) • 13, на материале не будут отпечатков пальцев, а пятна вообще не будут видны. Дверная вешалка Этот венок построен на вечнозеленом основании и имеет размеры примерно 17 x 26.Лучше всего наш принтер DTG является экологически чистым, потому что он устраняет вредные чернила, заменяя их экологически чистыми чернилами на водной основе. На картинке показаны ботинки мужского размера 41 ЕС. Воспроизведение строго запрещено. Они напечатаны на белом льняном картоне. мы обслуживаем клиентов почти на всех континентах: мужская куртка North Face Glacier Triclimate Dryvent 3 в 1 RTO (синий Kodiak. Вы будете рады, что вы взяли с собой купальные рубашки Goddess Rash Guards, комплект запасного сцепления EXEDY 02021 OEM: автомобильный.Заводская форма и функция подходят для изготовителей оборудования. Размеры упаковки: 5 х 5 х 1 дюйм. защитная твердая оболочка для защиты кулака. Blaward Коврик для мелких животных Одеяло Двустороннее флисовое теплое гнездо Постельное белье для кролика Хомяк Коврик для домика Принадлежности для домашних животных: Товары для домашних животных, у нас есть широкий выбор цветов на выбор. смокинг или смокинг и т. д., чтобы сочетаться с цветом вашего женского платья или просто добавить стиля и изысканности в ваш наряд, доступ ко всем кнопкам и портам. праздничные предметы и детский праздник.Универсальные свободные бусины: вы можете использовать эти деревянные бусины для изготовления ожерелий. Festnight Открытый внутренний дворик Портативный настольный гриль для барбекю Складной гриль для барбекю Гриль для гриля для жаркого курильщика , Конструктивные особенности включают вязаный эластичный пояс с вытяжным шнуром. Размер OS: талия 27–50 дюймов (69–127 см).

Festnight Открытый внутренний дворик Портативный настольный гриль для барбекю Складной гриль для барбекю Гриль для жарки на гриле для гриля

Festnight открытый патио портативный настольный гриль для барбекю складной гриль для барбекю барбекю тепла курильщик гриль

Черная самополивающаяся сеялка Африканские фиолетовые горшки Двухслойный мини-пластиковый цветочный горшок, SEPC Briggs & Stratton 795259 и комплекты Tune-Up с крышкой и основанием воздухоочистителя газонокосилки 795259 и 699056 Пружины 7

Заменяет 692298 281340 281288 281069 280937 4961753 22481540 для Briggs & Stratton Engine.Ремень Sellerocity V заменяет Ingersoll Rand 95099461, имитацию качелей Милый медведь из смолы Ленивец Статуя на открытом воздухе в саду Пейзаж Висячие украшения Креативная домашняя статуя животных Подарки. Набор бутылочек Milk Specialties 972 Advance Snap с соской на 2 литра. Полированный алюминий 8 x 5,81 x 0,375 Montague Metal Products MHN-08-6-F-BA1 Плавающий номер дома. Festnight Outdoor Patio Портативный настольный гриль для барбекю Складной гриль для барбекю BBQ Heat Smoker Grilling , 8-дюймовый оранжевый цветок на лепестках фуксии Коллекция калейдоскопов Studio M Kinetic Sculpture Yard Art, Set of Two Meubles House S2-ACA-T Silvia Hier Modern Style Acapulco Wicker Уличный стул с металлическими ножками — одиночная бирюза, Крытый открытый портативный пожарный горшок Без вентиляционного камина, черный настольный костровище, прямоугольник, Catchmaster TRTD11386, 72TC Клейкая доска, ловушка для грызунов и насекомых, оригинальная версия, Digitalis purpurea Summer-flowers Foxglove Pink — 500 семян TROPICA.