K rh: Перчатка MEZZ MGL-K/RH черная правая L

Химическая структура антагониста CXCR4, KRH-1636, и его активность против ВИЧ-1. ( a ) Химическая структура KRH-1636. ( b ) Активность KRH-1636 против ВИЧ-1 в клетках МТ-4, измеренная с помощью анализа МТТ. В этом исследовании использовали HTLV-IIIB ВИЧ-1 (–□–, ложно инфицированный; –■–, ВИЧ-1). ( c ) Анти-ВИЧ-1 (NL4-3) активность KRH-1636 в анти-CD3/CD28-стимулированных РВМС, определенная анализом p24. –■–, КРХ-1636; –⋄–, 3100 драмов РА. ( d ) Ингибирование слияния клеток с помощью KRH-1636.①, клетки MOLT-4; ②, сокультура; ③, 5 мкМ KRH-1636; ④, 0,5 мкМ KRH-1636; ⑤, 0,05 мкМ KRH-1636; ⑥, 0,005 мкМ KRH-1636.

Клеток.

клетки вируса Т-клеточного лейкоза человека (HTLV)-IIIB МТ-4, MOLT-4 и MOLT-4/ВИЧ-1 поддерживали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FCS и антибиотиков (100 мкг/мл пенициллина/100 мкг /мл стрептомицина). Клетки остеосаркомы человека (HOS), экспрессирующие хемокиновые рецепторы, были любезно предоставлены H. Hoshino (Университет Гумма, Маэбаси, Япония) и содержались в среде DMEM с добавлением 10% FCS и антибиотиков.Мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) ВИЧ-1-серонегативных здоровых доноров выделяли центрифугированием в градиенте плотности, выращивали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FCS и активировали либо 1 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА, Sigma-Aldrich) для 3 дня или моноклональные антитела против CD3/CD28 в присутствии IL-2 (20 ЕД/мл, Шионоги, Осака) при 37°С.

Вирусы.

Штаммы X4 ВИЧ-1 IIIB и NL4-3 были получены из культурального супернатанта клеток MOLT-4/HTLV-IIIB и клеток COS-1, трансфицированных молекулярным клоном, соответственно, как описано (18, 19).Аликвоты вирусных запасов хранили при -80°C до использования. Титр запасов вируса определяли титрованием конечной точки 5-кратного предельного разведения в четырех повторностях на клетках МТ-4. Несколько клинических изолятов, включая штаммы X4 (YU-6, YU-10 и YU-11) (20) и штаммы R5 (YU-1 и YU-2) (21), размножались в лимфоцитах периферической крови (PBL) после стимуляции ФГА.

Иммунофлуоресценция.

CD4 ⁺ Т-клетки от нормального донора активировали магнитными шариками, связанными моноклональными антителами против CD3/CD28, в среде RPMI 1640, содержащей человеческий рекомбинантный IL-2 (rIL-2)/10% FCS, в течение 7 дней.Эти активированные клетки обрабатывали 10 мкМ AMD3100 или KRH-1636 в среде, содержащей IL-2, при 37°C в течение 1 часа. После промывания холодным PBS, содержащим 2% FCS и 0,1% NaN3 [буфер для сортировки флуоресцентно-активированных клеток (FACS)], клетки предварительно обрабатывали нормальным IgG человека в концентрации 0,1 мг/мл в буфере FACS в течение 15 минут на льду для блокирования Fc. рецепторов, а затем окрашивали непосредственно 12G5-фикоэритрином (PharMingen) в течение 30 минут или косвенно крысиными моноклональными антителами IgG1 A145, A80 (22) и T227 в концентрации 5 мкг/мл в течение 30 минут с последующим окрашиванием козьим антикрысиным IgG-FITC (DAKO) лечение в течение 30 мин на льду.После промывки клетки фиксировали 1% параформальдегидом в буфере FACS в течение 5 мин при комнатной температуре, а затем анализировали на проточном цитометре FACSCalibur (Becton Dickinson) с программным обеспечением CELLQUEST (Becton Dickinson). Область положительного результата определяли с использованием соответствующего изотипа мышиного моноклонального антитела (Beckman Coulter) и крысиного моноклонального антитела против вируса гепатита С, Mo8 изотипа IgG1 (23).

