Грузоподъемность маз 555142: МАЗ-5551: технические характеристики

>

МАЗ 5551: цена МАЗ 5551, технические характеристики МАЗ 5551, фото, отзывы, видео

Одноклассники МАЗ 5551 по цене

К сожалению, у этой модели нет одноклассников…

Отзывы владельцев МАЗ 5551

МАЗ 5551, 2008 г

Проходимость у МАЗ 5551 не очень, короткий. Засаживается 5551 буквально на ровном месте, в засуху по полям наверно ездить можно, после грибного дождика уже не заедешь. Так что с грузом едет лучше, чем пустой. Правда, КПП пришлось ремонтировать. С коробкой у МАЗ 5551 есть свои особенности: с места при трогании нужно включить 3 передачу, а потом 1, 2, потому что сразу их не включишь. Если эксплуатировать зимой, то в КПП заливать масло нужно специальное. В КПП стоит насос для смазки подшипников вторичного вала. Густым маслом выдавливает сальник в стакане выжимного. Так что «трансмиссионка» в КПП не нужна. Возили по 9-10 тонн. Пришли «Клаасы», пришлось еще наращивать кузова.

Стали возить 11 тонн, очень сильно мотает. Так что 9-10 нормально. Часто бывает вибрация, основная причина — кардан и хвостовик. Кардан приличный, но нет подвесного и большая нагрузка на шлицевую и хвостовик. Рычаг КПП у МАЗ 5551 начинает звенеть. Да жестковат, но КамАЗ, на котором работаю, не лучше. Диска нового в магнитоле хватает на полчаса.

   Достоинства: двигатель. КПП.

   Недостатки: проходимость. Жесткий.

  Владимир, Дмитров


МАЗ 5551, 2009 г

Нормальная рабочая лошадь. Выпускается МАЗ 5551 с несколькими модификациями кузова и двигателя (лучше с ЯМЗ-236). У нас в колхозе практически все наращивают борта. Берут два бункера от Дона, Акроса или Полесья (на нормальных грунтах цепляют прицеп, но он с боковой разгрузкой). На ходу МАЗ 5551 жестковат немного, особенно пассажирское сиденье. Антикоррозионная обработка кабины не очень качественная, через пару лет появляется ржавчина на дверках кабины. Двигатель надежный, за кузовом надо следить — раму выворачивает при огромных нагрузках.

Расход радует, цены на запчасти тоже, подрамник у меня из телеги кировской сделан (ПТС), рама теперь не крутится как с родным кузовом. Бункер из под полесья (который 4 тонны берет) вмещает спокойно, нашивки по бортам в 15 см высотой меньше половины скрывало.

   Достоинства: отличная рабочая машина.

   Недостатки: слабая рама. Проходимость.

  Павел, Краснодар

 

5551 — история, характеристики, фото и видео

В начале серийного производства внешнему виду автомобиля не придавали особого значения, и он был достаточно скудным. В частности кабина машины не имела капота. Спереди был установлен крепкий бампер больших размеров, огромные фары и средненькая решетка для радиатора. Главный элемент машины – кузов. Здесь он поднимался и откидывался назад и имел один открывающийся борт.

В 1998 году был проведен рестайлинг данной модели. На автомобиль установили кабину более современного образца, ее вместимость стала больше.

Теперь кабину можно было откидывать вперед для технического осмотра и ремонта, находящихся под ней узлов агрегата. Бортовая панель получила более удобный дизайн с большей функциональностью. Кресло для водителя установлено рессорного типа, с возможностью двигаться в перед и назад. Зеркала имеют систему электроподогрева.

После рестайлинга старый бампер заменили на более обтекаемый. На него помимо фар, которые были немного модифицированы, устанавливались указатели поворотов. Была пересмотрена радиаторная решетка и ее размер стал больше, что увеличивает охлаждение двигателя в жаркий период. Лобовое стекло у старых моделей было раздельное, после модификации оно стало панорамным, обладающим широким обзором. На крыше автомобиля появился спойлер.

Конструкция и комплектация

Конструкция МАЗ-5551 выполнена качественно, но не совсем удобна для эксплуатации. Как свидетельство этому жесткое крепление кабины к раме без использования пружинного смягчителя. К этому можно добавить рулевое колесо и его колонку. Для управления автомобилем требуется прилагать немалые усилия. Кузов выполнен цельнометаллическим и, как указывалось выше, имеет заднюю разгрузку. Для комфортного пребывания в кабине в зимний период под днищем расположена система подогрева, работающая на переработанных выхлопах. При движении в груженом состоянии не возникает сложности выполнять повороты, чему способствует установленный за задним мостом стабилизатор.

Габариты грузовика составляют: длина – 5,99 м, ширина – 2,5 м и высота – 2,3 м. Тормозная система довольно надежная и выполнена просто, но недостатком является ее длительное закачивание. Основой системы торможения передних и задних колес являются барабаны на пневматическом управлении. Передняя и задняя подвески выполнены в виде рессоров. На базовую версию автомобиля устанавливается трансмиссия в виде пятиступенчатой механической коробки передач ЯМЗ-236П. С модернизацией модели и увеличением грузоподъемности до 10 тонн, стали устанавливать коробку ЯМЗ-2361.

В настоящее время МАЗ-5551 более совершенный и современный грузовик, на котором часто устанавливается трансмиссия западного производства.

На МАЗ-5551 устанавливался дизельный двигатель V-6 ЯМЗ-236М2, изготавливаемый на моторном заводе в Ярославле. Позже, в процессе модернизации он был заменен на современный двигатель ЯМЗ-6563.10. Такой мотор отвечает европейским требованием экологичности и соответствует классу «Евро-3». Данный агрегат потребляет топлива около 25 литров на 100 км, если двигаться при средней скорости 60 км/ч. Мощность мотора составляет 180 л.с. Топливный бак рассчитан на 200 литров.

Вложиться в данную модель самосвала, будет лучшим решением для его дальнейшего использования в строительстве, разнообразном хозяйстве и т.д. При транспортировке различных сыпучих материалов не возникнет непредвиденных проблем в дороге и расход топлива не ударит по кошельку.  

Самосвал МАЗ 5551 W3-425-000 — 4х2, 245 л.с., 10 тн, 5,5 м³, трехсторонняя разгрузка

КАМАЗ 65117 с КМУ INMAN IM 320 – бортовой автомобиль для работы с любыми грузами!

КАМАЗ 65117 с крано-манипуляторной установкой INMAN IM 320 – бортовой автомобиль для работы с любыми грузами.

Грузовой бортовой КАМАЗ 65117 с крано-манипуляторной установкой – один из самых востребованных в России среди автомобилей с КМУ. Популярность машины прежде всего обусловлена тем, что она изначально создавалась как бортовая для решения транспортных задач. В комплектацию входит высокая кабина со спальным местом, тахограф, бак 500л, тягово-сцепное устройство типа шкворень-петля. Длина бортовой платформы 6.8 м, с установленной КМУ, наиболее оптимальная с точки зрения компромисса между перевозкой длинномерных грузов и манёвренностью.

Двигатель: Камаз-740, объёмом 11.7 л, мощностью 300 л.с. и крутящим моментом  1275 Нм.

Коробка передач: механическая ZF9, позволяющая реализовать все возможности автомобиля и обладающая следующими достоинствами:

— 9 ступеней

— высокий ресурс

— оптимальный ряд передаточных чисел

— наличие «ползучей» передачи с высоким передаточным отношением

— низкий уровень шума

— лёгкое переключение

INMAN IM 320 –  локализованная модель австрийской КМУ Palfinger PK 32080. IM 320 одна из самых грузоподъемных КМУ, производимых в России и предназначена для монтажа на автомобильные шасси. Обладает отличными грузоподъёмными характеристиками, высоким качеством (пройдены ресурсные и антикоррозионные испытания в Австрии), но более низкой ценой. Число секций телескопирования – 2, может быть увеличено до 5, в этом случае вылет стрелы достигнет 14 м. Грузовой момент 30,4 т*м, максимальная грузоподъёмность 7,5 тонн на вылете 4 метра.

Превосходные грузовысотные характеристики КМУ позволяют разгружать / погружать и перевозить крупногабаритные агрегаты и грузы, а оператору свободно перемещать груз даже в условиях минимального свободного пространства. Кран-манипулятор INMAN IM 320 может эксплуатироваться при температуре воздуха от +40 до – 40 °C, что дает возможность использовать данный автомобиль в суровых погодных условиях.

МАЗ 5551 (a2, 47) обзор

Характеристики

Модель автомобиля: МАЗ-5551А2
Модель двигателя: ЯМЗ-6563. 10 (ЕВРО-3)
Мощность двигателя, кВт/л.с.: 169/230
Коробка передач (число передач): ЯМЗ-236П (5)
Тип разгрузки: 3-х сторонняя
Объем платформы, м. куб.: 13
Объем топливного бака, л.: 200
Размер шин: 12,00R20
Тип кабины:
малая
РАСПРЕДЕЛЕНИЕ МАССЫ И НАГРУЗОК
на переднюю ось, кг: 6700
на задний мост, кг: 11500
Технически допустимая полная масса автомобиля, кг: 18200
Технически допустимая грузоподъемность, кг: 9000

 

Предназначены для перевозки различных сельскохозяйственных сыпучих грузов в составе автопоезда.  

Купить или продать запасные части на МАЗ 5551 (a2, 47) вы можете на проекте www.fast-price.ru.
Сервис представляет собой маркетплейс (интернет-площадку) по поиску автозапчастей и сравнению цен на них. На сайте представлены как оригинальные запчасти от официальных производителей, так и их качественные аналоги, которые зарекомендовали себя на рынке автозапчастей с наилучшей стороны. На сайте можно подобрать запчасть по необходимым критериям и параметрам с помощью удобной фильтрации и автокаталогов.

Технические характеристики МАЗ (MAZ) 55 5551 2 дв. самосвал 5МКПП

Начало производства: неизвестно
Окончание производства: в производстве
Кузов: 2 дв. самосвал
Тип двигателя:
Марка топлива: Дизельное топливо
Объем двигателя, куб. см.: 11150
Объем двигателя, л.: 11.1
Клапанов на цилиндр:
Мощность, л.с.: 180
Достигается при об. в мин.:
Крутящий момент, Нм/об. в мин.: 667
Максимальная скорость, км/ч: 83
Время разгона до 100 км/ч, сек. :
Расход топлива (смешанный цикл), л. на 100 км.:
Расход топлива (в городе), л. на 100 км.:
Расход топлива (за городом), л. на 100 км.:
Компоновка двигателя:
Система питания: Дизель
Система газораспределения:
Диaметр цилиндра, мм: 130
Ход поршня, мм: 140
Выхлоп CO2, г/км:
Коэффициент сжатия: 16. 5
Тип привода: Задний
Коробка передач: МКПП
Количество ступеней: 5
Передняя подвеска:
Задняя подвеска:
Передние тормоза:
Задние тормоза:
Длина, мм:
Ширина, мм:
Высота, мм:
Колесная база, мм:
Колея колес спереди, мм:
Колея колес сзади, мм:
Количество мест:
Размер шин:
Снаряженная масса, кг:
Допустимая масса, кг:
Объем багажника, л:
Объем топливного бака, л: 200
Диаметр разворота, м:
Гарантия от коррозии, лет:

Новый и общий неоантиген, полученный из мутации варианта гистона 3 h4.

3K27M, для Т-клеточной терапии глиомы | Журнал экспериментальной медицины

Медиана общей выживаемости детей с диффузной внутренней глиомой моста (DIPG) составляет менее одного года. Большинство диффузных срединных глиом, в том числе более 70% DIPG, содержат аминокислотную замену лизина (K) на метионин (M) в положении 27 гистона 3 варианта 3 (h4.3). Из клона Т-клеток CD8 + , полученного путем стимуляции Т-клеток HLA-A2 + CD8 + синтетическим пептидом, включающим h4.Мутация 3K27M, комплементарная ДНК для α- и β-цепей Т-клеточного рецептора (TCR) была клонирована в ретровирусный вектор. TCR-трансдуцированные Т-клетки HLA-A2 + эффективно уничтожали клетки глиомы HLA-A2 + h4.3K27M + антиген- и HLA-специфическим образом. Адаптивный перенос TCR-трансдуцированных Т-клеток значительно подавлял прогрессирование ксенотрансплантатов глиомы у мышей. Анализы сканирования аланином показали отсутствие известных человеческих белков, имеющих общие ключевые аминокислотные остатки, необходимые для распознавания TCR, что позволяет предположить, что TCR можно безопасно использовать у пациентов. Эти данные дают нам прочную основу для разработки терапии на основе Т-клеток, нацеленной на этот общий неоэпитоп.

Злокачественные глиомы, включая глиобластому и диффузную срединную глиому (ДМГ), являются летальными опухолями головного мозга как у взрослых, так и у детей (Louis et al., 2016). Действительно, опухоли головного мозга являются ведущей причиной смертности и заболеваемости детей, связанных с раком (Группа обзора развития опухолей головного мозга, 2000 г.). Дети с DIPG имеют 1-летнюю выживаемость без прогрессирования менее 25% и медиану общей выживаемости 9–10 месяцев при текущем лечении (Kebudi and Cakir, 2013; Schroeder et al., 2014).

Концепция иммунотерапии рака основана на представлении о том, что иммунная система человека может распознавать антигены, происходящие от рака, как «чужие». В недавних испытаниях иммунотерапии рака опасные для жизни и фатальные события были вызваны попаданием в цель (Johnson et al. , 2009; Morgan et al., 2010; Parkhurst et al., 2011) или нецелью (Cameron et al., 2013; Morgan et al., 2013) перекрестная реактивность Т-клеток против нормальных клеток.Эти наблюдения подчеркивают необходимость расширения списка доступных опухолеспецифических антигенов, таких как антигены, полученные в результате мутаций (т. е. неоантигены), для безопасной и эффективной иммунотерапии. Хотя список антигенов, которые могут быть использованы для иммунотерапии глиом, за последнее десятилетие расширился (Okada et al., 2009; Reardon et al., 2013), существует не так много действительно специфичных для глиомы антигенов, за исключением антигенов, полученных из эпидермальных клеток. рецептор фактора роста vIII (EGFRvIII; Thorne et al., 2016) и мутантная изоцитратдегидрогеназа 1 (IDh2; Schumacher et al., 2014).

Недавние генетические исследования показали, что злокачественные глиомы у детей и молодых людей часто обнаруживают соматические миссенс-мутации в варианте 3. 3 гистона h4 (h4.3; Schwartzentruber et al., 2012). Большинство случаев DMG и более 70% случаев DIPG (Khuong-Quang et al., 2012) содержат аминокислотную замену лизина (K) на метионин (M) в положении 27 h4.3 (мутация h4.3K27M). . Мутация h4.3K27M в DMG приводит к глобальной редукции h4K27me3, что приводит к подавлению мишеней поликомб-репрессивного комплекса 2 (PRC2), тем самым вызывая аберрантную экспрессию генов (Jones and Baker, 2014).Пациенты с h4.3K27M + DIPG обычно имеют более короткое время выживания, чем пациенты с немутировавшим h4.3 (h4.3WT; Khuong-Quang et al., 2012).

Мы обсуждаем здесь идентификацию HLA-A*02:01-рестриктированного эпитопа CD8 + CTL, содержащего мутацию h4.3K27M. Кроме того, мы клонировали кДНК для α- и β-цепей TCR, полученных из h4.3K27M-специфического клона CD8 + Т-клеток. TCR связывается с комплексом HLA-A*02:01-пептид с превосходными уровнями аффинности, и HLA-A*02:01 + донорских Т-клеток, трансдуцированных TCR, распознают и лизируют HLA-A*02:01 + h4. Клетки глиомы 3K27M + мутационно- и HLA-специфическим образом. Важно отметить, что анализы аланинового сканирования показали, что не существует известных белков человека, которые имеют общий набор ключевых аминокислотных остатков для распознавания TCR. Наши данные убедительно подтверждают разработку стратегий иммунотерапии на основе Т-клеток, трансдуцированных вакциной и TCR, у пациентов с глиомами h4.3K27M + .

Мы выделили полноразмерную кДНК для α- и β-цепей TCR из клона 1H5, оптимизировали использование кодонов и клонировали их в ретровирусную векторную систему TCR, которая включает миРНК, нацеленную на константные области эндогенных α- и β-цепей TCR. -цепи, чтобы избежать неправильного спаривания между эндогенными и трансгенными цепями TCR (рис.3 А; Окамото и др., 2009, 2012). Чтобы оценить функцию трансгенного TCR, особенно в отношении коэкспрессии CD8, мы трансдуцировали Т-клеточный клон Jurkat 76 (J76CD8 ), в котором отсутствует эндогенный CD8, а также α- и β-цепи TCR (Heemskerk et al. , 2003), и CD8-трансфицированный Т-клеточный клон Jurkat 76 (J76CD8 + ) с вектором TCR. TCR-трансдуцированные клетки J76CD8 +/- затем совместно культивировали с клетками T2, обработанными h4.3WT, h4.3K27M или нерелевантным пептидом гриппа.TCR-трансдуцированные клетки J76CD8 + продуцировали значительно более высокие уровни IL-2 в ответ на пептид h4.3K27M по сравнению со всеми другими группами, что указывает на h4.3K27M-специфическую и CD8-зависимую реактивность TCR (рис. 3 B). .