Анализ 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-3,5-дифенилформазана (МТТ, Sigma-Aldrich) с использованием клеток МТ-4 проводили, как описано (24, 25).Для анализа накопления p24 PBMC, стимулированные ФГА, инфицировали ВИЧ-1 в присутствии различных концентраций испытуемых соединений, если не указано иное (16).

Анализ слияния.

клеток MOLT-4 и MOLT-4/ВИЧ-1 HTLV-IIIB совместно культивировали в течение 1 дня, как описано (26).

Конструкция ДНК и трансфекция.

кДНК человека для CCR3 (27), CCR4 (28), CCR5 (29) и CXCR1 (30) амплифицировали с помощью ПЦР из библиотеки кДНК РВМС, стимулированной ФГА человека, и клонировали в pcDNA3.1(+) вектор экспрессии с цитомегаловирусным промотором (Invitrogen). Трансфекцию проводили клетками яичника китайского хомяка (СНО) с использованием липофектамина (Life Technologies, Гранд-Айленд, Нью-Йорк) и отбирали стабильные трансфектанты в присутствии 600 мкг/мл генетицина (Life Technologies).

Анализы связывания лигандов.

клеток СНО, экспрессирующих МТ-4, СНО или хемокиновый рецептор (5×10 ⁶ клеток на 0,2 мл на лунку), культивировали в 24-луночном микротитрационном планшете.Через 24 ч инкубации при 37°С культуральную среду заменяли буфером для связывания (среда RPMI 1640 с добавлением 0,1% БСА). Реакции связывания проводили на льду в течение 2 ч в присутствии [ ¹²⁵ I]SDF-1α [Daiichi Kagaku Yakuhin, Tokyo; удельная активность, 2200 Ки/ммоль (1 Ки = 37 ГБк)] и различные концентрации тестируемого соединения. Реакцию связывания останавливали путем отмывания свободного лиганда холодным PBS и подсчитывали связанную с клетками радиоактивность с помощью сцинтилляционного счетчика (Packard Japan, Tokyo).

Корецептор-опосредованный Ca

клеток HOS/CXCR4, нагруженных Fura2-ацетоксиметиловым эфиром, инкубировали в отсутствие или в присутствии различных концентраций KRH-1636. Изменения внутриклеточного уровня Ca ²⁺ в ответ на SDF-1α (1 мкг/мл) определяли с помощью флуоресцентного спектрофотометра.

Инфицирование мышей человека с PBL/тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID).

Самка С.Мыши B-17 SCID были приобретены у CLEA Japan (Токио). и.п. и внутриселезеночный перенос клеток проводили на мышах в возрасте от 6 до 8 недель. Мышей SCID истощали по естественным клеткам-киллерам с помощью внутрибрюшинного введения. инъекция крысиного моноклонального антитела TMβ-1 против мышиного IL-2Rβ (31) (1 мг на животное). Через 1 день 1×10 ⁷ РВМС человека вводили в брюшину вместе с человеческим rIL-4 (0,4 мкг на животное; PeproTech, Rocky Hill, NJ). На следующий день KRH-1636 (0,1 мл 2 мМ раствора на животное) или контроль (0.1 мл только среды) вводили внутрибрюшинно. Штамм NL4-3 ВИЧ-1 (0,2 мл 1 × 10 ⁴ культуры ткани 50% инфекционной дозы на миллилитр запаса) инфицировали внутрибрюшинно. На 1–7-е сутки после инфицирования такую ​​же дозу KRH-1636 или среды вводили внутрибрюшинно. В 1, 3, 5 и 7 дни после заражения также вводили 0,4 мкг rIL-4 внутрибрюшинно. На 9-й день после инфицирования собирали плазму и жидкость перитонеального лаважа (4 мл) и анализировали на ВИЧ-1 p24 с помощью набора ELISA. Одновременно подсчитывали количество CD4 ⁺ и CD8 ⁺ Т-клеток.

Для интраселезеночной инокуляции 1,5 × 10 ⁶ РВМС трансплантировали в селезенку вместе с человеческим rIL-4 (0,4 мкг) через 2 дня после обработки TMβ-1. В тот же день KRH-1636 (0,1 мл 2 мМ раствора на животное) или контроль (только 0,1 мл среды) вводили внутрибрюшинно. Через 1 день мышей заражали внутрибрюшинно. со штаммом NL4-3 ВИЧ-1 (0,2 мл 1×10 ⁴ культуры ткани 50% инфекционной дозы на миллилитр запаса). На 1–4-е сутки после заражения мышам вводили внутривенно.п. при повторных дозах KRH-1636 или сред. На 4-й день после инфицирования 0,2 мкг rIL-4 также инокулировали внутрибрюшинно. На 12-й день после инфицирования собирали плазму и жидкость перитонеального лаважа (4 мл) и анализировали на ВИЧ-1 p24.

Был проведен краткосрочный тест in vivo . Мышей лечили TMβ-1. Через 24 часа их лечили KRH-1636 (0,2 мл внутрибрюшинно) в течение 30 минут. Затем животным вводили внутрибрюшинно. с 4 × 10 ⁶ PBMC, активированными анти-CD3/анти-CD28 антителами в течение 6 дней и впоследствии инфицированными ВИЧ-1 (1–2 × 10 ³ культуры тканей, 50% инфекционной дозы на 0.1–0,2 мл в/б) в течение 2 ч. Клетки перитонеального лаважа собирали и культивировали в среде, содержащей IL-2 (20 единиц/мл). Через девять дней после культивирования проводили анализ p24 на культуральных супернатантах.

Обнаружение KRH-1636 в крови после интрадуоденального введения.

самца крыс Wistar (возраст 6 недель, CLEA Japan) использовали для исследований in vivo . KRH-1636 или метансульфированный KRH-1636 растворяли в 45% гидроксипропил-β-циклодекстрине. После акклиматизации в течение как минимум 1 недели крыс не кормили в течение ≈18 ч перед введением KRH-1636, анестезировали диэтиловым эфиром, а затем перевязывали привратник. KRH-1636 вводили в двенадцатиперстную кишку через зонд в дозе 200 мг/мл на кг (две крысы для KRH-1636 и три крысы для метансульфированного KRH-1636). Образцы крови брали из шейно-венозного отдела с помощью шприца, обработанного гепарином, через 0,25, 0,5, 1, 2, 4 и 6 ч после введения и центрифугировали для отделения плазмы. Далее 100 мкл плазмы смешивали с 400 мкл 0.1% муравьиная кислота/метанол. После центрифугирования (Kubota, Tokyo) при 15000 об/мин в течение 5 мин супернатант выпаривали досуха в токе азота, образцы растворяли в растворе 25% ацетонитрила/0,1% муравьиной кислоты и анализировали на жидкостном хроматографическом масс-спектроскопе QP8000α ( Шимадзу). Анти-ВИЧ-1-активность в серийно разбавленной крысиной сыворотке с полной средой измеряли с помощью анализа МТТ с использованием клеток МТ-4.

Результаты

KRH-1636 — мощный и селективный ингибитор Х4 ВИЧ-1.

Более 1000 соединений из химической библиотеки Kureha Chemical Industry исследовали на анти-ВИЧ-1-активность с помощью стандартного МТТ-теста с использованием клеток CXCR4 ⁺ MT-4. Путем оптимизации ведущего соединения мы обнаружили, что KRH-1636 (рис. 1 a ) является чрезвычайно мощным ингибитором репликации ВИЧ-1 в клетках МТ-4. Химия будет описана в другом месте. KRH-1636 полностью ингибировал репликацию X4 ВИЧ-1 (штамм IIIB) в клетках МТ-4 при такой низкой концентрации, как 0.06 мкМ (рис. 1 b ). Его 50% и 90% эффективные концентрации (EC ₅₀ и EC ₉₀ ) составляли 0,0193 и 0,0478 мкМ соответственно. 50% цитотоксическая концентрация (CC ₅₀ ) KRH-1636 составляла 406,21 мкМ при использовании клеток МТ-4. Таким образом, индекс селективности (отношение CC ₅₀ к EC ₅₀ ) KRH-1636 был >10000, что указывает на то, что это соединение является чрезвычайно активным и селективным.