Затем мы трансдуцировали первичные Т-клетки человека с помощью TCR и достигли >40% эффективности трансдукции в CD8 + Т-клетках и ~20% в CD4 + Т-клетках на основе окрашивания тетрамером, что позволяет предположить, что корецептор CD8 важен для эффективная экспрессия TCR (фиг.3 С). Чтобы оценить функциональность TCR в первичных Т-клетках человека, а также потребность в корецепторе CD8 для функционального ответа, Т-клетки CD4 + и Т-клетки CD8 + одновременно трансдуцировали с TCR и совместно культивировали с T2. клетки обрабатывали пептидом h4.3K27M, h4.3WT или гриппом, а продукцию IFN-γ оценивали с помощью ELISPOT (фиг. 3D). TCR-трансдуцированные CD8 + T-клетки продуцировали значительно большее количество точек IFN-γ, чем TCR-трансдуцированные CD4 + T-клетки при стимуляции h4.пептид 3K27M. Более того, ответ TCR-трансдуцированных CD8 + Т-клеток был специфичен для пептида h4.3K27M, поскольку эти клетки продуцировали значительно большее количество пятен IFN-γ в ответ на пептид h4.3K27M по сравнению с h4.3WT, пептидом гриппа, или без пептида (фиг. 3D). Однако, хотя и не на статистически значимом уровне, мы наблюдали тенденцию к тому, что TCR-трансдуцированные CD8 + T-клетки продуцировали увеличенное количество точек IFN-γ по сравнению с ложно-трансдуцированными CD8 + T-клетками против T2-клеток, нагруженных h4.Пептид 3WT (P = 0,254). Хотя концентрация пептида была явно супрафизиологической (10 мкг/мл), это наблюдение должно напомнить нам о теоретической возможности внеопухолевой реактивности.

Мы также наблюдали значительную активацию маркера активации Т-клеток, CD69 (Werfel et al., 1997), на TCR-трансдуцированных CD8 + Т-клетках, но не на ложно-трансдуцированных Т-клетках, стимулированных пептидом h4.3K27M. но не h4.3WT или нерелевантный пептид гриппа (рис. 3E). Мок-трансдуцированные Т-клетки получали тем же методом активации, что и TCR-трансдуцированные Т-клетки, с использованием анти-CD3-антитела и RetroNectin, как подробно описано в материалах и методах.

Для обеспечения специфичности и безопасности подхода к нацеливанию h4.3K27M важно определить ключевые аминокислотные остатки в эпитопе h4.3K27M, которые ответственны за реактивность TCR.Это позволяет прогнозировать и оценивать перекрестную реактивность к другим эпитопам, полученным из белков, присутствующих в нормальных клетках. С этой целью мы выполнили аланин-сканирующий мутагенез эпитопа h4.3K27M путем введения одиночных аланиновых мутаций (всего 10) в каждое положение внутри декамерного эпитопа h4.3K27M. Поэтому мы подготовили 10 уникальных синтетических пептидов, каждый из которых содержал специфическую замену аминокислоты аланином (A1-A10), и оценили, изменяет ли замена стабильность связывания пептида с HLA-A*02:01 (рис.4 А). Когда связывание было уменьшено заменой по сравнению с эпитопом h4.3K27M, это предполагает, что замещенный остаток был критическим для HLA-A*02:01 связывания эпитопа. Соответственно, замены в положении 2 и на С-конце были связаны с более чем 20-кратным снижением связывающей способности, что согласуется с тем, что эти положения являются каноническими первичными якорями HLA-A*02:01. Сокращение в 10–20 раз также было отмечено в положениях 1, 4, 6, 7 и 9, что позволяет предположить, что они также могут действовать как вторичные контакты MHC.

Затем мы оценили продукцию IL-2 как показатель функциональности клеток, трансдуцированных TCR, при совместном культивировании с клетками T2, нагруженными каждым из измененных пептидов (рис. 4В). Аминокислоты, замены которых приводят к снижению продукции IL-2, имеют решающее значение для распознавания TCR. И аффинность связывания HLA (рис. 4A), и реактивность TCR, определяемая по продукции IL-2 (рис. 4B), последовательно показали, что аминокислоты в положениях 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 и 10 являются имеет решающее значение для распознавания и функционирования TCR.Используя NCBI BLAST 2.7.0, мы запросили «RMXAXSTGGV» (остатки 1, 2, 4, 6, 7, 8, 9 и 10) в базе данных белков Homo Sapiens Protein Data Bank и не обнаружили известных белков человека, содержащих одни и те же аминокислотные остатки. Мы расширили наши поиски, чтобы найти белки с аминокислотными мотивами, гомологичными ключевым аминокислотным остаткам (таблица S2). Неудивительно, что относительно высокая степень гомологии была обнаружена в белках семейства гистонов h4 и PRC2, но не в других белках. Судя по данным аланинового сканирования, эти белки вряд ли будут мишенью для TCR.

Для определения доклинической терапевтической активности TCR-трансдуцированных Т-клеток in vivo мы вводили 5 × 10 4 клеток люциферазы + U87h4. 3K27M в мозг мышей NSG с ослабленным иммунитетом на 0-й день. На 14-й и 30-й дни мыши с установленными опухолями получали внутривенные инъекции либо PBS, 5 × 10 6 контрольных ложно-трансдуцированных Т-клеток, либо 5 × 10 6 TCR-трансдуцированных Т-клеток.Биолюминесцентная визуализация (BLI) показала значительное снижение опухолевой массы у мышей, получавших TCR-трансдуцированные Т-клетки, но не у мышей, получавших PBS или ложно-трансдуцированные Т-клетки (рис. 7, A и B). После 31-го дня, независимо от размера опухоли, у мышей, получавших либо ложно-трансдуцированные, либо TCR-трансдуцированные Т-клетки, появились признаки, указывающие на реакцию «трансплантат против хозяина», такие как взлохмаченный мех, сгорбленная поза, медленная подвижность и потеря веса. не изображено), поэтому мы не смогли оценить влияние терапии на долгосрочную выживаемость.Тем не менее, пытаясь определить накопление TCR-трансдуцированных Т-клеток во внутричерепном ксенотрансплантате, мы умерщвляли мышей на 32-й день (через 2 дня после инфузии Т-клеток) и оценивали инфильтрирующие опухоль лимфоциты с помощью HLA-A*02:01. -h4.3K27M 26–35 декстрамер, а также моноклональные антитела против CD8 и CD4. Хотя эффективность трансдукции инфузированных клеток CD8 + и CD4 + составляла примерно 50% и 30% соответственно (рис. 7C), мы обнаружили, что >80% и 40% клеток CD8 + и CD4 человека + Т-клеток, соответственно, были положительными по декстрамеру в опухоли.С другой стороны, примерно 10% и 20% CD8 + и CD4 + Т-клеток были декстрамер-положительными в периферической крови (фиг. 7C). Эти данные позволяют предположить, что имело место избирательное накопление TCR-трансдуцированных Т-клеток в области внутричерепной опухоли через 2 дня после инфузии Т-клеток. Наша оценка наличия и функции введенных Т-клеток в более длительные моменты времени была поставлена ​​под сомнение регрессом опухоли и связанным с этим исчезновением Т-клеток из головного мозга (рис. S1). Тем не менее мы наблюдали TCR-трансдуцированные клетки CD4 + и CD8 + в селезенке, легких и периферической крови через 10 дней после инфузии. Требуются дальнейшие исследования с использованием сингенных моделей для оценки точных взаимодействий между Т-клетками, трансдуцированными TCR, и средой хозяина.

В текущем исследовании мы идентифицировали новый HLA-A*02:01-рестриктированный неоантигенный эпитоп, охватывающий мутацию h4.3K27M, которая присутствует в большинстве DMG у детей и молодых взрослых (Solomon et al., 2016; Chiang и Эллисон, 2017). Кроме того, мы клонировали высокоаффинный TCR, который специфически распознает h4.Эпитоп 3K27M эндогенно экспрессируется клетками глиомы h4.3K27M + HLA-A*0201 + .

Гетероклитические пептидные модификации Т-клеточных эпитопов опухолевого антигена были описаны в литературе. В частности, замена аминокислотного остатка в положении 2 на метионин увеличивает связывание с HLA-A*02:01 и способность эпитопа gp100 209–217 индуцировать ЦТЛ (Dionne et al. , 2003; Rosenberg et al., 2005). Интересно, что мутация горячей точки h4.3K27M имеет случайную замену метионина в положении 27 (положение 2 эпитопного пептида), что естественным образом генерирует гетероклитический пептид с улучшенным связыванием HLA-A2 и иммуногенностью по сравнению с немутантным пептидом h4.3WT.

Хотя большинство неоантигенов, полученных в результате миссенс-мутаций, уникальны для отдельных пациентов (Tran et al., 2015, 2016), мы ожидаем, что иммунотерапия, направленная на h4.Эпитоп 3K27M может быть применим к сотням пациентов ежегодно в Соединенных Штатах и ​​других странах на основании высокой частоты мутации h4.3K27M и распространенности HLA-A*02:01 (http://www.cbtrus.org; Zhang и др., 2017). Мы смогли обнаружить h4.3K27M-специфические Т-клеточные ответы в PBMC, полученных от пациентов с DIPG, но не в PBMC, полученных от здоровых доноров. Хотя эти наблюдения могут означать, что спонтанные h4. 3K27M-специфические Т-клеточные ответы недостаточны для контроля роста опухоли, эти наблюдения также подтверждают наш МС-анализ, демонстрирующий присутствие h4.Эпитоп 3K27M в HLA-классе I клеток глиомы h4.3K27M + . В процессе отправки и редактирования текущей статьи Ochs et al. (2017) сообщили, что пептид, включающий h4.3K27M, индуцирует специфические ответы CTL и Th2 у трансгенных мышей HLA-A2.DR1. Хотя их исследование не выявило антиген-специфических клонов CTL или кДНК TCR, оно подтверждает наши результаты относительно иммуногенности эпитопа h4.3K27M у хозяев HLA-A2 + . Вместе эти результаты дают обоснование для усиления ответа пептидной вакциной.Фактически, мы недавно провели многоцентровое пилотное исследование для оценки безопасности, иммунореактивности и предварительной эффективности вакцины с использованием синтетического эпитопного пептида h4.3K27M 26–35 у детей с h4.3K27M + DIPG или высокой степенью злокачественности. глиомы через Тихоокеанский консорциум детской нейроонкологии (PNOC-007; NCT02960230).

Хотя список антигенов, которые можно использовать для иммунотерапии глиом, за последнее десятилетие расширился (Okada et al., 2009; Reardon et al., 2013), в том числе выявленных (Okano et al., 2002; Eguchi et al., 2006) или охарактеризованных (Hatano et al., 2005; Zhang et al., 2007) нашей группой, было много действительно специфичных для глиомы антигенов, за исключением полученных из EGFRvIII (Ohno et al., 2013; Johnson et al., 2015) и IDh2 (Schumacher et al., 2014). Кроме того, из-за заметной гетерогенности генетики и экспрессии белков при солидных опухолях нацеливание на один антиген может привести к развитию вариантов опухоли, в которых антиген-мишень отсутствует (Genßler et al., 2015; Наваи и Ахмед, 2016). Эти наблюдения подчеркивают необходимость расширения списка доступных опухолеспецифических антигенов, таких как антигены, полученные в результате мутаций (т. е. неоантигены), для безопасной и эффективной иммунотерапии. Эпитоп неоантигена, полученный из h4.3K27M, будет ценной мишенью, поскольку он не только специфичен для опухоли, но и мутантный белок K27M также присутствует во всех опухолевых ядрах в каждом из 47 случаев, оцененных с помощью иммуногистохимии (Solomon et al., 2016) , предполагая, что это может быть мутация ствола и с меньшей вероятностью приведет к опосредованному потерей антигена ускользанию опухоли.Учитывая недавнее возникновение опасных для жизни и летальных исходов в исследованиях иммунотерапии рака, вызванных попаданием в цель (Johnson et al., 2009; Morgan et al., 2010; Parkhurst et al., 2011) или нецелевым действием (Cameron et al. ., 2013; Morgan et al., 2013) перекрестной реактивности Т-клеток против нормальных клеток, мы сосредоточили свое внимание на решении проблемы антигенной специфичности TCR путем проведения аланинового сканирования (Cunningham and Wells, 1989; García-Peydró et al. , 2000; Кэмерон и др., 2013).

Хотя наши результаты показали отсутствие каких-либо известных человеческих белков, которые имеют одинаковый аминокислотный мотив для распознавания TCR, мы также признаем, что сканирование аланином не может исключать все возможности перекрестной реактивности. На самом деле, хотя это и не было на статистически значимом уровне, мы наблюдали тенденцию к тому, что TCR-трансдуцированные CD8 + Т-клетки продуцировали умеренное количество пятен IFN-γ против клеток T2, нагруженных супрафизиологической (10 мкг/мл) концентрацией h4. .3WT, что предполагает теоретическую возможность внеопухолевой реактивности. Полное сканирование с использованием панели всех возможных комбинаций аминокислотных замен в эпитопе позволило бы получить полный паттерн или мотив для каждого потенциально переносимого пептида и предоставило бы наиболее полную информацию.

Тем не менее, наши данные аланинового сканирования дают нам основу для понимания специфичности пептидов и того, как избежать потенциальной токсичности, вызванной перекрестной реактивностью. Чтобы дополнительно выяснить специфичность и перекрестную реактивность TCR, мы инициировали совместные усилия, интегрировав структурную биологию, чтобы охарактеризовать взаимодействие между TCR и комплексами HLA, нагруженными пептидами (Adams et al. , 2016).

Аминокислотная последовательность пептида A6 в анализе аланинового сканирования идентична пептиду, охватывающему остатки 26–35 последовательности h4.1 и включающему мутацию K27M (Wu et al., 2012). Сниженное связывание пептида с HLA-A*02:01 и распознавание TCR с пептидом A6 убедительно свидетельствует о том, что наш TCR не будет применим к пациентам с мутацией h4.1K27M. Точно так же, основываясь на наших данных сканирования аланином, если опухоль несет цитруллинированный R26 в дополнение к мутации K27M в h4.3, TCR вряд ли ответит. Следовательно, в будущих клинических испытаниях может потребоваться оценка ткани глиомы пациентов на цитруллинирование R26 в h4.3 в рамках скрининга приемлемости, если станет доступным возможный метод оценки. Кроме того, наши анализы связывания пептидов с подтипами HLA-A2 показали, что эпитопный пептид h4.3K27M может неэффективно связываться с подтипами HLA-A2, отличными от HLA-A*02:01. Это необходимо учитывать при рассмотрении вопроса о приемлемости пациентов.

Наши данные SPR показали, что сродство TCR к h4.3K27M-HLA-A*02:01 сопоставим с хорошо охарактеризованными высокоаффинными TCR, специфичными к вирусным или бактериальным антигенам (Aleksic et al., 2012). Пептиды невирусного рака или собственных антигенов обычно связывают TCR с более низкими уровнями сродства ( K D 50–200 мкМ), поскольку TCR с высоким сродством к собственным антигенам, вероятно, подвергаются отрицательному отбору в тимусе. Хотя кинетика взаимодействия TCR-h4.3K27M-HLA-A2 была слишком быстрой, чтобы ее можно было точно определить в нашем эксперименте SPR, быстрая кинетика является отличительной чертой взаимодействий TCR-пептид HLA класса I (Cole et al., 2007).

На основании нашего анализа титрования пептидов с использованием первичных Т-клеток CD8 + человека, трансдуцированных TCR, EC 50 колеблется от 10 -8 до 10 -9 M, что, по крайней мере, сравнимо с несколькими известными HLA. — связывание эпитопов, полученных из антигенов меланомы (Bakker et al., 1995; Lupetti et al., 1998). С другой стороны, TCR-трансдуцированные CD4 + Т-клетки не продемонстрировали сопоставимых ответов, что убедительно свидетельствует о необходимости корецептора CD8 для достаточных функций TCR.Эти данные также подразумевают преимущество выбора Т-клеток CD8 + для трансдукции TCR в будущих клинических испытаниях.

Что касается системы трансдукции TCR, широко описанной ловушкой при использовании Т-клеток, трансдуцированных TCR, является неправильное спаривание между эндогенными и трансгенными α- и β-цепями TCR, что приводит к снижению экспрессии трансгенного TCR, непредвиденной нецелевой реактивности и/ или аутоиммунитет (Govers et al., 2010; Чжан и Морган, 2012 г.). Для обеспечения и улучшения надлежащего спаривания трансгенных α- и β-цепей были оценены различные генно-инженерные технологии, такие как введение дисульфидного мостика в константные области α/β путем добавления дополнительных остатков цистеина, заменяющих человека с мышиными константными областями, оптимизацией кодонов, слиянием цепи TCR с лейциновой застежкой-молнией и одноцепочечным TCR (Govers et al. , 2010; Zhang and Morgan, 2012). В текущем исследовании нам удалось добиться отличной экспрессии цепей трансгенного TCR путем включения siRNA против эндогенного TCR (Okamoto et al., 2009, 2012) и оптимизации кодонов кДНК.

Наши данные МС-анализа клеток U87h4.3K27M и анализов цитотоксичности с использованием клеток HSJD-DIPG-017 показывают, что эпитоп h4.3K27M естественным образом продуцируется и презентируется HLA-A*02:01 на поверхности h4.3K27M + клетки глиомы. В нашем анализе MS, а также в исследованиях ксенотрансплантата in vivo использовались клетки U87h4.3K27M, но не добросовестные клетки DIPG, такие как HSJD-DIPG-017. Это было связано с тем, что оба анализа требуют большого количества клеток (например,g., 5 × 10 8 клеток, необходимых для одного цикла МС-анализа), и ни одна из добросовестных клеточных линий DIPG не могла быть выращена в достаточных количествах в разумные сроки. Тем не менее, наши наборы данных с использованием различных клеточных линий подтверждают наш важный вывод о том, что эпитоп h4.3K27M в клетках глиомы является мишенью для TCR.