Ингибирующая активность KRH-1636 в отношении репликации X4 HIV-1 (NL4-3) в PBMC также была продемонстрирована с помощью анализа накопления p24 в культуральных супернатантах клеток, инфицированных вирусом. KRH-1636 (0,0003–20 мкМ) снижал уровни антигена дозозависимым образом в любой момент времени (рис. 1 c ). KRH-1636 также был эффективен против HTLV-IIIB и трех клинических изолятов, включая YU-6 (20), YU-10 и YU-11, и продемонстрировал силу действия, аналогичную активности штамма NL4-3 (таблица 1). . Напротив, KRH-1636 был неэффективен против инфекций R5 HIV-1, YU-1, YU-2 (ссылка 21; таблица 1) и NL4-3 с модифицированной оболочкой (данные не показаны) в РВМС. Специфические ингибиторы CXCR4, T22 и AMD3100, полностью ингибировали репликацию штамма IIIB при 0.3 и 0,28 мкМ соответственно, хотя они не ингибировали репликацию штамма R5 ВИЧ-1 Ba-L при концентрациях до 100 мкМ (данные не показаны).

Активность KRH-1636 против ВИЧ-1 в PBMCs

KRH-1636, по-видимому, ингибировал образование синцития между MOLT-4 и его ВИЧ-1-конвертированными клетками MOLT-4 (рис. 1 d ). Это указывало на то, что KRH-1636 проявлял свой эффект на начальной стадии инфекции ВИЧ-1, такой как проникновение вируса и слияние мембран в клетках-мишенях.

Все эти данные показывают, что эффект KRH-1636 очень похож на эффект T22 и AMD3100, и убедительно свидетельствуют о том, что KRH-1636 может влиять на функцию CXCR4 в качестве корецептора.

KRH-1636 ингибирует связывание лиганда с CXCR4.

Чтобы выяснить, оказывает ли KRH-1636 свое действие в качестве антагониста CXCR4, было изучено ингибирующее действие соединения на связывание лиганда с корецептором с использованием клеток MT-4, которые спонтанно экспрессируют CXCR4.Результат показал, что связывание [ ¹²⁵ I]SDF-1α было эффективно и дозозависимо подавлено, показывая, что IC ₅₀ KRH-1636 (фиг. 2 a ) и контрольного AMD3100 составляет 0,013 мкМ и 0,068 мкМ. , соответственно. Чтобы определить, является ли ингибирующее действие KRH-1636 на связывание хемокинов специфичным для CXCR4, активность KRH-1636 исследовали в клетках CHO, стабильно экспрессирующих CXCR1, CCR3, CCR4 или CCR5. Это соединение не влияло на связывание [ ¹²⁵ I]IL-8, [ ¹²⁵ I]эотаксин, [ ¹²⁵ I]TARC (хемокин, регулируемый тимусом и активацией) или [ ¹²⁵ I ]RANTES к CXCR1, CCR3, CCR4 и CCR5 соответственно (рис. 2 и ). Эти данные ясно демонстрируют, что KRH-1636 избирательно ингибирует связывание SDF-1α с CXCR4.

Ингибирующее действие KRH-1636 на связывание хемокинов с клетками и SDF-1α-индуцированную мобилизацию Ca ²⁺ в клетках HOS/CXCR4. ( a ) Ингибирующее действие KRH-1636 на связывание хемокинов с клетками CHO, экспрессирующими MT-4 или CXCR1-, CCR3-, CCR4- или CCR5. Процент связывания рассчитывали как 100 × [(связывание с ингибитором — неспецифическое связывание)/(связывание без ингибитора — неспецифическое связывание)].TARC, хемокин, регулируемый тимусом и активацией. ( b ) Ингибирующее действие KRH-1636 на SDF-1α-индуцированную мобилизацию Ca ²⁺ в клетках HOS/CXCR4.

KRH-1636 ингибирует CXCR4-опосредованную передачу сигналов Ca

В экспериментах по мобилизации Ca ²⁺ , индуцированных хемокинами, SDF-1α явно увеличивал внутриклеточный уровень Ca ²⁺ в клетках HOS/CXCR4 при концентрации 1 мкг/мл (фиг. 2 b ).Добавление 10 мкМ KRH-1636 не влияло на уровень Ca ²⁺ , но сильно отменяло вызванное SDF-1α повышение внутриклеточного уровня Ca ²⁺ в клетках HOS/CXCR4, и эффект зависел от дозы. (рис. 2 б ). Напротив, это соединение не влияло на мобилизацию Ca ²⁺ , индуцированную RANTES, MCP-1, эотаксином, хемокином макрофагального происхождения и MIP-1α в HOS/CCR1, HOS/CCR2b, HOS/CCR3, HOS/CCR4. и клетки HOS/CCR5 соответственно, даже при концентрации 10 мкМ (данные не показаны).Эти результаты показывают, что KRH-1636 избирательно блокирует CXCR4-опосредованную передачу сигналов Ca ²⁺ .

Взаимодействие KRH-1636 с CXCR4.

Мы использовали четыре различных типа моноклональных антител: 12G5 [анти-CXCR4, нейтрализующие ВИЧ, распознающие его внеклеточную петлю (ECL)1 и -2], A145 (анти-CXCR4, распознающие его N-конец), A80 (анти-CXCR4, распознающие его N-конец). , усиливающий ВИЧ, распознающий его ECL3) и T227 (анти-CCR5), для изучения взаимодействия KRH-1636 с CXCR4. Связывание моноклональных антител 12G5 и A80, но не моноклональных антител A145 и T227, с CD3-активированными Т-клетками резко ингибировалось KRH-1636 (рис. 4, опубликованная в качестве вспомогательной информации на веб-сайте PNAS, www.pnas.org). Интересно, что контрольный антагонист AMD3100 показал аналогичный результат. На основании этих данных настоятельно предполагается, что KRH-1636 ингибирует связывание 12G5 и A80 с CXCR4, не вызывая понижающей модуляции молекулы CXCR4 и не влияя на экспрессию CCR5.

KRH-1636 блокирует репликацию X4 ВИЧ-1 у мышей человека PBL/SCID.

KRH-1636 исследовали, чтобы определить, ингибирует ли он репликацию вируса X4 in vivo . Для этого мы использовали как долгосрочные, так и краткосрочные анализы in vivo с человеческими мышами PBL/SCID. Для долгосрочных испытаний мы применяли две разные системы, в которых мышей PBL/SCID человека конструировали либо внутрибрюшинно, либо внутрибрюшинно. или интраселезеночная инокуляция РВМС. Поскольку эффект инфекции вируса X4 (NL4-3) не так ясен, как эффект инфекции вируса R5 у мышей PBL/SCID человека, C.Мышей B-17 обрабатывали человеческим rIL-4 в течение периода инфекции для усиления репликации X4 HIV-1 (см. Материалы и методы ). Количество p24 в жидкости перитонеального лаважа у пяти из семи животных с РВМС, которым вводили внутрибрюшинно. были ниже определяемого уровня у мышей, получавших KRH-1636, через 9 дней после заражения, тогда как виремия была отмечена у всех семи нелеченых мышей (таблица 2). Однако снижение количества ВИЧ-1-инфицированных CD4 ⁺ Т-клеток не было очевидным у нелеченых мышей в настоящих экспериментальных условиях (данные не показаны).Точно так же количество p24 в плазме и перитонеальном лаваже у двух животных с РВМС, которым вводили интраселезенку, было ниже обнаруживаемого уровня у мышей, получавших KRH-1636, после заражения, тогда как виремия была отмечена у трех необработанных мышей (данные не показаны). В краткосрочном тесте in vivo KRH-1636 явно ингибировал репликацию вируса и ВИЧ-1-индуцированное снижение CD4 ⁺ Т-клеток, как наблюдалось в анализах in vitro (таблица 3).

Эффекты KRH-1636 против ВИЧ-1 у мышей PBL-SCID человека по оценке долгосрочного теста in vivo 

Эффекты KRH-1636 против ВИЧ-1 у мышей PBL-SCID человека по оценке краткосрочного in vivo  теста

KRH-1636 эффективно всасывается из двенадцатиперстной кишки в кровь.