Хотя наши данные с моделью ксенотрансплантата у мышей NSG ясно продемонстрировали эффективность внутривенных инфузий TCR-трансдуцированных Т-клеток in vivo, у нас были ограниченные возможности для исследования точных взаимодействий между введенными Т-клетками и средой хозяина у мышей с ослабленным иммунитетом.Мы сосредоточили наше основное внимание на молекулярных факторах, таких как хемокин CXCL10 (Zhu et al., 2010; Ohkuri et al., 2014) и рецептор интегрина, антиген очень поздней активации (VLA)-4, которые способствуют T клеточная инфильтрация опухолей головного мозга с использованием сингенных моделей (Sasaki et al., 2007; Zhu et al., 2007). Нам нужно будет интегрировать эти результаты в разработку эффективных подходов к терапии TCR-трансдуцированными Т-клетками.

Данные текущего исследования обеспечивают прочную основу для разработки безопасной и эффективной иммунотерапии на основе Т-клеток, нацеленной на h4.Эпитоп 3K27M. Недавние исследования показали, что сильный противоопухолевый иммунный ответ может быть достигнут за счет адоптивного переноса ex vivo-активированных Т-клеток (Rosenberg and Restifo, 2015). Поэтому мы направим наши переводческие усилия на дальнейшую оптимизацию нашего TCR и разработку эффективной адоптивной терапии Т-клетками для пациентов с глиомами h4.3K27M + .

комплекса HLA класса I очищали из 5 × 10 8 родительских клеток U87 или клеток U87, трансфицированных либо h4.3WT или h4.3K27M, как описано ранее (Bassani-Sternberg et al., 2015). Вкратце, клетки лизировали 0,25% дезоксихолатом натрия (Sigma-Aldrich), 1% октил-β-d-глюкопиранозидом (Sigma-Aldrich), 0,2 мМ йодацетамидом, 1 мМ ЭДТА и смесью ингибиторов протеазы 1:200 (Sigma-Aldrich). Aldrich) в PBS при 4°C в течение 1 часа. Лизат очищали 30-минутным центрифугированием при 40000 g при 4°С. Комплексы HLA класса I подвергали иммуноаффинной очистке из очищенного лизата с помощью гранул сефарозы протеина А (Invitrogen), ковалентно связанных с антителом пан-HLA класса I W6/32 (очищенным из клеток HB95; ATCC), и элюировали при комнатной температуре с помощью 0.1 н уксусная кислота. Элюированные комплексы HLA-I затем загружали в картриджи Sep-Pak tC18 (Waters Corporation) и пептиды HLA класса I отделяли от комплексов путем их элюирования 30% ацетонитрилом (ACN) в 0,1% TFA. Пептиды дополнительно очищали с использованием наконечников колонок с силикагелем C-18 (Harvard Apparatus), снова элюировали 30% ACN в 0,1% TFA и концентрировали вакуумным центрифугированием. Для анализа методом ЖХ-МС/МС пептиды HLA класса I разделяли на системе EASY-nLC 1000 (Thermo Fisher Scientific), подключенной к масс-спектрометру Q Exactive HF (Thermo Fisher Scientific) с источником ионов наноэлектрораспыления (Thermo Fisher Scientific). .Пептиды загружали в буфере А (0,1% муравьиной кислоты) в колонку длиной 50 см с внутренним диаметром 75 мкм, заполненную смолой ReproSil-Pur C18-AQ 1,9 мкм (Dr. Maisch HPLC GmbH), и элюировали 90-минутный линейный градиент 5–30% буфера B (80% ACN и 0,1% муравьиной кислоты) при скорости потока 250 нл/мин. Q Executive HF работал в режиме зависимости от данных с полным сканированием МС на дальности 300–1650 м / z , с разрешением 60000 на 200 м / z и целевым значением 3× 10 6 ионов.10 наиболее распространенных ионов с зарядом 1–3 были объединены, чтобы получить целевое значение AGC 1 × 10 5 и максимальное время инжекции 120 мс, фрагментированные с помощью высокоэнергетической столкновительной диссоциации (HCD). Сканирование МС/МС было получено с разрешением 15000 при 200 м / z , а динамическое исключение было установлено на 20 с, чтобы избежать повторного секвенирования пептидов. Данные были получены и проанализированы с помощью программного обеспечения Xcalibur (Thermo Fisher Scientific). Для целенаправленной идентификации h4.Пептид 3K27M, тяжелую (Arg10) версию пептида синтезировали твердофазным методом Fmoc с использованием прибора ResPepMicroScale (Intavis AG Bioanalytical Instruments), вводя разницу масс 10,0083-D с одним аргинином 13C6 15N4 (AnaSpec). Тяжелый пептид добавляли к каждому образцу в концентрации 1 пмоль/мкл, всего 3 пмоль за прогон.

Для анализа данных МС необработанные файлы были обработаны с использованием MaxQuant версии 1.5.7.12, как описано ранее (Бассани-Штернберг и др., 2015). Поиск проводился в базе данных Human UniProt (июль 2015 г.) и в специализированной справочной базе данных, содержащей последовательность h4.3K27M. Специфичность фермента была установлена ​​как неспецифическая, а возможные совпадения последовательностей были ограничены 8–15 аминокислотами и максимальной массой 1500 D. N-концевое ацетилирование и окисление метионина были установлены как переменные модификации. На уровне пептидов требовался коэффициент ложного обнаружения 0,01. Для идентификации тяжелого пептида в спецификацию типа поиска была добавлена ​​метка Arg10.

Созревшие α- и β-эктодомены TCR h4.3K27M со сконструированной дисульфидной связью между C-доменами были отдельно клонированы в вектор экспрессии насекомых pAcGP67a (554756; BD Biosciences), кодирующий либо C-концевой кислый пептид-акцептор биотина-застежки-молнии-6xHis-метку, либо С-концевая базовая застежка-молния-6xHis. Сайт протеазы 3c был введен между С-концевым эктодоменом TCR (α или β) и (кислой или основной) последовательностью застежки-молнии (Birnbaum et al., 2014). Бакуловирусы для каждой конструкции TCR продуцировали в клетках SF9. Продуцирование TCR осуществляли в клетках High Five путем трансфекции соответствующим соотношением вирусов TCRα и TCRβ в течение 48–72 ч при 30°C. Собранную культуральную среду инкубировали со смолой Ni-NTA (30250; Qiagen) при комнатной температуре в течение 3 ч и элюировали 1× Hepes-буферным солевым раствором (HBS) + 200 мМ имидазола (pH 7,2). Элюированный TCR заменяли буфером на 1× HBS и инкубировали с соответствующим количеством протеазы 3 C (100 нг/мкл) при 4°C в течение ночи.Затем реакционную смесь очищали эксклюзионной хроматографией с использованием AKTAPurifier (GE Healthcare) на колонке Superdex 200 (GE Healthcare). Пиковые фракции объединяли и анализировали на геле SDS-PAGE в качестве контроля качества.

Растворимый HLA-A2, нагруженный пептидом h4.3K27M (RMSAPSTGGV), был получен путем фолдинга in vitro. Тяжелая цепь HLA-A2 (остатки 1–275) и микроглобулин β2 (остатки 1–100) были отдельно клонированы в вектор pET-26b и трансформированы клетками Rosseta DE3 Escherichia coli .Тельца включения, содержащие соответствующие белки, растворяли в 8 М мочевине, 50 мМ Трис-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА и 10 мМ ДТТ. Для фолдинга in vitro тяжелую цепь HLA-A2, β2-микроглобулин и пептид h4.3K27M смешивали в молярном соотношении 1:2:10 и разводили в буфере для фолдинга, содержащем 0,4 М l-аргинин-HCl, 100 мМ Трис. -HCl, pH 8,0, 5 мМ ЭДТА, 0,5 мМ окисленного глутатиона и 5 мМ восстановленного глутатиона (Garboczi et al., 1992). Через 72 ч при 4°С для диализа против 10 литров 10 мМ Трис-HCl смесь подвергали сворачиванию на слабой ионообменной колонке (ДЭАЭ-целлюлоза).Свернутый h4.3K27M-HLA-A2 очищали с помощью последовательной эксклюзионной хроматографии (колонка Superdex 200) и ионообменной хроматографии (колонки Mono Q).

Мы благодарим доктора Майкла Нишимуру (Университет Лойолы) за техническую консультацию по трансдукции Т-клеток человека с помощью TCR, Drs. Kazuto Takesako и Hideto Chono (Takara Bio Inc.) за подготовку ретровирусного вектора TCR и Preclinical Therapeutics Core в Калифорнийском университете в Сан-Франциско за использование системы визуализации Xenogen.

Настоящее исследование было поддержано NIH/Национальным институтом неврологических расстройств и инсульта (NINDS) R01NS096954 (Х. Окада), NIH/NINDS 2R01NS055140 (Х. Окада), Национальным центром развития трансляционных наук, NIH, через Калифорнийский университет. , Институт клинических и трансляционных исследований Сан-Франциско (Х. Окада), V Foundation for Cancer Research D2015-018 (С. Мюллер и Х. Окада), Паркерский институт иммунотерапии рака (Х.Okada), NIH/Национальный институт рака 1T32CA151022 (G. Kohanbash), Fondo Alicia Pueyo CP13/00189 (AM Carcaboso) и Instituto de Salud Carlos III-Fondo Europeo de Desarrollo Regional PI15/01161 (AM Carcaboso).

H. Okada и Y. Hou являются изобретателями заявки на патент США «ЦТЛ-пептиды h4.3 и их применение» (дело SF2015-163). Авторы заявляют об отсутствии дополнительных конкурирующих финансовых интересов.

Вклад авторов: И.Ф. Поллак, Ю. Хоу и Х. Окада задумали исследование; З.С. Чхеда, Г. Коханбаш, К.С. Гарсия, Ю. Хоу и Х. Окада разработали исследования; З.С. Чхеда, Г. Коханбаш, К. Окада, Н. Джахан, Дж. Сидней, К. Ян, Д.А. Каррера, К.М. Дауни, С. Шривастав, С. Лю, Ю. Лин, К. Лагисетти, П. Чунтова и П.Б. Часовщик проводил опыты; З.С. Чхеда, Г. Коханбаш, Дж. Сидней, С. Мюллер, Р. Раджалингам, А.М. Каркабозо, А. Сетте, К.С. Гарсия, Ю. Хоу и Х. Окада проанализировали данные; М. Пекораро и М. Манн проводили эксперименты по масс-спектрометрии; С.Мюллер участвовала в получении образцов крови пациентов и поделилась своим клиническим опытом лечения пациентов с DIPG; З.С. Чхеда, Г. Коханбаш, Дж. Сидней, X. Ян и Х. Окада написали рукопись; и все авторы внесли свой вклад в рецензирование и проверку рукописи.

Адаптивный противоопухолевый иммунитет управляется популяцией NK-клеток, продуцирующих CCL5, резидентных в тканях

Введение

Клинический успех блокады иммунных контрольных точек изначально сосредоточил внимание ученых преимущественно на факторах, регулирующих активность Т-клеток 1 . Однако все чаще признается, что широкий спектр иммунных клеток, включая компоненты врожденного иммунитета, должен функционировать скоординированным и синергетическим образом для успешного достижения иммуноопосредованного отторжения опухоли 2–4 .

Ось интерферон γ (IFNγ)-интерлейкин 12 (IL-12) играет центральную роль в соединении врожденного и адаптивного противоракового иммунитета 5 . В основном продуцируемый дендритными клетками (ДК) в микроокружении опухоли, ИЛ-12 стимулирует цитотоксичность и секрецию цитокинов в Т-клетках и естественных клетках-киллерах (NK-клетках) 6 .В положительной петле обратной связи IL-12-IFNγ IFNγ, полученный из Т- и NK-клеток, в свою очередь, активирует и индуцирует экспрессию IL-12 в DC. Кроме того, IFNγ усиливает (перекрестную) презентацию антигена антигенпрезентирующими клетками (APC), тем самым дополнительно усиливая цитотоксическую активность CD8 T-клеток 5,7 . Следовательно, сигнатуры генной экспрессии, отражающие клеточные компоненты этой оси — NK-клетки, дендритные клетки и CD8 T-клетки, — а также сигнатуры передачи сигналов IFNγ являются предикторами улучшения выживаемости пациентов при множественных типах рака 8–12 . Кроме того, было показано, что индукция IL-12 с помощью IFNγ необходима для эффективности блокады иммунных контрольных точек 5 .

IL-12 был широко исследован на предмет его использования в иммунотерапии рака и продемонстрировал замечательную противоопухолевую эффективность на моделях опухолей. Однако в ранних клинических испытаниях его терапевтический эффект у пациентов оставался ограниченным из-за тяжелой дозолимитирующей токсичности 13,14 . Возможным объяснением является отсутствие нацеливания на микроокружение опухоли.Большинство цитокинов, включая IL-12, действуют локально в опухоли и близлежащих лимфатических узлах паракринным или аутокринным образом, а не системно 15 . В то время как несколько подходов с использованием локализованной доставки IL-12 в настоящее время находятся в стадии изучения, поразительная противоопухолевая эффективность локальной терапии IL-12, наблюдаемая у мышей, еще не воспроизведена у людей 16–19 .

Здесь мы стремились получить более глубокое понимание того, как достигается опосредованный IL-12 контроль над опухолью, и позволяет ли это знание в конечном итоге разработать улучшенные стратегии лечения для эффективного контроля над опухолью.С этой целью мы использовали платформу доставки аденовируса серотипа 5, нацеленную на опухоль, в качестве инструмента для внутриопухолевой иммунотерапии IL-12 (AdV5-IL12) 20–22 . На моделях опухолей и модельных системах, полученных от пациентов, мы демонстрируем, что эффективность IL-12 зависит от внутриопухолевого содержания популяции резидентных в тканях NK-клеток (trNK) и их способности стимулировать иммунную микросреду, продуцируя хемокины. CCL5. В trNK-клетках и бедных опухолях резистентность к IL-12 может быть восстановлена ​​за счет индуцированной экспрессии CCL5, что приводит к усилению инфильтрации cDC1, что затем приводит в движение положительную петлю обратной связи DC-T-клеток против опухоли.Точно так же резистентность к другим IFNγ-опосредованным методам лечения, таким как блокада контрольной точки PD-1, может быть результатом снижения индукции CCL5 из-за отсутствия trNK-клеток и может быть преодолена путем лечения CCL5. Наши данные подчеркивают важность резидентных в опухоли NK-клеток для индукции перекрестных помех DC-T-клеток и успешной иммунотерапии рака.

Результаты

Иммунотерапия IL-12 побуждает NK-клетки организовывать противоопухолевое микроокружение

Несмотря на то, что стратегии максимизации доставки IL-12 вызывают все больший клинический интерес, терапевтический эффект у пациентов остается умеренным.Сначала мы стремились определить типы клеток и ключевые пути, лежащие в основе успешных клинических результатов внутриопухолевой терапии IL-12 у пациентов с меланомой (исследование IL-12MEL; NCT01502293) 16 . С этой целью мы сопоставили иммунные сигнатуры опухоли, полученные из биопсии опухоли до лечения, с терапевтическим ответом. Пациенты с клиническим ответом показали более высокие показатели NK-клеток и CD8 Т-клеток по сравнению с пациентами с прогрессированием опухоли, в то время как корреляции с показателями других иммунных клеток обнаружено не было (рис. С1а).

Рисунок 1: Иммунотерапия IL-12 побуждает NK-клетки организовать противоопухолевое микроокружение клинический ответ (PD: прогрессирующее заболевание, SD: стабильное заболевание, PR: частичный ответ) 16 . b-d: мышам дикого типа (WT) прививали 1 млн EMT6-HER2 интрамаммарно (в/м). С 7-го дня (размер опухоли 30–70 мм 3 ) мышам вводили 1.5×10 8 БОЕ HER2-направленных и экранированных аденовирусных векторов (перитуморально, точка), кодирующих IL-12, или пустая контрольная кассета (AdV5-контроль) на 7, 9, 11 и 14 дни. Кривые роста опухоли и выживаемости Каплана-Мейера показаны с указанным числом мышей. Черные стрелки обозначают дни лечения. e: Для исследования истощения мышам вводили внутрибрюшинно. с анти-CD8 и анти-AsialoGM1, начиная за день до лечения аденовирусом. Показаны кривые роста опухоли после истощения. Черные стрелки обозначают дни лечения аденовирусом.n = 6 мышей. f: Визуализация отношений шансов и значений p для изменений межклеточных взаимодействий между экспериментальными условиями с упором на взаимодействие, включая Т-клетки CD8 и NK-клетки. g: Репрезентативные изображения IF показывают опухоли, обработанные AdV5-IL12 (CD45: красный, MHCI: синий, CD8: желтый, NKp46: зеленый). Белые стрелки показывают Т-клетки CD8 (CD45+, MHCI+, CD8+) или NK-клетки (CD45+, MHCI+, NKp46+), соседствующие с опухолевыми клетками (CD45-, MHCI+). Количественное определение GzmB+ CD8 T-клеток и NK-клеток в непосредственной близости (<50 мкм) от опухолевых клеток по сравнению с более удаленной (>50 мкм) близостью.Каждая точка представляет количество в одной приобретенной опухоли. В этом анализе были объединены условия лечения. h: Репрезентативные изображения IF показывают опухоли, обработанные AdV5-IL12 (MHCII: красный, CD11c: синий, CD8: желтый). Белые стрелки показывают Т-клетки CD8 (CD45+, CD8+), соседствующие с DC (CD45+, CD11c+, F4/80-). Показано соотношение экспрессии CD40, CD80, MHCII и PD-L1 на кластере DC в непосредственной (<50 мкм) или отдаленной (>50 мкм) близости от кластера Т-клеток CD8 по сравнению с необработанными и обработанными AdV5-IL12 опухолями. i: Репрезентативные изображения IF, показывающие CD8 T-клетки и NK-клетки в непосредственной близости от кровеносных сосудов в опухолях, обработанных AdV5-IL12 (CD31: красный, CD8: синий, NKp46: зеленый). f-i: n = 3 мыши на группу. j: Мышей-носителей EMT6-HER2 лечили AdV5-IL-12. NK-клетки были истощены с использованием антитела против AsialoGM1 (внутрибрюшинно), как указано (синяя стрелка). Опухоли выделяли, и суспензии отдельных клеток расщепленных опухолей анализировали с помощью проточной цитометрии на 16-й день. k: Внутриопухолевые cDC1 (CD11c+, F4/80-, Ly-6G-, MHCII+, CD103+, CD11b низкий ) определяли количественно после Обработка AdV5-IL12 +/- истощение NK.l: Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) гранзима B на CD8 T-клетках (CD3+, CD8+, NKp46-, CD19-, Ly-6G-). m: Поляризация макрофагов (CD11b+ F4/80+) после лечения AdV5-IL12, сравнивающая истощение NK по сравнению с неистощением. k-m: n = 4-5 мышей в группе.