Наконец, всасываемость KRH-1636 исследовали на крысах, как описано в Материалы и методы . Концентрацию KRH-1636 в плазме или сыворотке контролировали жидкостной хроматографией МС (плазма) и анти-ВИЧ-1 активностью (сыворотка) после интрадуоденального введения. Для повышения доступности препарата метансульфонированный аналог KRH-1636 также был синтезирован и изучен аналогичным образом. Результаты показали, что эти соединения эффективно всасывались из двенадцатиперстной кишки крыс (рис.3, a для KRH-1636 и b для метансульфированного KRH-1636). Биодоступность KRH-1636 и метансульфонированного KRH-1636 в этом эксперименте оценивалась как ≈7% и 69%, соответственно, по данным жидкостной хроматографии МС. Кроме того, EC ₅₀ (%) и EC ₉₀ (%) сыворотки через 60 минут после введения KRH-1636 составляли 0,18 и 0,27 соответственно, как определено с помощью анализа МТТ с использованием клеток МТ-4 (фиг. 3 с ). В этом эксперименте концентрация KRH-1636 в плазме через 60 минут после введения составляла 30.6 мкМ. Следовательно, концентрация KRH-1636 в крови достигла уровней, ингибирующих репликацию ВИЧ.

Всасываемость KRH-1636 и метансульфированного KRH-1636 после интрадуоденального введения крысам Wistar. Двум и трем крысам вводили KRH-1636 ( и ) и метансульфонированный KRH-1636 (b ) соответственно. Каждый символ представляет данные от каждого животного. ( c ) Анализ МТТ проводили с использованием клеток МТ-4 для определения EC ₅₀ (%) и EC ₉₀ (%) сыворотки через 60 минут после введения KRH-1636.–□–, KRH-1636/макет; –■–, КРХ-1636/ВИЧ-1; –○–, контроль/макет; –●–, контроль/ВИЧ-1.

Обсуждение

В этом отчете демонстрируется антагонист CXCR4, всасываемый в двенадцатиперстной кишке, KRH-1636, который обладает мощной активностью против ВИЧ как in vivo , так и in vitro .

KRH-1636 избирательно ингибировал инфицирование Т-клеточной линии тропными штаммами вируса X4, включая несколько клинических изолятов, не влияя на R5 ВИЧ-1. Макрофаготропные штаммы вируса R5 выделяются у людей вскоре после сероконверсии и в течение бессимптомного периода заболевания, по-видимому, ответственны за половую и парентеральную передачу и представляют собой наиболее распространенный фенотип (32, 33). Напротив, изоляты Х4 ВИЧ-1, как правило, появляются у инфицированных лиц на более поздних стадиях инфекции при переходе от бессимптомного к симптоматическому состоянию и могут быть вовлечены в быстрое снижение CD4 ⁺ Т-лимфоцитов и прогрессирование до СПИДа из-за сильного цитопатия (34). Поэтому важно найти методы лечения, ингибирующие опосредованную CXCR4 инфекцию X4 ВИЧ-1, чтобы заблокировать прогрессирование заболевания до СПИДа.

Ингибирование хемокиновых рецепторов с помощью KRH-1636, по-видимому, было специфичным для CXCR4, поскольку KRH-1636 сильно ингибировал связывание [ ¹²⁵ I]SDF-1α с клетками МТ-4 (рис.2 и ). Кроме того, это соединение не ингибировало связывание хемокинов с CXCR1, CCR3, CCR4 или CCR5. Следовательно, было показано, что ингибирующий эффект KRH-1636 является селективным в отношении CXCR4. Ингибирующее действие KRH-1636 на связывание моноклональных антител с CXCR4 (рис. 4) также подтверждает это мнение. Специфичность KRH-1636 в отношении CXCR4 кажется чрезвычайно важной с химиотерапевтической точки зрения, поскольку неспецифическое ингибирование рецепторов β-хемокинов может вызывать серьезные побочные эффекты, связанные с нарушением регуляции хемокинов.