*р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001, ****р < 0,0001. Значения полосы погрешности представляют SD или SEM (кривые роста опухоли). Для сравнения между тремя и более группами использовался однофакторный дисперсионный анализ с множественными сравнениями. Для анализа выживаемости значения р рассчитывали с использованием критерия логарифмического ранга.Для сравнения кривых роста опухоли использовали двухфакторный дисперсионный анализ. См. Также дополнительный рисунок S1–4.

Чтобы определить модельную систему для местной терапии IL-12, которая отражает эти клинические данные, мы использовали нерепликативные, экранированные и повторно направленные аденовирусные векторы серотипа 5, ранее установленные в нашей лаборатории 20–22 . В этом исследовании HER2 использовали в качестве модельного антигена для нацеливания на сингенные опухолевые клеточные линии B16-HER2 и EMT6-HER2 со сверхэкспрессией HER2. Из-за большого количества ранее существовавших антител против AdV5 мы использовали щит на основе связывающего гексон гуманизированного одноцепочечного вариабельного фрагмента (scFv), полностью покрывающего вирион 22 . Чтобы подтвердить опухолеспецифическую экспрессию нашей полезной нагрузки, вирус, кодирующий люциферазу (AdV5-Luciferase), вводили перитуморально мышам, несущим B16-HER2 и EMT6-HER2 (дополнительная рис. S1b). В обеих моделях опухолей полезная нагрузка экспрессировалась исключительно в опухоли до 10 дней с пиком экспрессии в 1-й день (дополнительная рис. S1c – e).

Чтобы оценить эффективность AdV5, кодирующего IL-12 (AdV5-IL12), мы вводили перитуморально мышам с ортотопическими опухолями EMT6-HER2 четыре инъекции 1.5×10 8 БОЕ перенацелены и экранированы AdV5-IL12. Пустой вирус (AdV5-контроль) служил в качестве контроля (рис. 1b). Лечение AdV5-IL12 приводило к сильному ингибированию роста опухоли, повышению выживаемости и полной регрессии опухоли у 70% обработанных мышей, в то время как контроль AdV5 продемонстрировал лишь умеренные эффекты (рис. 1c-d). В сыворотке не было обнаружено IL-12, что подтверждает специфичность нашей локализованной в опухоли терапии (дополнительная рис. S1f). Перенацеленный и экранированный AdV5-IL12 показал повышенную эффективность по сравнению с голыми и перенацеленными векторами (дополнительная рис.S1г).

Поскольку у пациентов с локализованной терапией IL-12 наблюдается клинический ответ даже при необработанных поражениях, мы оценили системные эффекты AdV5-IL12 в нашей модели опухоли на мышах. С этой целью мы вводили HER2-отрицательные клетки EMT6 дикого типа в контралатеральные фланги опухолей EMT6-HER2 (дополнительный рисунок S1h). Мы наблюдали снижение роста опухолей контралатеральных опухолей и полную регрессию у 50% животных, получавших AdV5-IL12. Это указывает на сильные системные иммунные эффекты при местном введении AdV5-IL12.

AdV5-IL12 индуцировал формирование защитной противоопухолевой иммунологической памяти, поскольку мыши, пережившие первичное приживление EMT6-HER2 после лечения AdV5-IL12, оставались без опухолей после последующего повторного заражения той же клеточной линией (дополнительная рис. S1i). Опухоли от мышей, одновременно инокулированных клетками EMT6 wt на латеральном фланге, были в равной степени отвергнуты, что свидетельствует о формировании широкой памяти против общих антигенов, экспрессируемых клетками EMT6 (дополнительная рис. S1i).

Чтобы проанализировать роль определенных популяций иммунных клеток в опосредовании терапевтического эффекта AdV5-IL12, мы провели исследования истощения, опосредованного антителами (рис. 1e).В соответствии с анализом иммунных сигнатур из исследования IL-12MEL (рис. 1а), для терапевтической эффективности AdV5-IL12 требуются как CD8 T-клетки, так и NK-клетки. Поскольку IL-12 является известным драйвером продукции IFNγ в обоих этих типах клеток, а клинический ответ коррелирует с определенной оценкой IFNγ 16 , мы оценили вклад IFNγ в активность AdV5-IL12. Мыши, нейтрализованные IFNγ, не смогли контролировать опухоли EMT6-HER2 при лечении AdV5-IL12 (дополнительная рис. S1j). В соответствии с этими выводами AdV5-IL12 увеличивал способность Т-клеток CD8 и NK-клеток к пролиферации и проявлению эффекторных функций, что оценивалось с помощью проточной цитометрии (дополнительная рис.С2 и С3). В заключение, отражая клиническую ситуацию, лечение AdV5-IL12 в опухолях EMT6-HER2 требует надежных ответов NK и CD8 T-клеток, которые зависят от IFNγ.

Затем мы оценили способность CD8 и NK-клеток напрямую взаимодействовать и атаковать раковые клетки, используя подход с высокой мультиплексностью цитометрической визуализации, называемый совместным обнаружением путем индексирования (CODEX) 23 . AdV5-IL12 привел к выраженному накоплению иммунных клеток CD45+ (дополнительная рис. S4a-b). Пространственная близость (определяемая как расстояние <50 мкм) NK- и CD8-Т-клеток с опухолевыми клетками была специфически увеличена при лечении AdV5-IL12 (рис. 1f и дополнительная рис.С4с). Для подтверждения функциональных взаимодействий и лизиса опухоли NK- и CD8-Т-клетками мы проанализировали экспрессию эффекторного маркера гранзима В в клетках, находящихся в пространственной близости к опухолевым клеткам (CD45-CD31-). Как в NK, так и в CD8 Т-клетках количество гранзимных В+ клеток было увеличено в непосредственной близости от опухолевых клеток (рис. 1g). Кроме того, пространственная близость Т-клеток CD8 с ДК специфически усиливалась после обработки AdV5-IL12 (рис. 1f). Более того, костимулирующие молекулы CD40, CD80 и MHCII, а также PD-L1 на ДК в непосредственной близости от CD8 Т-клеток были специфически повышены после обработки AdV5-IL12, что указывает на усиленное функциональное взаимодействие между ДК и CD8 Т-клетками, индуцированное Ил-12 (рис. 1з).Мы также заметили близость CD8 и NK к эндотелиальным клеткам после обработки AdV5-IL12 (рис. 1f и i), что может указывать на индуцированный перенос этих клеток с помощью IL-12.

Чтобы исследовать индуцированное IL-12 привлечение иммунных клеток к опухоли, мы заблокировали рециркуляцию лимфоцитов с помощью ингибитора переноса FTY720 24 . Лечение FTY720 до инокуляции опухоли полностью устраняло контроль над опухолью, в то время как блокирование переноса во время лечения AdV5-IL12 позволяло осуществлять первоначальный контроль над опухолью, но не приводило к полной регрессии опухоли (дополнительная рис.С4д). Это говорит о том, что эффективные ответы IL-12 требуют как уже существующих, так и активно рекрутируемых лимфоцитов, инфильтрирующих опухоль.

В дополнение к прямой цитотоксичности в отношении опухолевых клеток было показано, что NK-клетки вызывают инфильтрацию иммунных клеток и внутреннее воспаление в опухолях 2,9 . Чтобы проанализировать влияние NK-клеток на индуцированное IL-12 рекрутирование, мы истощили NK-клетки на протяжении всего лечения AdV5-IL12 и оценили судьбу и инфильтрацию инфильтрирующих опухоль иммунных клеток (рис.С3). Истощение NK-клеток привело к уменьшению количества обычных дендритных клеток MHCII+ CD103+ типа I (cDC1s, CD11c+ F4/80-; рисунок 1k). Кроме того, истощение NK было связано со сниженной экспрессией гранзима B в CD8 T-клетках, что свидетельствует о важной роли NK-клеток в обеспечении оптимального ответа противоопухолевых CD8 T-клеток (рис. 1l). В то время как количество макрофагов (CD11b+ F4/80+) в опухоли не изменилось, истощение NK-клеток сместило поляризацию в сторону иммуносупрессивного фенотипа M2 (CD206+ MHCII-) (рис. 1m).Таким образом, мы пришли к выводу, что во время лечения AdV5-IL12 NK-клетки организуют рекрутирование и праймирование подмножеств основных клеток, включая cDC1 и активированные CD8 T-клетки, для усиления уничтожения опухоли.

CCL5, в основном продуцируемый trNK-клетками, необходим для опосредованного IL-12 отторжения опухоли. хемокины и их рецепторы у пациентов, отвечающих на терапию ИЛ-12 (рис. 2а).Мы идентифицировали

CCL5 , и его рецептор CCR5 сильно коррелировал с показателем NK (рис. 2b). Соответственно, CCL5 значительно активировался у пациентов с клиническим ответом (рис. 2с). Эти результаты свидетельствуют о том, что NK-клетки, вероятно, через CCL5, важны для облегчения клинического ответа на IL-12.

Рисунок 2: CCL5, в основном продуцируемый trNK-клетками, необходим для опосредованного IL-12 отторжения опухоли показаны реакции на внутриопухолевое лечение ImmunoPulse IL-12.c: нормализованное количество экспрессии CCL5 у пациентов с отсутствием ответа (NR: PD) по сравнению с ответом (R: SD + PR) до и после внутриопухолевого лечения ImmunoPulse IL-12, определенное с помощью NanoString. d: NK-клетки истощали с использованием антитела против AsialoGM1 (внутрибрюшинно) каждые 3-4 дня. На 7-й день после инокуляции EMT6-HER2 (размер опухоли 30–70 мм 3 ) опухоли выделяли и лизировали. Экспрессию CCL5 определяли с помощью ELISA и нормализовали к общему белку, измеренному с помощью BCA. n= 6 на условие.Использовался двусторонний t-критерий Стьюдента. e: Мышей обрабатывали AdV5-IL12 или AdV5-контроль на 7, 9 и 11 день после инокуляции EMT6-HER2. На 12-й день выделяли опухоли и анализировали экспрессию CCL5 (MFI) на NK-клетках. n=6 мышей на условие. f: Мышей с привитым EMT6-HER2 лечили AdV5-IL12 в соответствии с указанной схемой. Начиная за день до инокуляции опухоли или за день до аденовирусной терапии, CCL5 нейтрализовали с помощью антител каждые 3-4 дня. Показаны кривые выживания Каплана-Мейера.g-i: мышам вводили AdV5-IL12 или AdV5-контроль на 7, 9 и 11 день после инокуляции EMT6-HER2. На 12-й день выделяли опухоли и анализировали экспрессию CCL5, GzmB, CXCR3 и CCR5 на субпопуляциях NK-клеток. Процент CCL5-позитивных NK-клеток, а также MFI GzmB, CXCR3 и CCR5 определяли количественно после обработки AdV5-IL12. Использовался парный двусторонний критерий Стьюдента.

*р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001, ****р < 0,0001. Значения полосы погрешности представляют SD или SEM (кривые роста опухоли).Для сравнения между тремя и более группами использовался однофакторный дисперсионный анализ с множественными сравнениями. Для анализа выживаемости значения р рассчитывали с использованием критерия логарифмического ранга. Для сравнения кривых роста опухоли использовали двухфакторный дисперсионный анализ. См. также дополнительный рисунок S4.

Поэтому мы исследовали, способствует ли CCL5, опосредованный NK-клетками, эффективности AdV5-IL12 в опухолях EMT6-HER2. Сначала мы показали, что концентрации CCL5 резко снижались в лизатах опухолей после истощения NK-клеток, что подтверждает, что NK-клетки являются основным источником CCL5 в этой модели (рис. 2d).В соответствии с наблюдаемой активацией CCL5 у отвечающих на лечение пациентов (рис. 2c), лечение AdV5-IL12 опухолей EMT6-HER2 индуцировало продукцию CCL5 в NK-клетках (рис. 2e). Нейтрализация CCL5 перед инокуляцией опухоли полностью аннулировала эффективность IL-12, в то время как нейтрализация CCL5 после инокуляции опухоли, но до лечения AdV5-IL12, частично ингибировала эффективность (рис. 2f). Таким образом, мы пришли к выводу, что CCL5, продуцируемый NK-клетками, играет двойную роль в ответе на доставку IL-12. В то время как CCL5 в стационарном состоянии позволяет реагировать на лечение AdV5-IL12, дальнейшая индукция CCL5 с помощью лечения AdV5-IL12 может привлекать иммунные клетки для улучшения противоопухолевого иммунитета.

Для анализа вклада CCL5 в опосредованное NK-клетками отторжение опухоли при лечении AdV5-IL12 мышам с опухолями, лишенным NK, одновременно вводили AdV5-IL12 и AdV5, кодирующий CCL5 (AdV5-CCL5). В то время как истощение NK-клеток отменило эффективность AdV5-IL12 (рис. 1c), комбинация AdV5-CCL5 с AdV5-IL12 частично восстановила эффективность (дополнительная рис. S4e).

Недавние исследования показали, что NK-клетки очень гетерогенны с различными иммунными функциями 25–27 . Чтобы определить, какая подгруппа NK-клеток продуцирует CCL5, мы проанализировали уровни CCL5 после обработки AdV5-IL12 в субпопуляциях NK-клеток, отражающих различные стадии созревания, определяемые экспрессией CD11b 28 . Мы наблюдали более высокую долю незрелых (CD11b-) NK-клеток, продуцирующих CCL5, по сравнению со зрелыми (CD11b+) клетками (рис. 2g). Клетки CD11b-NK показали более низкую экспрессию цитотоксических медиаторов (гранзим B, рис. 2h) и более высокую экспрессию рецепторов хемокинов, связанную с проникновением в ткань и ее удержанием (CXCR3 и CCR5, рис. 2i) 29 .Эти данные свидетельствуют о том, что чувствительность к IL-12 зависит от CCL5-продуцирующих NK-клеток, которые проявляют признаки, связанные с резидентностью в тканях с более низким цитотоксическим профилем (далее определяемые как резидентные в ткани NK-клетки).

AdV5-CCL5 преодолевает устойчивость к AdV5-IL12 в опухолях с низким содержанием trNK-клеток

Таким образом, мы предположили, что опухоли с более низкой долей резидентных в ткани (trNK) клеток будут в значительной степени устойчивы к AdV5-IL12. Чтобы проверить это, мы определили влияние истощения NK-клеток на эффективность AdV5-IL12 в опухолях B16-HER2, модели опухоли с более низкой долей trNK-клеток, но аналогичным общим количеством NK-клеток, по сравнению с EMT6-HER2. модель (рис. 3а–б).В соответствии с нашими выводами о том, что trNK-клетки являются основным источником CCL5, уровни CCL5 были ниже в опухолях B16-HER2 по сравнению с опухолями EMT6-HER2 (рис. 3c). В отличие от опухолей EMT6-HER2, истощение NK-клеток в модели B16-HER2 не увеличивало рост опухоли в необработанных или обработанных AdV5-IL12 опухолях, что позволяет предположить, что в основном trNK-клетки, а не зрелые обычные NK (cNK) клетки определяют чувствительность к IL-12 (рис. 1д и 3г).