Подобно AMD3100, KRH-1636 не индуцировал интернализацию CXCR4 (рис. 4). Однако KRH-1636 подавлял связывание анти-CXCR4-антител, A80 и 12G5, с активированными CD4 ⁺ Т-клетками. Поскольку эти моноклональные антитела направлены на разные ECL семитрансмембранного рецептора CXCR4, возможно, что KRH-1636 может взаимодействовать со всеми тремя ECL. Альтернативно, KRH-1636 может индуцировать конформационные изменения в CXCR4 после связывания с другим сайтом корецептора.Точный сайт на молекуле CXCR4, на которую нацелено это соединение, еще предстоит определить.

Пероральная доступность остается одной из ключевых целей, которую необходимо достичь в качестве препарата против ВИЧ, поскольку ретровирусная инфекция сохраняется на протяжении всей жизни инфицированных людей. Так, пероральное введение KRH-1636 проводили крысам и мышам SCID (данные не представлены), у которых определяли концентрации соединения в плазме и фармакокинетические параметры. Хотя об измеримом поглощении доступных в настоящее время антагонистов хемокиновых рецепторов не сообщалось, с KRH-1636 был достигнут существенный перенос не только как химическое, но и как активное анти-ВИЧ соединение из желудочно-кишечного тракта в кровь. Необходимо дальнейшее улучшение пероральной доступности и усиление проникновения в центральную нервную систему.

C.B-17 SCID обнаруживают множественные иммунологические дефекты, и было продемонстрировано, что этот мутантный штамм эффективно получает PBL человека (35). После заражения ВИЧ-1 типа R5, включая штаммы JR-CSF и NFN-SX, мог очень эффективно реплицироваться в связи с очевидным истощением CD4 ⁺ Т-клеток. Однако вирус Х4 плохо реплицируется в этой системе, поэтому снижение количества CD4 ⁺ Т-клеток не является очевидным (36).Чтобы преодолеть эту проблему, мышей лечили человеческим IL-4, поскольку наш предварительный результат показал, что штаммы вируса X4 благоприятствуют доминантному статусу Т-хелперов 2 для их репликации и индукции снижения CD4 ⁺ Т-клеток (37). Наши исследования ясно показали ингибирующее действие KRH-1636 in vivo на репликацию вируса X4. Несмотря на то, что это исследование проводилось с использованием и. п. инъекции соединения, пероральное введение должно быть эффективным, поскольку пероральная биодоступность и эффективная адсорбция этого соединения были подтверждены на крысах и мышиной системе SCID.

Остается ответить на несколько вопросов, касающихся клинических результатов терапии на основе корецепторов (38). Допустимо ли блокирование нормальной функции CXCR4, вызванное лечением антагонистами? В случае антагонистов CCR5 это будет безопасно из-за отсутствия зарегистрированных иммунологических нарушений у лиц с гомозиготами CCR5∆32. Однако ингибирование взаимодействий SDF-1α-CXCR4 может быть более проблематичным, поскольку нокаут гена SDF-1α или CXCR4 у мышей вызывает серьезные дефекты, включая аномальное кроветворение, развитие мозжечка и васкуляризацию желудочно-кишечного тракта (39–41).Не следует ли рассматривать возникновение лекарственной устойчивости как серьезную проблему? Маловероятно, что во втором ECL CXCR4 происходят частые мутации. Однако ВИЧ-1 может приобретать устойчивость к KRH-1636 в результате аминокислотных мутаций белка оболочки вируса gp120. Фактически, недавно сообщалось о X4 ВИЧ-1, устойчивом к SDF-1α и AMD3100 (42). Резистентный вирус имел множественные мутации в gp120, но не переключал использование хемокинового рецептора. Мы надеемся, что на эти и связанные с ними вопросы будут даны ответы по мере того, как терапия на основе корецепторов будет проходить клинические испытания.Острые токсикологические исследования показали отсутствие тяжелой токсичности у крыс, получавших KRH-1636 (1,5 мг/кг в сутки) внутривенно. введение в течение 4 дней (данные не показаны).

В заключение, KRH-1636, который может всасываться из двенадцатиперстной кишки в кровь, кажется многообещающим агентом для лечения и профилактики ВИЧ-1-инфекции.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Министерства образования, культуры, спорта, науки и технологий Японии, Министерства здравоохранения, труда и социального обеспечения Японии и Core Research for Evolutional Science and Technology of Japan.