Рисунок 3: AdV5-CCL5 преодолевает устойчивость к AdV5-IL12 в опухолях с низким содержанием trNK-клеток

a: Количество опухолевых инфильтрационных NK-клеток на 1 г опухоли определяли в необработанных опухолях EMT6-HER2 и B16-HER2. b: Количество tNK-клеток на 1 г опухоли определяли в необработанных опухолях EMT6-HER2 и B16-HER2. c: Концентрацию CCL5 внутри опухоли определяли с помощью ELISA и нормализовали к общему белку в опухолевых лизатах EMT6-HER2 и B16-HER2. d: мышам дикого типа (WT) прививали 1 млн EMT6-HER2 (в/м) или 0,5 млн B16-HER2 (подкожно). Мышей обрабатывали AdV5-IL12 на 7, 9, 11 и 14 день или на 11, 13, 15 и 18 день (размер опухоли 30–70 мм 3 ) соответственно. NK-клетки были истощены с использованием анти-AsialoGM1 и анти-NK1.1 антитело каждые 4-5 дней, начиная за день до аденовирусной терапии. Показан объем опухоли на 25-й день после инокуляции опухоли. e: Мышей лечили AdV5-IL12 и AdV5-CCL5 на 11, 13, 15 и 18 день (размер опухоли 30–70 мм 3 ) после инокуляции B16-HER2, как указано: рост опухоли и кривые выживания Каплана-Мейера представлены ниже. показано (n > 15 мышей на условие). f: Мышам прививали 1 млн EMT6-HER2 (в/м) или 0,5 млн B16-HER2 (подкожно). Начиная с 7-го или 11-го дня (размер опухоли 30–70 мм 3 ) мышам вводили 1. 5×10 8 БОЕ нацеленных на HER2 и экранированных аденовирусных векторов (pt), кодирующих IL-12, на 7/11, 9/13 и 11/15. На 12/16 день после инокуляции опухоли выделяли, заливали в ОКТ и анализировали с помощью многопараметрической иммунофлуоресцентной микроскопии. Визуализация отношений шансов и значений p для изменений межклеточных взаимодействий между EMT6-HER2 по сравнению с B16-HER2 с акцентом на взаимодействие, включая Т-клетки CD8 и NK-клетки. g-k: Мышам прививали 0,5 млн B16-HER2 (s.в.). Мышей лечили AdV5-IL12 и/или AdV5-CCL5 на 11, 13 и 15 день (размер опухоли 30–70 мм 3 ). На 16-й день после инокуляции опухоли выделяли и суспензии отдельных клеток анализировали с помощью проточной цитометрии или встраивали в ОКТ и анализировали с помощью многопараметрической иммунофлуоресцентной микроскопии. g-h: Количество cDC1 (CD11c+, F4/80-, Ly-6G-, MHCII+, CD103+, CD11b low ) и PD-L1 и CD80, экспрессирующих cDC1, соответственно. i: Количество взаимодействий на мм 2 Т-клеток CD8 в непосредственной близости от ДК.Репрезентативные изображения IF показывают опухоли, обработанные AdV5-IL12 + AdV5-CCL5 (MHCII: красный, CD11c: зеленый, CD8: синий). Белые стрелки показывают Т-клетки CD8 (CD45+, CD8+), соседствующие с DC (CD45+, CD11c+, F4/80-). j: Соотношение экспрессии PD-1, CD25 и CD69 на кластере Т-клеток CD8 в непосредственной (<50 мкм) или отдаленной (>50 мкм) близости от кластера DC. k: Доля гранзима B+ CD8 Т-клеток (CD3+, CD4-, NKp46-CD19-). l: Мышам с нокаутом Batf3 (отсутствующим cDC1) прививали 0,5 млн B16-HER2 (подкожно). Мышей лечили AdV5-IL12 и/или AdV5-CCL5.Показаны рост опухоли и кривые выживаемости Каплана-Мейера.

#x002A;p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Значения полосы погрешности представляют SEM. Для анализа выживаемости значения р рассчитывали с использованием критерия логарифмического ранга. Для сравнения кривых роста опухоли использовали двухфакторный дисперсионный анализ. См. также дополнительный рисунок S5.

Затем мы спросили, может ли терапевтическая доставка CCL5 с использованием AdV5-CCL5 компенсировать отсутствие trNK-клеток в сочетании с AdV5-IL12 у мышей, несущих B16-HER2 (рис. 3e).Действительно, комбинация дополнительно замедляла рост опухоли и увеличивала выживаемость по сравнению с одним только AdV5-IL12. FTY720 уменьшал пользу AdV5-CCL5/AdV5-IL12, предполагая, что CCL5 в основном способствует рекрутированию иммунных клеток в опухоль (дополнительная рис. S5a).

Чтобы определить факторы, которые могли бы объяснить недостаточную эффективность IL-12 в tNK-клетках бедных опухолях, мы сравнили, какие клеточные взаимодействия были индуцированы после терапии IL-12 в мышиной опухоли B16-HER2 по сравнению с опухолью мыши EMT6-HER2. модель (рис. 3f и дополнительный рис.S5b–c). Мы наблюдали два основных различия в изменениях интерактома в опухолях B16-HER2. Мы заметили более низкую индукцию NK-опухоли и CD8 Т-опухоли, а также более низкую индукцию взаимодействий DC-CD8 Т-клеток в микроокружении trNK-клеток с бедным опухолевым микроокружением. Таким образом, опухоли бедных trNK-клеток B16-HER2 характеризуются сниженной опухолевой атакой эффекторных клеток и, что более важно, сниженной индукцией перекрестных помех DC-CD8 T-клеток под действием IL-12. Затем мы спросили, может ли добавка CCL5 в опухолях бедных trNK-клеток B16-HER2 потенциально индуцировать перекрестные помехи DC-CD8 Т-клеток и, следовательно, способствовать противоопухолевому Т-клеточному иммунитету.Используя многоцветную проточную цитометрию, мы смогли обнаружить увеличение количества cDC1, когда опухоли лечили либо AdV5-CCL5 отдельно, либо в комбинации с AdV5-IL12 (рис. 3g). Соответственно, мы обнаружили увеличенное количество cDC1, экспрессирующих CD80 и PD-L1, в комбинации AdV5-CCL5-AdV5-IL12 (рис. 3h и дополнительная рис. S5b-c), что действительно привело к большему взаимодействию между DC и CD8 T-клетками ( Рисунок 3i). Эти взаимодействия привели к более активным Т-клеткам CD8 вблизи DC (рис. 3j), что привело к увеличению доли Т-клеток GzmB+ CD8. Кроме того, мы могли наблюдать увеличение количества взаимодействий между DC и опухолевыми клетками (дополнительная рис. S5d). Чтобы лучше понять вклад DCs в терапевтическую эффективность комбинации AdV5-IL12-AdV5-CCL5, мы использовали мышей Batf3 KO, лишенных cDC1s 30 . Поразительно, положительный эффект AdV5-IL12 +/- AdV5-CCL5 на контроль над опухолью и выживаемость был потерян у мышей Batf3 KO (фиг. 3l). Взятые вместе, эти данные предполагают, что cDC1, привлекаемые CCL5, необходимы для терапевтического эффекта, опосредованного IL-12, путем усиления опосредованного Т-клетками иммунитета; CCL5 может быть обеспечен эндогенными trNK-клетками или терапевтически дополнен в среде с низким содержанием trNK-клеток .

Чтобы показать потенциал нашего аденовирусного вектора в качестве платформы для комбинаторных подходов, мы затем разработали аденовирусные векторы, экспрессирующие как IL-12, так и CCL5 (дополнительная рис. S5e). Чтобы избежать делеции IL-12 или CCL5 путем гомологичной рекомбинации, мы кодировали оба трансгена под контролем ортогональных промоторов, CMV или SV40. Мы смогли продемонстрировать схожую терапевтическую эффективность, экспрессируя обе полезные нагрузки в одном вирусном векторе, независимо от выбора промотора, хотя тем самым мы уменьшили общую вирусную нагрузку на инъекцию (дополнительная рис.S5f–g).

AdV5-huIL-12 индуцирует экспрессию CCL5 в клетках trNK в опухолевых культурах, полученных от пациентов в системе человека

ex vivo мы совместно культивировали суспензии первичных опухолей от пациентов с немелкоклеточным раком легкого (НМРЛ) (рис. 4а) с HER2-экспрессирующей линией клеток рака яичников (OVCAR3), которая была трансдуцирована AdV5- huIL12 (рис. 4a–e).Было показано, что эта экспериментальная система активирует первичные субпопуляции лимфоцитов человека и запускает уничтожение раковых клеток человека в ответ на блокаду PD-1/PD-L1 31 . В кокультурах опухолевых инфильтрирующих лимфоцитов (TIL) и OVCAR3, полученных от пациентов, AdV5-huIL12 значительно снижал жизнеспособность OVCAR3 из-за усиленного уничтожения опухолевых клеток (рис. 4b). Этот эффект сопровождался увеличением секреции IFNγ (рис. 4c) и индукцией IFNγ-экспрессирующих Т-клеток CD8 и NK-клеток, происходящих от пациента, (рис. 4d).В соответствии с нашими данными о мышах, CCL5 активировался в NK-клетках с помощью IL-12 (рис. 4e).

Рисунок 4: AdV5-huIL-12 индуцирует экспрессию CCL5 в клетках trNK в опухолевых культурах, полученных от пациентов IL-12 или контрольный вирус. b: Количественная оценка жизнеспособности OVCAR-3, нормализованная для необработанных совместных культур через 96 часов. c: экспрессию IFNγ определяли в супернатантах через 5 дней. d: Количество клеток IFNγ+ CD8 T-клеток (CD3+, CD56-) и NK-клеток (CD56+, CD3-) на лунку через 96 часов. e: Количество клеток CCL5+ NK-клеток (CD56+, CD3-) через 96 ч и экспрессия CCL5 в супернатантах через 5 дней. f-g: образца рака яичников HER2+ были рассечены на фрагменты опухоли и культивированы в матригеле. Фрагменты опухоли обрабатывали HER2-направленным AdV5, кодирующим человеческий IL-12, в течение 48 ч (8-12 фрагментов на условие). г: Концентрацию CCL5 в супернатанте анализировали с помощью ELISA. ч: Показана проекция UMAP данных scRNASeq инфильтрирующих опухоль NK-клеток пациентов с НМРЛ. Количественно определяли экспрессию i: CCL5 в субпопуляциях NK1 и NK2. j: CD56 яркий CD16 низкий и определяли сигнатурные показатели клеток trNK NK1 и NK2. км: Расщепления опухолей пациентов с НМРЛ совместно культивировали с клетками OVCAR-3, которые трансдуцировали HER2-направленным AdV5, кодирующим человеческий IL-12. k: подмножества NK-клеток определяли по экспрессии CD16 и CD49a.1: субпопуляции NK, продуцирующие CCL5, были визуализированы после обработки AdV5-IL12 по сравнению с необработанными. m: Количественно определяли процент CCL5-позитивных субпопуляций NK-клеток.

*р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001, ****р < 0,0001. Значения полосы погрешности представляют SD. Использовался парный двусторонний критерий Стьюдента. Для сравнения между тремя и более группами использовался однофакторный дисперсионный анализ с множественными сравнениями. См. также дополнительный рисунок S6 и S7.

Затем мы оценили активность AdV5-huIL12 с использованием модели фрагмента опухоли, полученной от пациента, которая сохраняет микроокружение и архитектуру опухоли, но допускает возмущение ex vivo блокадой контрольных точек 32 .Фрагменты опухоли экспрессирующих HER2 образцов рака яичников, встроенных в Matrigel (рис. 4f и дополнительная рис. S6a), были трансдуцированы с помощью AdV5-huIL12. У всех четырех протестированных пациентов мы заметили повышенное окрашивание на IFNγ в CD8 T-клетках и CCL5 в NK-клетках (дополнительная рис. S6b), последнее подтверждено в супернатанте с помощью ELISA (рис. 4g).

Идентификация trNK-клеток в качестве основных продуцентов CCL5 в приведенных выше моделях опухолей мышей побудила нас охарактеризовать, какие NK-клетки человека, проникающие в опухоль, продуцируют CCL5. Поэтому мы исследовали гетерогенность инфильтрирующих опухоль NK-клеток у пациентов с НМРЛ, используя опубликованный набор данных секвенирования одноклеточной РНК (scRNASeq) 33 . Мы идентифицировали два основных подмножества NK-клеток с различными профилями экспрессии генов, при этом подкластер NK2 демонстрирует более высокую экспрессию CCL5 по сравнению с подкластером NK1 (рис. 4h-i и дополнительная рис. S7a-b). Недавно были описаны коровые сигнатурные гены NK, связанные с цитокин-продуцирующим фенотипом (CD56 Bright CD16 ) и резидентностью в тканях 34,35 .Мы заметили значительное обогащение CD56 Bright CD16 и тканевых генов в субкластере NK2, продуцирующем CCL5 (рис. 4j). Сигнатурные гены основной ткани включают активацию интегрина ITGA1 (CD49a), ITGAE (CD103), CD69 и ENTPD1 (CD39), что отличает NK2 от сильно экспрессирующего FCGR3A 906)-38 (CD39) Подтип NK1. Чтобы выяснить, индуцирует ли IL-12 продукцию CCL5 в NK-клетках с характеристиками тканевой резидентности (CD49a + CD16 ), мы охарактеризовали проникающие в опухоль NK-клетки человека, продуцирующие CCL5, в нашей системе совместного культивирования (рис. 4a и дополнительная рис. .С7). В соответствии с нашими выводами, полученными на моделях опухолей мышей, CD49a + CD16 trNK-клетки продуцировали значительно более высокие уровни CCL5 в ответ на AdV5-huIL12 по сравнению с CD16 + CD56 dim обычными NK (cNK) клетками ( Рисунок 4м). В совокупности эти эксперименты резюмируют наши выводы о том, что IL-12 может напрямую стимулировать противоопухолевую активность проникающих в опухоль Т-клеток и индуцировать активацию CCL5 в trNK-клетках в первичных опухолях человека.

Экспрессия CCL5 trNK-клеток повышает эффективность блокады PD-1

Было продемонстрировано, что IL-12-продуцирующие DC, активируемые IFNγ-секретирующими CD8 T-клетками, имеют решающее значение для успешного ответа на лечение против PD-1 5 . Это привело нас к окончательному исследованию того, связан ли аттрактант DC CCL5 с эффективным ответом опухоли на терапию анти-PD-1.

У пациентов с меланомой, получающих лечение ниволумабом 36 , мы сравнили индукцию CCL5 во время лечения у отвечающих (R) и не отвечающих (NR) пациентов (рис. 5а). В то время как активация CCL5 была связана с клиническими ответами (рис. 5b), мы заметили положительную корреляцию между сигнатурой NK2 и экспрессией CCL5 (рис. 5c) 9 .Мы также обнаружили положительную корреляцию между уровнями CCL5 и cDC1 у пациентов с меланомой, получавших лечение (рис. 5d). Эти данные свидетельствуют о том, что CCL5 может продуцироваться внутриопухолевыми trNK-клетками в ответ на блокаду PD-1 и впоследствии может способствовать рекрутированию cDC1, что согласуется с нашими наблюдениями на моделях опухолей после лечения IL-12.

Рисунок 5: Экспрессия CCL5 в клетках trNK повышает эффективность блокады PD-1

a-d: Экспрессия CCL5 в биоптатах опухолей пациентов с меланомой (n = 42) была проанализирована до и после лечения ниволумабом 36 . b: Количественно определяли нормализованную экспрессию CCL5 до и после лечения ниволумабом между пациентами без ответа (NR) или ответа (R = SD+PR+CR). c: Показана корреляция между экспрессией CCL5 и оценкой сигнатуры NK2 или d: сигнатурной оценкой cDC1. например: Образцы рака были рассечены на фрагменты опухоли и культивированы в матригеле. Фрагменты опухоли обрабатывали ниволумабом в течение 48 ч (6-8 фрагментов на состояние).IFNγ и CCL5 определяли в супернатанте. n = 6 образцов опухоли. h-k: Расщепления опухолей пациентов с НМРЛ, получавших ниволумаб, культивировали совместно с клетками OVCAR-3 в течение 48 часов. i: Жизнеспособность OVCAR3 была нормализована по отношению к необработанной контрольной группе. В супернатанте определяли j: IFNγ и k: CCL5. Процент CCL5-позитивных NK-клеток определяли количественно после лечения ниволумабом. l: Соотношение NK2/NK1 пациентов без ответа (NR:PD) по сравнению с ответом (R:SD + PR) до и после ICI. м: мышам WT привили 0,5 млн B16-HER2 (подкожно). Мышей обрабатывали антителами AdV5-CCL5 (в/б) и/или анти-PD-1 (в/б) на 11, 13, 15 и 18 день (размер опухоли 30–70 мм 3 ), как указано. Показаны кривые роста опухоли. n=6 мышей на условие.

*р < 0,05, **р < 0,01, ***р < 0,001, ****р < 0,0001. Значения полосы погрешности представляют SD или SEM (кривые роста опухоли). Использовался парный двусторонний критерий Стьюдента. Для сравнения между тремя и более группами использовался однофакторный дисперсионный анализ с множественными сравнениями.Для сравнения кривых роста опухоли использовали двухфакторный дисперсионный анализ.

Для дальнейшего изучения этой возможности мы использовали платформу фрагментов опухоли, полученную от пациентов, которая позволила нам выделить ранний иммунологический ответ опухолевой ткани человека на блокаду PD-1 32 . Мы измерили IFNγ и CCL5 в супернатантах фрагментов опухолей раковых больных, подвергшихся воздействию анти-PD-1 (рис. 5e). В соответствии с корреляционным анализом данных клинических испытаний (рис. 5b) мы обнаружили увеличение CCL5 в реагирующих фрагментах (активация IFNγ) после блокады анти-PD-1 (рис. 5 f–g).

Затем мы совместно культивировали TIL человека с клетками OVCAR3, подвергшимися воздействию анти-PD-1 (рис. 5h). Обработка анти-PD-1 приводила к высоким концентрациям IFNγ и CCL5 в супернатантах и ​​усиленному уничтожению клеток OVCAR3 (рис. 5i–k). Доля клеток CCL5+ была выше в клетках CD49a+ CD16-trNK по сравнению с клетками cNK в сокультурах, подвергшихся воздействию анти-PD-1 (рис. 5k), что подтверждает, что клетки trNK являются основным источником CCL5, индуцированного иммунотерапией.

Чтобы дополнительно подчеркнуть благоприятный ответ CCL5-продуцирующих резидентных в тканях клеток NK2 при блокаде PD-1, мы рассчитали отношение сигнатурных баллов NK2 к NK1 для каждой NK-клетки в наборе данных scRNASeq пациентов с меланомой, получавших иммунную ингибиторы контрольных точек (ICI) в качестве суррогата характеристик NK2 при контроле численности NK-клеток. Действительно, мы наблюдали, что фенотип NK2 был значительно обогащен у пациентов, демонстрирующих клинический ответ (рис. 5l).

Наконец, мы спросили, может ли CCL5 дополнительно усилить терапию против PD-1 в опухолях с низким содержанием trNK-клеток. Мы объединили терапию против PD-1 с аденовирусным вектором, кодирующим CCL5, у мышей с B16-HER2 (рис. 5m). В то время как отдельное лечение AdV5-CCL5 не показало какой-либо терапевтической эффективности, мы наблюдали синергетические терапевтические эффекты в сочетании с лечением анти-PD-1.

В совокупности эти данные показывают, что продукция CCL5 клетками trNK усиливает ответ на блокаду PD-1, в то время как терапия, дополняющая CCL5, может повышать ее эффективность.

Обсуждение

Комбинации мультимодальной иммунотерапии, направленные на различные взаимодействия иммунной системы с опухолью, стали краеугольным камнем в терапевтическом лечении пациентов с различными типами рака и активно изучаются для максимизации клинического эффекта иммунотерапии рака 37–40 . Здесь мы определяем отсутствие trNK-клеток как непризнанный барьер для эффективности лечения таргетной терапией IL-12 и анти-PD-1. Мы показываем, что IL-12 усиливал противоопухолевые взаимодействия DC-CD8 T-клеток, которые основывались на специфической для trNK-клеток индукции CCL5. В моделях опухолей с ограниченным количеством trNK-клеток и, следовательно, низкими уровнями CCL5 наблюдались только умеренные ответы IL-12. Тем не менее, ответы опухолей с низким содержанием trNK-клеток могут быть восстановлены одновременным введением аденовирусного вектора, кодирующего CCL5, который после преобразования опухолевых клеток в сайты продукции CCL5 индуцирует инфильтрацию cDC1 и, таким образом, увеличивает взаимодействие Т-клеток DC-CD8 (дополнительная рис.С8). Из-за уникальной роли cDC1 в инициации ответов Т-клеток, как de novo, так и после ингибирования контрольной точки анти-PD-1, мы впоследствии наблюдали, что CCL5, продуцируемый trNK-клетками, управляет ответом на терапию анти-PD-1, которая может быть доставлены с использованием платформы AdV5. Эти результаты могут быть использованы для улучшения иммунотерапии путем точной настройки перекрестных помех между лимфоидными и миелоидными иммунными компартментами с использованием мультимодальной комбинированной иммунотерапии, адаптированной к ранее существовавшему опухолевому микроокружению каждого пациента.

Было показано, что вирусные векторы являются подходящим инструментом для местной иммунотерапии, уменьшая системное распространение терапевтических агентов и, следовательно, избегая системных побочных эффектов 41 . Наша аденовирусная платформа использует экзогенно добавленные адаптеры перенацеливания, состоящие из DARPins 42 . Эта стратегия имеет уникальные преимущества по сравнению с нацеливанием с помощью генетических модификаций, включая большую существующую библиотеку DARPin и быстрый отбор новых адаптеров DARPin против любого заданного поверхностного белка 43,44 .Здесь мы нацелились на модель антигена опухоли HER2, который сверхэкспрессируется при различных типах рака 45 . Для дальнейшего расширения клинической применимости DARPins могут быть выбраны для специфического распознавания мишеней на клетках, отличных от опухолевых клеток, таких как белок активации фибробластов (FAP) на ассоциированных с опухолью фибробластах 46,47 . В последнее время разработка высокопроизводительных зависимых от хелперов AdVs позволила экспрессировать трансгены размером до 36 тысяч пар оснований. Это, в сочетании с таргетной и экранированной стратегией, увеличило потенциал AdVs как идеального вектора для мультимодальной иммунотерапии рака 22,48 .Предыдущая работа показала, что аденовирусные векторы могут действовать как «самоадъюванты», позволяя стимулировать множественные сигнальные пути врожденного иммунитета, такие как толл-подобные рецепторы, и индуцировать интерфероны типа I при проникновении вируса 49–51 . Хотя эти эффекты могут объяснить влияние пустого AdV5-контроля на задержку опухоли, улучшенный противоопухолевый иммунитет подтверждает потенциальное преимущество аденовирусных векторов по сравнению с другими векторами доставки генов 52,53 .

Различные факторы и типы клеток в микроокружении опухоли лежат в основе клинического успеха иммунотерапии рака, и распутывание этих сложных взаимодействий имеет решающее значение для понимания и повышения терапевтической эффективности 54 .Хотя обычно это редкость, дендритные клетки играют ключевую роль в организации противоопухолевого иммунитета. DC включают отдельные подмножества с неперекрывающимися функциями, которые можно использовать для иммунотерапии рака 33 . Внутриопухолевое присутствие дендритных клеток и особенно продукция IL-12 связаны с лучшей выживаемостью при различных типах рака и положительно коррелируют с клиническими результатами анти-PD-1 терапии 2 . Следовательно, IL-12 был широко исследован для использования в иммунотерапии рака.Однако многие предыдущие попытки разработать методы лечения на основе IL-12 для использования у людей привели к тяжелой токсичности и ограниченной частоте ответа даже в подходах, направленных на опухоли 14,55 . Здесь мы демонстрируем, что IL-12, обеспечиваемый внутриопухолевым путем паракринной доставки AdV5, способен соединять врожденный и адаптивный иммунитет. Вследствие IL-12, продуцируемого опухолевыми клетками после обработки AdV5-IL12, Т-клетки CD8, полученные из опухолей больных раком и в опухолевых моделях, повышали свою активацию и цитотоксический потенциал.В последнем случае ранний контроль роста опухоли достигается за счет стабильного состояния лимфоцитов, присутствующих в опухоли. Тем не менее, для достижения долгосрочного отторжения опухоли необходим транспорт лимфоцитов и антигенов в дренирующие лимфатические узлы. В соответствии с этим мы наблюдали увеличение количества NK-клеток и CD8 T-клеток в непосредственной близости от кровеносных сосудов, что предполагает усиленный перенос от периферии к опухоли. Это может быть вызвано наблюдаемой секрецией CCL5 клетками trNK или другими IFNγ-индуцированными хемокинами, такими как CXCL9 и CXCL10.Более того, тот факт, что cDC1s были описаны как основной источник CXCL9 и CXCL10 56 , может впоследствии объяснить усиленное взаимодействие между CD8 T-клетками и DCs, которые первоначально были привлечены к TME CCL5. Следовательно, мы продемонстрировали, что AdV5-IL12 не только улучшает самонаведение и активацию лимфоцитов в первичной опухоли, но также способствует абскопальному противоопухолевому действию на отдаленных сторонах опухоли.

NK-клетки участвуют в различных иммунных функциях во время инициации и прогрессирования рака, включая распознавание клеток, подвергающихся стрессу или ранней трансформации, и прямое уничтожение чувствительных клеток 4 .Помимо быстрой дегрануляции при распознавании мишени, NK-клетки являются мощными продуцентами широкого спектра провоспалительных цитокинов и хемокинов, формирующих воспалительную среду опухолей 2,9 . Появляется все больше доказательств того, что величина инфильтрации NK-клеток имеет сильное прогностическое значение при различных видах рака и предсказывает клинические исходы блокады иммунных контрольных точек при различных типах опухолей 57 . Исследования NK-клеток изначально подчеркивали их цитотоксический потенциал, в частности, в контексте противоопухолевого иммунитета. Таким образом, зрелые мощные цитолитические эффекторные CD56 dim CD16 high cNK-клетки, быстро секретирующие провоспалительные цитокины и цитотоксические медиаторы при рецептор-опосредованной активации, рассматривались как основные субпопуляции, опосредующие опухолевый иммунитет. trNKs, напротив, демонстрируют сниженный цитотоксический потенциал, будучи специализированными на продукции цитокинов, таких как секреция TNFα, GM-CSF и IL-2. Было описано, что они экспрессируют повышенные уровни рецепторов ингибиторных контрольных точек и поэтому скорее связаны с тканевым гомеостазом 58 .В контексте рака они плохо охарактеризованы и неоднозначно обсуждаются. Они были связаны с плохой выживаемостью при гепатоцеллюлярной карциноме человека, в то время как, с другой стороны, также сообщалось, что они объединяют усилия с клетками cNK для контроля метастазов в печени 59,60 . Здесь мы демонстрируем, что trNK-клетки и их экспрессия CCL5 были необходимы для эффективности AdV5-IL12 и, кроме того, коррелировали с ответом на анти-PD-1 у пациентов с меланомой человека. Эти данные раскрывают решающую роль tNK-клеток в праймировании иммунного микроокружения опухоли путем индукции взаимодействий DC-CD8 T-клеток и предоставляют прямые доказательства того, что отсутствие внутриопухолевого рекрутирования cDC1 trNK-клетками представляет собой основной барьер для терапии на основе T-клеток.Однако необходимо провести дальнейшую работу, чтобы всесторонне охарактеризовать trNK-клетки в опухолях человека, особенно до и после иммунотерапии. Более того, необходимо идентифицировать зависящие от ниши или происходящие от опухоли факторы, которые опосредуют резистентность, ограничивая накопление, дифференцировку, выживание и функцию этих клеток в микроокружении опухоли. Такие факторы могут служить прогностическими маркерами для терапии, ориентированной на Т-клетки, и определять необходимость потенциальных комбинаций с агентами, привлекающими cDC1.Что касается последнего, здесь мы идентифицируем CCL5, который, как мы показываем, повышает эффективность терапии, индуцирующей IFNγ, такой как IL-12 или ингибирование контрольных точек в опухолях с низким количеством trNK-клеток.

Существуют некоторые разногласия относительно роли CCL5 в развитии рака. Ряд исследований предполагает, что CCL5 обладает потенциальным стимулирующим опухоль эффектом, либо непосредственно влияя на рост опухоли , 61, , способствуя иммуносупрессивному микроокружению опухоли , 62, , усиливая миграцию опухолевых клеток , 63, , либо размножая раковые стволовые клетки , 64, .Напротив, другие исследования показывают задержку роста опухоли и пролонгированное выживание на моделях мышей с CCL5-экспрессирующими опухолевыми клетками, а также корреляцию между экспрессией CCL5 и фенотипом Т-клеток у раковых больных 65-67 . В наших моделях AdV5-CCL5 не проявлял каких-либо эффектов, способствующих развитию опухоли, но также не проявлял терапевтических преимуществ в качестве монотерапии. Примечательно, что в соответствии с предыдущей работой 9 обработка AdV5-CCL5 индуцировала рекрутирование cDC1. Однако только комбинация с AdV5-IL12 приводила к более высокому костимулирующему потенциалу и впоследствии повышала опухоле-реактивные Т-клетки. Это говорит о том, что противоопухолевые свойства CCL5, вероятно, зависят от контекста: в присутствии других противоопухолевых сигналов, индуцированных лечением IL-12 или анти-PD1, которые, как известно, склоняют чашу весов в пользу провоспалительной среды. CCL5 может дополнительно усиливать эти эффекты, что затем приводит к улучшению ответов, о чем свидетельствуют наши данные in vivo и анализ когорт пациентов. Помимо CCL5, было описано, что XCL1 обладает сходной способностью рекрутировать cDC1s в ложе опухоли, но не обладает способностями стимулировать опухоль 9 .В связи с этим XCL1 может быть интуитивно понятной альтернативной полезной нагрузкой для направления cDC1 в опухоли для улучшения противоопухолевого иммунитета.

В совокупности наши данные подчеркивают важность tNK-клеток и их способность индуцировать Т-клеточный иммунитет за счет усиления перекрестных помех DC-T-клеток в терапии, индуцирующей IFNγ, и могут служить основой для новых комбинированных стратегий с использованием вирусных векторных платформ в качестве подхода для дальнейшего усиления этой NK перекрестные помехи клетки-DC-T-клетки. Наши данные подчеркивают соответствующий механизм положительной обратной связи, устраняющий опухоль, который должен быть приоритетным для клинической разработки, особенно у пациентов с иммунодефицитными и/или резистентными опухолями.

Методы

Модернизация челночного вектора AdV5

Вектор pShuttle из системы аденовирусных векторов AdEasy™ (Agilent Technologies) был переработан для обеспечения быстрого создания и обмена модульными экспрессионными кассетами, кодирующими различные полезные нагрузки 68 . Сайт множественного клонирования (MCS) вектора pShuttle был заменен синтетическими модулями MCS, названными MCS1 или MCS2, с помощью Gibson Assembly (New England Biolabs). Синтетический модуль MCS1 содержал от 5’ до 3’ промотор CMV, сайт рестрикции NheI, сайт рестрикции XhoI и сайт полиА из BGH, как описано ранее 20.Модуль MCS2 содержал от 5’ до 3’ промотор SV40, сайт рестрикции SpeI, сайт рестрикции SalI и сайт полиА из SV40. Модули MCS были синтезированы компанией GeneArt (Life Technologies Europe BV), содержащие N-концевую фланкирующую ДНК 5′-GAA TAA GAG GAA GTG AAA TCT GAA TAA TTT TGT GTT ACT CAT AGC GCG TAA-3′ и С-концевую фланкирующую ДНК 5 ‘-TAA GGG TGG GAA AGA ATA TAT AAG GTG GGG GTC -3’ для сборки Gibson в pShuttle для получения плазмид pShuttle-MCS1 или pShuttle-MCS2. Кроме того, была сконструирована плазмида под названием pShuttle-MCS1-MCS2, в которой модули MCS1 и MCS2 были вставлены последовательно в одну и ту же конструкцию pShuttle.

Конструирование конструкции полезной нагрузки

Конструкции мышиного и человеческого IL-12 были созданы из транслированных последовательностей кДНК Genbank для IL-12B/p40 (ссылка NCBI: BC103608.1 или BC074723.2, соответственно) и IL-12A/p35 ( Ссылка NCBI: BC146595.1 или BC104984.1 соответственно), соединенные пептидом F2A, как описано ранее 69 . Мышиный ген CCL5 был получен из последовательности Uniprot P30882. Цитокины включали свои нативные сигнальные последовательности, были оптимизированы по кодонам для экспрессии человека или мыши, соответственно, и синтезированы GeneArt (Thermo Fisher Scientific).Для репортерных анализов репортер люциферазы светлячка был синтезирован из GenBank: BAL46512.1. Конструкции полезной нагрузки были вставлены в переработанные векторы pShuttle с помощью сборки Gibson или стандартного клонирования лигирования для создания pShuttle-MCS1, включая полезную нагрузку. Основу pShuttle-MCS1 (без полезной нагрузки) использовали для создания контрольного вектора AdV5. Как правило, для создания иммунотерапевтических векторов использовали pShuttle-MCS1-IL12 (AdV5-IL12), pShuttle-MCS1-CCL5 (AdV5-CCL5) и pShuttle-MCS1-Luciferase (AdV5-Luc).Для оптимизации комбинаторного подхода (рис. S5) pShuttle-MCS2-CCL5 (AdV5-SV40-CCL5) и pShuttle-MCS2-IL12 (AdV5-SV40-IL12), pShuttle-MCS1-IL12-MCS2-CCL5 (AdV5-CMV- IL12-SV40-CCL5) и pShuttle-MCS1-CCL5-MCS2-IL12 (AdV5-CMV-CCL5-SV40-IL12).

Вирусная продукция

Плазмида, содержащая аденовирусный геном, pAdEasy-1, из системы аденовирусных векторов AdEasy™ (Agilent Technologies) была предварительно модифицирована для включения мутации в гипервариабельную петлю 7 (HVR7) гексона, которая предотвращает кровотечение фактор X связывается с вирионами и, таким образом, уменьшает инфекцию печени 22 .Для создания вирусных конструкций модифицированную плазмиду pAdEasy-1_HVR7 котрансформировали с вариантами pShuttle-MCS, перечисленными выше, в recA-способные клетки E. coli BJ5183, из которых можно было выделить желаемые рекомбинанты, полученные путем гомологичной рекомбинации, для продукции вируса. . Упаковку и амплификацию аденовирусных частиц выполняли в Vector Biolabs (Малверн, Пенсильвания, США), они очищались в двух последовательных градиентах плотности хлорида цезия и поставлялись непосредственно в PBS с 5% глицерином.

Очистка белка аденовирусного щита и адаптера для перенацеливания

Аденовирусный адаптер для перенацеливания HER2 человека (G3_1D3nc_SHP1) экспрессировали и очищали, как описано ранее 22,42 . Эндотоксин удаляли из очищенных адаптеров с помощью системы удаления эндотоксинов Endotrap ® HD (Hyglos GmbH), и адаптеры хранили при температуре -80°C в не содержащем эндотоксина PBS Дульбекко (Millipore TMS-012-A). Аденовирусный щит очищали в клетках насекомых Sf9, как описано ранее 22 .

Мыши

Мыши C57BL/6 и Balb/c были выведены в Университетской больнице Базеля, Швейцария. Мыши Batf3 KO (B6.129S(C)-Batf3/J) были получены из лаборатории Джексона, США. Животных содержали в специальных условиях, свободных от патогенов. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с швейцарскими федеральными нормами. Были использованы однопометники одного помета в возрасте 8-12 недель в начале экспериментов.

Модели опухолей

Мышам C57BL/6 и Batf3KO подкожно в правый бок вводили 0.5 млн сингенных клеток мышиной меланомы B16 D5, экспрессирующих HER2 (любезно предоставленных доктором Л. Вайнером, Джорджтаунский университет, Вашингтон, округ Колумбия), суспендированных в DMEM, не содержащей фенолового красного (без добавок). Клетки рака молочной железы мышей EMT6, экспрессирующие HER2 (1 млн), вводили в молочную железу самок мышей Balb/c 70 . Линии клеток перед инъекцией тестировали на заражение микоплазмой. Объем опухоли рассчитывали по формуле: D/2 x d x d, где D и d — самый длинный и самый короткий диаметр опухоли в мм соответственно.