Сноски

• ↵† К. И., С.Ю.-К. и Ю.Т. в равной мере внесли свой вклад в эту работу.

• ↵** Кому следует направлять корреспонденцию. Электронная почта: yamamoto.mmb{at}tmd.ac.jp.

Сокращения

ВИЧ-1,

ВИЧ 1 типа;

CCR,

CC хемокиновый рецептор;

CXCR,

CXC хемокиновый рецептор;

SDF-1α,

фактор 1α, полученный из стромальных клеток;

HOS,

остеосаркома человека;

HTLV,

Вирус Т-клеточного лейкоза человека;

РВМС,

мононуклеарные клетки периферической крови;

ФГА,

фитогемагглютинин;

ЛПК,

лимфоциты периферической крови;

рИЛ-2,

рекомбинантный ИЛ-2;

МТТ,

3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-3,5-дифенилформазан;

CHO,

Яичник китайского хомячка;

SCID,

тяжелый комбинированный иммунодефицит;

ECL,

внеклеточная петля

• highwire.org/Journal» hwp:start=»2001-09-04″> Поступила 4 сентября 2001 г.
• Принято 23 января 2003 г.

• Copyright © 2003, Национальная академия наук

Главный врач KRH обсуждает вакцинацию против COVID-19 распространения вакцины против COVID-19 среди передовых медицинских работников стало большим успехом.

«В итоге мы ввели в общей сложности 1170 доз вакцины против COVID от Pfizer», — сказал главный медицинский директор KRH д-р.— сказал Дуг Нельсон.

Он говорит, что первый раунд вакцинации в KRH на прошлой неделе прошел максимально гладко.

Вакцины распределялись среди медицинских работников в течение двух дней по электронному расписанию во избежание скопления людей.

Доктор Нельсон говорит, что больница на самом деле получила больше доз вакцины против COVID-19, чем ожидалось изначально.

«Мы должны были получить 975 доз, по пять доз на каждую мерзавку, и оказалось, что в каждой мерзавке действительно шесть доз, поэтому мы использовали лишнее и сделали эти прививки», — сказал доктор. — сказал Нельсон.

«И Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов фактически разрешило это делать, поэтому мы чувствуем, что получили небольшой бонус в плане возможности иммунизировать людей», — добавил он.

Доктор Нельсон говорит, что следующая партия вакцины прибудет в больницу в конце этой недели

Он говорит, что второй партией будет вакцина «Модерна», которая, скорее всего, будет распределена среди основных работников через неделю после Рождества

«Полицейский, пожарный, учителя и так далее — не прямая медицинская помощь рабочих, а людей, которые являются важным персоналом для поддержания жизни нашего общества», — говорит доктор.— сказал Нельсон.

Хотя первая раздача вакцины от COVID-19 в округе Флэтхед выглядит многообещающе, доктор Нельсон предупреждает, что граждане должны продолжать следовать рекомендациям по борьбе с COVID-19, чтобы защитить друг друга.

«Мы еще не вышли из этого, у нас есть некоторая надежда, но мы еще не достигли этого, поэтому продолжайте делать то, что, как мы знаем, помогает предотвратить распространение вируса», — сказал доктор Нельсон.

Доктор Нельсон сообщил MTN News, что ни у кого из тех, кто получил первую партию вакцины в Kalispell Regional Healthcare, не было зарегистрировано серьезных побочных эффектов.

Все медицинские работники, получившие вакцину в KRH, находились под наблюдением в течение 15 минут после вакцинации.

Что означает KRH? Бесплатный словарь

‎Академия KRH в App Store

Разработчик, Epignosis LLC, указал, что политика конфиденциальности приложения может включать обработку данных, как описано ниже. Для получения дополнительной информации см. политику конфиденциальности разработчика.

Данные, связанные с вами

Следующие данные могут быть собраны и связаны с вашей личностью:

• Место расположения
• Контактная информация
• Пользовательский контент
• Идентификаторы
• Диагностика

Данные не связаны с вами

Могут быть собраны следующие данные, но они не связаны с вашей личностью:

• История поиска
• Данные об использовании
• Другие данные

Методы обеспечения конфиденциальности могут различаться, например, в зависимости от используемых вами функций или вашего возраста.