Иммунотерапевтическое лечение

Опухоленосящие мыши с размером опухоли примерно 30–70 мм 3 получали 1,5×10 8 БОЕ HER2-направленных и экранированных аденовирусных векторов в 50 мкл PBS (перитуморально ) и/или 12,5 мг/кг мышиного анти-PD-1 (RPM1-14, BioXCell) или не подвергались лечению. Для исследования истощения Т-клетки CD8 истощали путем введения анти-CD8a (53-6.72, BioXCell) в дозе 10 мг/кг (внутрибрюшинно) один раз в неделю. Истощение NK осуществляли путем введения анти-Asialo-GM1 (Poly21460, Biolegend) 50 мкл (т.р.) у мышей Balb/c или анти-NK1.1 (PK136, BioXCell) 10 мг/кг (внутрибрюшинно) у мышей C57BL/6 каждые 4-5 дней. Нейтрализацию IFNγ проводили с использованием антитела против IFNγ (XMG1.2, BioXcell) в дозе 25 мг/кг в 200 мкл PBS, вводили каждые 2-3 дня. Чтобы нейтрализовать CCL5, мы инъецировали 32 мкг антитела против CCL5 (500-P118, Peprotech) в 200 мкл PBS на мышь внутрибрюшинно. Схемы истощения и нейтрализации начинали за день до лечения иммунотерапией, если не указано иное.

Двусторонние модели опухолей

Мышам Balb/c инокулировали 1 млн опухолевых клеток EMT6-HER2 (т.м.) на правом фланге. Через четыре дня в контралатеральный участок (внутримышечно) вводили 0,25 млн клеток EMT6 wt. На 7, 9, 11 и 13 дни после первой инокуляции опухоли опухоли EMT6-HER2 обрабатывали 1,5×10 8 БОЕ HER2-направленного и экранированного аденовирусного вектора, кодирующего IL-12, в 50 мкл PBS (перитуморально). . Измеряли объемы контралатеральных (EMT6 wt) опухолей.

Повторное заражение опухолью

Долго выжившие мыши после терапии AdV5-IL12 были повторно заражены опухолями EMT6 wt и EMT6-HER2 на каждом боку через 60 дней после отторжения первичной опухоли.Дозы повторного заражения EMT6 wt и EMT6-HER2 составляли 0,25 млн клеток и 1 млн клеток соответственно. В качестве контроля наивным мышам Balb/c имплантировали вместе с повторно зараженными мышами.

Лечение FTY720

Мышам были имплантированы опухоли EMT6-HER2 или B16-HER2 интрамаммарно или подкожно, соответственно. Мышей лечили или не лечили 1,25 мг/кг FTY720 (Cayman Chemical) внутрибрюшинно. ежедневно на протяжении всего эксперимента. Инъекции начинали за день до инокуляции опухоли или за день до лечения аденовирусом.

In vivo Фармакокинетические эксперименты

Мышам были имплантированы опухоли EMT6-HER2 или B16-HER2 внутригрудно или подкожно, соответственно. Как только опухоли достигли среднего объема 30-70 мм 3 , ретаргетированный и экранированный AdV5, кодирующий люциферазу (1,5×10 8 БОЕ на мышь; AdV5-Luc), вводили перитуморально. Сигнал люциферазы определяли у живых животных через день после инъекции вируса и через 10 минут после внутрибрюшинной инъекции 150 мг/кг D-люциферина (PerkinElmer) с использованием системы визуализации in vivo NightOWL II LB 983 (Berthold) в течение двух недель.После живой визуализации активность люциферазы определяли в изолированных опухолях и органах (дренирующие и недренирующие лимфатические узлы, селезенка, печень, почки, легкие и сердце). Наложение реального изображения и представления люминесценции позволило локализовать и измерить люминесценцию, испускаемую ксенотрансплантатами. Интенсивность сигнала из областей интереса, полученных вручную (ROI), была получена, и данные были выражены как поток фотонов (фотон/с). Все измерения проводились в одинаковых условиях, включая настройки камеры, время экспозиции (60 с), расстояние от линз до животных и размер ROI.

Многопараметрическая проточная цитометрия

Опухолевая ткань была выделена у мышей, взвешена и измельчена с помощью лезвий бритвы. Затем ткань расщепляли с использованием аккутазы (PAA), коллагеназы IV (Worthington), гиалуронидазы (Sigma) и ДНКазы типа IV (Sigma) в течение 60 мин при 37°C при постоянном встряхивании. Суспензии клеток фильтровали с использованием клеточного фильтра (70 мкм). Перед окрашиванием добавляли шарики Precision Counting (Biolegend) для количественного определения количества клеток на грамм опухоли. Суспензии отдельных клеток блокировали крысиными блокирующими антителами против мышиного рецептора FcγIII/II (CD16/CD32) («Fc-Block») и окрашивали красителем для исключения живых/мертвых клеток (краситель Zombie UV; Biolegend). Затем клетки инкубировали с антителами, конъюгированными с флуорофором, направленными против антигенов клеточной поверхности, промывали и ресуспендировали в буфере FACS (PBS + 2% FBS). Для внутриклеточных/внутриядерных антигенов клетки, окрашенные антителами клеточной поверхности, фиксировали и пермеабилизировали с использованием набора буферов для окрашивания Foxp3/фактор транскрипции (eBioscience) перед инкубацией с антителами, направленными против внутриклеточных антигенов. Популяции клеток анализировали на Cytek Aurora и Cytoflex.

Биоинформатический анализ данных проточной цитометрии

Файлы FCS, содержащие предварительно гейтированные живые одиночные клетки CD45+, были прочитаны в R с использованием пакета flowCore (flowCore: flowCore: Базовые структуры для данных проточной цитометрии, версия 2.2.0 от Биокондуктора). Для каждого канала было выполнено логическое преобразование, при этом параметры рассчитывались на основе агрегированных данных всех выборок. Клетки с низким уровнем CD45 с трансформированным значением <2,5 удаляли из дальнейшего анализа (пороговое значение, установленное с левой стороны впадины графика плотности трансформированных значений CD45 из всех образцов). Измерения были случайным образом разделены на 1,5 x 10 5 клеток на условие, чтобы ускорить дальнейшие операции. Анализ основных компонентов (PCA) проводили с использованием всех маркеров, кроме CD45, Live-Dead, FSC* и SSC*.Аппроксимация и проекция равномерного коллектора (UMAP) выполнялись для визуализации с использованием функции runDR модуля CATALYST (CATALYST: Cytometry dATa anALYSis Tools, версия 1.14.0 от Bioconductor). Кластеризация выполнялась с использованием Rphenograph (0.99.1), реализации PhenoGraph на языке R (GitHub — JinmiaoChenLab/Rphenograph: Rphenograph: реализация алгоритма PhenoGraph на R) 74 . Пять кластеров с универсально высокой экспрессией по всем маркерам были удалены, и повторены шаги, начинающиеся с PCA.Три результирующих кластера были снова удалены, и процесс повторился еще раз, чтобы получить окончательную кластеризацию, UMAP и тепловые карты 75 . Дополнительная визуализация UMAP масштабированного выражения маркера, выполненная с помощью функции plotDR CATALYST. Основные типы клеток определяли по экспрессии маркера. Для подтверждения определенных отнесений клеточные популяции гейтировали с помощью FlowJo (10.6.2) и сравнивали с назначенными популяциями (например, NK-клетки: NKp46+, CD3-, CD19-Ly-6G-, F4/80-).

Многопараметрическая флуоресцентная микроскопия

Опухоли, залитые в ОКТ, разрезали на срезы толщиной 7 мкм и прикрепляли к квадратным покровным стеклам, покрытым поли-L-лизином.Срезы анализировали с использованием CODEX ® (Akoya Biosciences), высокомультиплексной платформы визуализации, которая позволяет окрашивать срезы твердых тканей панелью, содержащей до 40 антител одновременно 23 . Вкратце, CODEX использует уникальную систему штрих-кодов ДНК для индивидуальной маркировки каждого клона антитела. Эти штрих-коды могут быть обнаружены путем обратимой гибридизации с соответствующим репортером. Соответствующие репортеры, конъюгированные с флуорофорами AF488, Atto550 или Cy5, наносят на срезы ткани, визуализируют и удаляют в многоцикловом эксперименте. С этой целью следовали протоколу производителя «CODEX User Manual Rev A.0» (предоставленному AKOYA Biosciences).

Панель антител состояла из коммерчески доступных конъюгированных с AKOYA антител и самоконъюгированных пользовательских антител (набор для конъюгации CODEX, AKOYA Biosciences). Окрашивание тканей проводили с помощью набора для окрашивания CODEX (AKOYA Biosciences). Вкратце, ткань оттаивали шариками дриерита, фиксировали ацетоном, регидратировали и фиксировали 1,6% параформальдегидом (PFA).После блокировки ткань окрашивали установленной панелью антител, состоящей из 33 антител со штрих-кодом одновременно. Связанные антитела фиксировали на ткани с помощью 1,6% PFA, ледяного метанола и фиксирующего раствора (AKOYA Biosciences).

Для сбора данных использовался обратный микроскоп DMi8 (Leica) (увеличение 20x, режим сбора данных xyz, 14 Z-стеков по 14,99 мкм, автофокусировка «Best Focus» с настройками по умолчанию). Сгенерированные данные флуоресценции были отформатированы с помощью Akoya CodexDriver V2 и впоследствии обработаны с помощью процессора CODEX (версия v1. 5.0.48b) или подключаемый модуль Kheops в ImageJ и QuPath0.2.3 и StarDist 76–78 . Этапы обработки включали: 1) обработку XY с регистрацией плитки и коррекцией затенения; 2) Z-Stack Processing с деконволюцией, компенсацией дрейфа, кадрированием внахлест, вычитанием фона (режим min-min) и определением наилучшего фокуса; 3) Сшивание с интерполяцией наилучшего фокуса и перекрытием плиток 10% и 4) Сегментация клеток на ядерном пятне с радиусом 8 или порогом (0,69), каналы (‘DAPI’), нормализация процентилей (1.99), размер пикселя (0,423), расширение ячейки (2,8), масштаб ограничения ячейки (1,5) в StarDist соответственно.

Обработанные и сегментированные данные были проанализированы с помощью средства просмотра множественных анализов CODEX (версия 1.2.0.297) или алгоритма PhenoGraph с использованием R 4.0.2. Ручной гейт выполняли, чтобы различать клетки CD45+ (иммунные клетки) и клетки CD45 (опухолевые и стромальные клетки). Кластеризация была выполнена с помощью VORTEX с использованием несмещенной иерархической кластеризации со сдвигом по оси X (K = 55, что дает 81 иммунный кластер) 79 . Кластеры были проверены вручную и отнесены к основным популяциям иммунных клеток с помощью CODEX Multiple Analysis Viewer или QuPath. Затем определяли среднюю экспрессию маркера и количество взаимодействий между основными клеточными популяциями (клетки с близостью <50 мкм).

Анализ взаимодействия

Для дальнейшего анализа использовали количество взаимодействий между основными клеточными популяциями (контакт определяется как близость <50 мкм). Кластер «L», содержащий лимфатические сосуды, был исключен из дальнейшего анализа из-за очень четкой локализации его клеток в виде мелких сосудов.Ожидаемое количество взаимодействий для каждой пары межклеточных взаимодействий рассчитывали следующим образом:

Затем в R 4.0.2 была создана обобщенная линейная модель с отрицательным биномиальным числом взаимодействий со смещением log(expectedInteractions). Условия математического взаимодействия между сравнением типов клеток (например, DC_vs_CD8) и экспериментальными условиями (необработанные, AdV5-пустые, AdV5-IL12) использовались для расчета отношения шансов и p-значений для изменений во взаимодействиях типов клеток между экспериментальными условиями. Отношения шансов для различных подмножеств иммунных клеток были построены с использованием ggplot2.

Внутриопухолевые и системные измерения цитокинов

Сыворотку собирали в пробирки, содержащие ЭДТА (Sarstedt), и уровни IL-12 определяли с использованием набора IL-12 p70 Mouse Uncoated ELISA Kit (Invitrogen). Изолированные опухоли быстро замораживали на сухом льду. Перед оттаиванием в пробирки добавляли 5 мм металлические шарики и 1 мл буфера для лизиса (20 мМ Tris HCl (pH 7,5), 0,5% Tween 20, 150 мМ NaCl, ингибиторы протеазы Sigma 1:100).Опухоли лизировали с использованием TissueLyser (Qiagen) в течение 5 мин при 25 Гц. После центрифугирования концентрацию белка определяли с помощью набора для анализа белка Pierce BCA (Thermo Scientific). Концентрацию CCL5 в опухолевых лизатах анализировали с помощью ELISA (Mouse RANTES Uncoated ELISA Kit Invitrogen) и нормализовали к определенным концентрациям общего белка.

Пациенты и подготовка образцов

Хирургические образцы были механически диссоциированы, обработаны аккутазой (PAA Laboratories), коллагеназой IV (Worthington), гиалуронидазой (MilliporeSigma) и ДНКазой типа I (MilliporeSigma), отфильтрованы, промыты и заморожены как отдельные клетки приостановка использования в будущем. Для опухолевых культур человека ex vivo хирургические образцы разрезали на фрагменты опухоли и замораживали для будущего использования. РВМС человека выделяли центрифугированием в градиенте плотности с использованием Histopaque-1077 (MilliporeSigma) из лейкоцитарных пленок, полученных от здоровых доноров крови (Банк крови, Университетская клиника Базеля). РВМС замораживали для последующего использования в жидком азоте. Было получено одобрение местного этического комитета по анализу образцов тканей и крови (Ethikkommission Nordwestschweiz), а письменное информированное согласие было получено от всех пациентов перед сбором образцов.

Ex vivo Эксперименты по совместному культивированию иммунных клеток человека и опухолей

PBMC здоровых доноров или образцы расщепленных опухолей, обработанные, как описано выше, совместно культивировали с клеточной линией рака яичников человека OVCAR3, аналогично тому, как описано в Natoli et al. . 2020. Вкратце, 6000 клеток OVCAR3 высевали в лунки плоскодонного 96-луночного планшета в RPMI, содержащем L-глутамин (R8758, Sigma-Aldrich) с добавлением пенициллина/стрептомицина (100 нг/мл, Sigma-Aldrich). и 10% FBS (Sigma-Aldrich).Через 2 часа среду заменяли на полностью дополненную среду RPMI, содержащую AdV5-hu-IL12, или пустой контрольный вектор (AdV5-контроль) при БОЕ 1000/клетку. Дополнительные контрольные лунки оставляли необработанными. Через 2 часа инкубации среду заменяли для удаления вируса и опухолевые клетки инкубировали 2 дня при 37°С, 5% СО2. Затем в лунки 96-луночного планшета добавляли 300000 РВМС здоровых доноров или отдельные клетки из образцов переваренной опухоли в конечном объеме 200 мкл на лунку. Жизнеспособность опухолевых клеток (OVCAR3) оценивали с помощью анализа МТТ, а проточную цитометрию проводили на суспензионных клетках (PBMC, TIL) после 3 дней совместного культивирования.Супернатант собирали через 6 дней совместного культивирования для оценки уровней IFNγ и CCL5 с использованием набора ELISA для человеческого IFNγ (BD OptEIA, 555142) и набора ELISA MAX™ Deluxe для человеческого CCL5 (Biolegend, 440804), соответственно, в соответствии с инструкцией производителя. инструкции.

Ex vivo Культура фрагментов опухоли

Культуры фрагментов опухоли были приготовлены, как описано Voabli et al. 2021. Вкратце, замороженные фрагменты опухоли пациента медленно оттаивали при 37°C и тщательно промывали в PBS и теплой среде RPMI, содержащей L-глутамин (R8758, Sigma-Aldrich), с добавлением пенициллина/стрептомицина (100 нг/мл, Sigma-Aldrich). ), 10% FBS (Sigma-Aldrich), 1x MEM заменимых аминокислот (Gibco) и 1 мМ пирувата натрия (Sigma-Aldrich).

Отдельные опухолевые фрагменты затем помещали в общий объем 80 мкл искусственного внеклеточного матрикса в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. Внеклеточный матрикс готовили путем смешивания охлажденного льдом бикарбоната натрия (Sigma; конечная концентрация 1,1%), коллагена I (Corning; конечная концентрация 1 мг/мл) и полностью дополненного RPMI с ледяным матригелем (Matrix High Concentration, Phenol Red- Бесплатно, BD Biosciences; конечная концентрация 4 мг/мл). 40 мкл матрикса затвердевали инкубацией при 37°С в течение 20-30 мин. По одному фрагменту опухоли на лунку помещали поверх предварительно отвержденного матрикса, после чего добавляли второй слой матрикса объемом 40 мкл. Затем планшеты помещали в инкубатор при 37°С еще на 20-30 мин. 110 мкл полностью дополненного RPMI добавляли поверх матрицы. В каждую лунку, содержащую отдельные фрагменты опухоли, добавляли 1 млн БОЕ AdV5-hu-IL12 или контроль AdV5-контроль или ниволумаб (конечная концентрация 10 мкг/мл). Для каждого условия лечения использовали от 6 до 12 фрагментов. После 48 часов инкубации при 37°С фрагменты объединяли, подвергали ферментативному расщеплению и фильтровали в суспензии отдельных клеток, как описано выше.Проводили проточную цитометрию и супернатант собирали из каждой лунки для оценки уровней IFNγ и CCL5 с использованием набора ELISA для человеческого IFNγ (BD OptEIA, 555142) и набора ELISA MAX™ Deluxe для человеческого CCL5 (Biolegend, 440804), соответственно, согласно данным производителей. ‘ инструкции.

Анализ МТТ

Для оценки жизнеспособности опухолевых клеток в экспериментах по совместному культивированию использовали анализ МТТ следующим образом. Среду из лунок совместного культивирования удаляли и лунки осторожно промывали один раз PBS для удаления суспензии клеток.Затем добавляли МТТ (Sigma-Aldrich) в концентрации 500 мкг/мл и инкубировали опухолевые клетки при 37°C в течение 2–3 часов. Кристаллы формазана ресуспендировали в 90 мкл диметилсульфоксида (ДМСО; Sigma-Aldrich) и измеряли оптическую плотность при длине волны 570 нм.

Биоинформационный анализ опубликованных данных об экспрессии генов в образцах меланомы человека

Мы получили нормализованные данные об экспрессии РНК Nanostring из исследования NCT01502293 (Oncosec), в котором пациентам вводили мРНК, кодирующую IL-12, путем внутриопухолевой электропорации 16 .Сигнатуры генов для различных иммунных субпопуляций были получены из панели PanCancerImmunology Nanostring. Транскрипты в сигнатуре «Цитотоксические клетки» не могут быть отнесены к одному типу клеток и встречаются в других списках сигнатур как NK, так и CD8 Т-клеток. Поэтому его транскрипты были объединены с цитотоксическими NK-клетками и CD8-Т-клетками, что привело к сигнатурам «CD8+ Т-клетки» и «NK-клетки». Важно отметить, что ни «CD8+ T-клетки», ни «NK-клетки» не содержали транскрипт CCL5 .Последующий анализ всех данных Nanostring выполнялся с использованием R версии 4.0.2 и визуализировался в GraphPad Prism 9.

Инфильтрацию иммунных клеток оценивали путем расчета сигнатурной оценки, как описано Cursons et al. 2019. Вкратце, все транскрипты для каждого образца были упорядочены по убыванию экспрессии, а оценка подписи была определена как:

Таким образом, высокий показатель сигнатуры указывает на обогащение сигнатурных транскриптов среди генов с высокой экспрессией. Чтобы найти гены, которые коррелируют с оценкой сигнатуры NK-клеток, мы выполнили линейную регрессию для оценки сигнатуры с логарифмически преобразованным количеством транскриптов.p-значения были скорректированы методом коррекции Бенджамини-Хохберга.

Мы также повторно проанализировали данные RNAseq образцов от пациентов с опухолями, получавших антитела к PD-1 (ниволумаб) 36 . Данные были загружены из GEO под регистрационным номером GSE

. Были проанализированы только пациенты с образцами до и после лечения и оцененными ответами. Подсчеты были нормализованы по размеру библиотеки с использованием edgeR и отображены в виде логарифмических подсчетов на миллион с использованием GraphPad Prism 9. Для расчета значимости увеличения экспрессии CCL5 при лечении в CB использовались парный двухсторонний ANOVA с множественными сравнениями и апостериорный тест.Доступность данных RNAseq позволила использовать более сложные сигнатуры генов, чем с данными Nanostring, указанными выше. Поэтому мы использовали сигнатуры, описанные Tirosh et al и Cursons et al. для этого анализа 80,81 . Поскольку мы хотели сопоставить сигнатуры с экспрессией CCL5 , CCL5 был исключен из сигнатуры Т-клеток, предоставленной Tirosh et al. 2016. Оценки подписи рассчитывались, как описано выше.

Для повторного анализа исследования Zillionis et al.Набор данных scRNAseq мы загрузили предварительно очищенную матрицу подсчета из GEO под номером доступа GSE127465. Набор данных был проанализирован с использованием пакетов Bioconductor SingleCellExperiment и scatter. PCA был выполнен с использованием логарифмических подсчетов 4000 вариабельных генов. Уменьшение размерности UMAP было выполнено для значений PCA с использованием скатера runUMAP с 15 соседями. Экспрессию CCL5 на клетку визуализировали с помощью ggplot2 с использованием координат UMAP. Чтобы построить сигнатуры cNK (NK1) и trNK (NK2), мы извлекли z-показатели для генов, обогащенных в любом кластере, с помощью онлайн-инструмента исходной публикации.Затем мы выбрали гены с z-показателем> 0,5 и минимальной разницей в z-показателе между двумя подмножествами 0,5.

Мы также получили сигнатуры для тканевых резидентных NK-клеток от Marquart et al и сигнатуру для CD56 ярких CD16 отрицательных NK-клеток от Hanna et al 34,35 . Затем для каждой ячейки в наборе данных Zillionis была рассчитана оценка для каждой подписи, как указано выше. Скрипичные графики этих значений затем были построены с использованием Graphpad Prism.

Аналогичным образом мы также получили набор данных scRNAseq, описанный Sade-Feldmann et al.под регистрационным номером GEO GSE120575. Как описано в их оригинальной публикации, гены были отфильтрованы для генов, кодирующих белок, и минимальной экспрессии> 4,5 логарифмических отсчетов по крайней мере в 10 клетках. Клетки были отфильтрованы, чтобы иметь >2,5 среднего логарифмического числа перечисленных в них генов домашнего хозяйства. Клетки с высокой долей митохондриальных прочтений (> 3 стандартных отклонений; умирающие клетки) и с очень большим количеством обнаруженных генов (> 4 стандартных отклонений; дублеты) были исключены. Уменьшение размеров PCA и UMAP рассчитывали, как указано выше.Кластеризация была выполнена с использованием buildSNNGraphs пакета scran из значений PCA и k = 15. Кластер 8 состоял из NK-клеток на основании высокой экспрессии NCR1 , NCAM и FCGR3A . Для каждой клетки в этом кластере NK мы рассчитали средний балл для сигнатур cNK (NK1) и trNK (NK2), как описано выше. Затем мы суммировали среднее значение cNK и trNK для NK-клеток каждого пациента. Затем значения для отвечающих и не отвечающих пациентов визуализировались как соотношение между trNK и cNK-клетками с использованием Graphpad Prism.

Статистический анализ

Для наборов данных с нормальным распределением мы использовали двусторонний t-критерий Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ с последующим критерием множественных сравнений Холма-Сидака. Когда переменные не были нормально распределены, мы проводили непараметрические тесты Манна-Уитни или Крускала-Уоллиса. Для анализа выживаемости значения р рассчитывали с использованием критерия логарифмического ранга. Для сравнения кривых роста опухоли и сгруппированных наборов данных использовали двухфакторный дисперсионный анализ. Значения p > 0,05 считались незначимыми, значения p < 0.05 считались значительными. * значение p <0,05, ** значение p <0,01, *** значение p <0,001, **** значение p <0,0001.

(PDF) Тераностический лиганд PSMA для ПЭТ-визуализации и перенацеливания Т-клеток, экспрессирующих универсальный химерный антигенный рецептор UniCAR

Анализ уровней транскриптов в простате и других тканях.

Рак Летт. 2006; 236: 229–238. doi:10.1016/j.canlet.2005.05.021.

12. Рафф А.Б., Грей А., Каст В.М. Антиген стволовых клеток простаты:

перспективная терапевтическая и диагностическая цель.Рак Летт.

2009; 277:126–132. doi:10.1016/j.canlet.2008.08.034.

13. Росс Дж.С., Шихан С.Е., Фишер Х.А., Кауфман Р.П. младший, Каур П., Грей К.,

Уэбб И., Грей Г.С., Мошер Р. и др. Корреляция первичной опухоли

экспрессии простат-специфического мембранного антигена с рецидивом заболевания при раке предстательной железы. Клин Рак Рез. 2003; 9: 6357–6362.

14. Афшар-Оромие А., Хаберкорн У., Эдер М., Эйзенхут М.,

Зехманн CM. [68Ga] Меченый галлием лиганд PSMA в качестве превосходного индикатора

ПЭТ для диагностики рака предстательной железы: сравнение с

18F-FECH.Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2012;39:1085–1086.

doi:10.1007/s00259-012-2069-0.

15. Afshar-Oromieh A, Malcher A, Eder M, Eisenhut M,

Linhart HG, Hadaschik BA, Holland-Letz T, Giesel FL,

Kratochwil C, Haufe S, et al. ПЭТ-визуализация с [68Ga]gal-

меченым лием лигандом PSMA для диагностики рака предстательной железы:

биораспределение у людей и первая оценка опухолевых

поражений. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2013;40:486–495.

doi:10.1007/s00259-012-2298-2.

16. Kopka K, Benešová M, Bařinka C, Haberkorn U, Babich J. Glu-

Ингибиторы простатспецифического мембранного антигена на основе уреидо:

уроки, извлеченные при разработке нового класса

молекулярные тераностические радиофармпрепараты. Дж Нукл Мед.

2017;58:17С–26С. doi: 10.2967/jnumed.116.186775.

17. Куккурулло В., Ди Стасио Г.Д., Манси Л. Ядерная медицина при раке простаты

: новая эра для радиоактивных индикаторов.World J Nucl Med.

2018;17:70–78. doi:10.4103/wjnm.WJNM_54_17.

18. Eder M, Schäfer M, Bauder-Wüst U, Hull WE, Wängler C, Mier W,

Haberkorn U, Eisenhut M. Липофильность 68Ga-комплекса и свойство получения смолы ПСМА на основе мочевины ингибитор для ПЭТ-изображения.

Биоконъюг Хим. 2012; 23: 688–697. doi: 10.1021/bc200279b.

19. BenešováM,Bauder-WüstU,SchäferM,KlikaKD,MierW,

Haberkorn U, Kopka K, Eder M. Стратегии модификации линкера до

контроль простатспецифического мембранного антигена (PSMA)-нацеливание

9000 DOTA-конъюгированных ингибиторов PSMA

.J Med Chem. 2016;59:1761–1775. дои: 10.1021/acs.

jmedchem.5b01210.

20. Бенешова М., Шефер М., Баудер-Вюст У., Афшар-Оромие А.,

Кратохвиль С., Миер В., Хаберкорн У., Копка К., Эдер М.

Доклиническая оценка изготовленного на заказ ДОТА-конъюгированного ПСМА Ингибитор

с оптимизированным линкерным фрагментом для визуализации и эндора-

диотерапии рака предстательной железы. Дж Нукл Мед. 2015;56:914–920.

doi:10.2967/jnumed.114.147413.

21.Weineisen M, Schottelius M, Simecek J, Baum RP, Yildiz A, Beykan S,

Kulkarni HR, Lassmann M, Klette I, Eiber M, et al. 68Ga- и 177Lu-

с маркировкой PSMA I&T: оптимизация концепции тераностики

, нацеленной на PSMA, и первые исследования на людях, подтверждающие концепцию. Дж Нукл Мед.

2015;56:1169–1176. doi: 10.2967/jnumed.115.158550.

22. Рахбар К., Афшар-Оромие А., Джадвар Х., Ахмадзадефар Х. PSMA

тераностика: текущее состояние и будущие направления.Мол изображения.

2018;17:1536012118776068. дои: 10.1177/1536012118776068.

23. Абкен Х. Адаптивная терапия Т-клетками, перенаправляемыми CAR:

проблемы при нацеливании на солидные опухоли. Иммунотерапия.

2015;7:535–544. doi:10.2217/имт.15.15.

24. Stauss HJ, Morris EC, Abken H. Генная терапия рака с помощью

Т-клеточных рецепторов и химерных антигенных рецепторов. Curr Opin

Pharmacol. 2015; 24:113–118. doi: 10.1016/j.coph.2015.08.006.

25.Holzinger A, Barden M, Abken H. Растущий мир испытаний Т-клеток CAR

: систематический обзор. Рак Иммунол

Иммунол. 2016;65:1433–1450. doi:10.1007/s00262-016-

1895-5.

26. Cartellieri M, Bachmann M, Feldmann A, Bippes C, Stamova S,

Wehner R, Temme A, Schmitz M. Химерный антиген

Т-клетки, сконструированные рецептором, для иммунотерапии рака.

J Биомед Биотехнология. 2010 г.; 2010:956304.

27. Gargett T, Yu W, Dotti G, Yvon ES, Christo SN, Hayball JD,

Lewis ID, Brenner MK, Brown MP.GD2-специфические Т-клетки CAR

подвергаются мощной активации и делеции после встречи с антигеном

, но могут быть защищены от вызванной активацией гибели клеток с помощью блокады PD-1

. Мол Тер. 2016; 24:1135–1149. doi: 10.1038/мт.2016.63.

28. Arcangeli S, Rotiroti MC, Bardelli M, Simonelli L, Magnani CF,

Biondi A, Biagi E, Tettamanti S, Varani L. Balance of Anti-CD123

Сродство и плотность связывания химерного антигенного рецептора для

для лечения острого миелоидного лейкоза.Мол Тер.

2017;25:1933–1945. doi:10.1016/j.ymthe.2017.04.017.

29. Adusumilli PS, Cherkassky L, Villena-Vargas J, Colovos C,

Servais E, Plotkin J, Jones DR, Sadelain M. Региональная доставка

CAR T-клеточная терапия, нацеленная на мезотелин, дает мощные и

длинные -устойчивый CD4-зависимый опухолевый иммунитет. Sci Transl Med.

2014;261:261ra151. doi:10.1126/scitranslmed.3010162.

30. Кендерян С.С., Руэлла М., Шестова О., Кличинский М., Айкава В.,

Моррисетт Дж.Дж., Шоллер Дж., Сонг Д., Портер Д.Л., Кэрролл М.CD33-

специфичный химерный антигенный рецептор Т-клетки проявляют мощную доклиническую

активность против острого миелоидного лейкоза человека. Лейкемия.

2015;29:1637–1647. doi: 10.1038 / leu.2015.52.

31. Лим WA, июнь CH. Принципы инженерии иммунных клеток для лечения рака

. Клетка. 2017; 168:724–740. doi:10.1016/j.cell.2017.01.016.

32. Саделайн М. CAR-терапия: парадигма CD19. Джей Клин Инвест.

2015;125:3392–3400. дои: 10.1172/JCI80010.

33. Картельери М., Користка С., Арндт С., Фельдманн А., Стамова С., фон

Бонин М., Топфер К., Крюгер Т., Гейб М., Михалк И. и др. Новая процедура выделения и размножения ex

vivo для химерного рецептора антигена

, привитого Т-лимфоцитам человека. ПЛОС Один. 2014;9:e93745.

doi:10.1371/journal.pone.0093745.

34. Zuccolotto G, Fracasso G, Merlo A, Montagner IM, Rondina M,

Bobisse S, Figini M, Cingarlini S, Colombatti M, Zanovello P,

et al.PSMA-специфические CAR-инженерные Т-клетки уничтожают диссеминированный рак простаты в доклинических моделях. ПЛОС Один. 2014;9:

e109427. doi:10.1371/journal.pone.0109427.

35. Kloss CC, Condomines M, Cartellieri M, Bachmann M,

Sadelain M. Комбинаторное распознавание антигена со сбалансированной передачей сигналов

способствует селективной эрадикации опухоли с помощью сконструированных клеток T

. Нац биотехнолог. 2013; 31:71–75. дои: 10.1038/nbt.2459.

36. Миллер Б.С., Маус М.В.CD19-нацеленные CAR Т-клетки: новый инструмент в

борьбе со злокачественными новообразованиями В-клеток. Онкол Рес Лечить.

2015;38:683–690. дои: 10.1159/000442170.

37. Давила М.Л., Брентдженс Р.Дж. CD19-направленные Т-клетки CAR как новая

иммунотерапия рака для рецидивирующего или рефрактерного В-клеточного острого лимфобластного

лейкоза. Clin Adv Hematol Oncol. 2016; 14:802–808.

38. Чжэн П.П., Крос Дж.М., Ли Дж. Одобренная терапия Т-клетками CAR: ведерко со льдом

бросает вызов очевидным рискам безопасности и долгосрочным последствиям.Препарат

Дисков сегодня. 2018;23:1175–1182. doi:10.1016/j.drudis.2018.02.012.

39. Straathof KC, Pulè MA, Yotnda P, Dotti G, Vanin EF,

Brenner MK, Heslop HE, Spencer DM, Rooney CM. Индуцибельный переключатель безопасности каспазы 9

для Т-клеточной терапии. Кровь.

2005;105:4247–4254. doi: 10.1182 / кровь-2004-11-4564.

40. Urbanska K, Lanitis E, Poussin M, Lynn RC, Gavin BP,

Kelderman S, Yu J, Scholler N, Powell DJ Jr. Универсальная стратегия

для адоптивной иммунотерапии рака с использованием нового

Т-клеточный антигенный рецептор.Рак рез. 2012 1 апреля; 72 (7): 1844–1852.

Epub 2012 7 февраля. doi:10.1158/0008-5472.CAN-11-3890.

41. Kim MS, Ma JS, Yun H, Cao Y, Kim JY, Chi V, Wang D,

Woods A, Sherwood L, Caballero D, et al. Перенаправление генно-инженерных

CAR-T-клеток с использованием бифункциональных малых молекул.

J Am Chem Soc. 2015;137:2832–2835. doi:10.1021/jacs.5b00106.

42. Роджерс Д.Т., Мазагова М., Хэмптон Е.Н., Цао И., Рамадос Н.С.,

Харди И.Р., Шульман А., Ду Дж., Ван Ф., Сингер О. и соавт.Switch-

опосредовал активацию и перенацеливание CAR-T-клеток для злокачественных новообразований B-клеток

. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016;113:E459–68.

doi:10.1073/pnas.1524155113.

43. Koristka S, Cartellieri M, Feldmann A, Arndt C, Loff S, Michalk I,

Aliperta R, von Bonin M, Bornhäuser M, Ehninger A, et al. Гибкое

антиген-специфическое перенаправление регуляторных Т-клеток человека с помощью новой универсальной системы

химерных антигенных рецепторов. Кровь.2014;124:3494.

44. Cartellieri M, Feldmann A, Koristka S, Arndt C, Loff S,

Ehninger A, von Bonin M, Bejestani EP, Ehninger G,

e1659095-14 C.ARNDTETAL.

bet365 Форма лошади | Рейскард 14:20 Лестер | 12 января 2022 г.

Only Money (2/1), Naizagai (5/2), Dreamsundermyfeet (3/1), Shanacoole Prince (4/1), Marajman (25/1)

Вердикт

Only Money нужно освежить свои прыжки, но он потерял пару фунтов после того, как стал вторым в небольшой гонке в Ньюбери, а победитель Хантингдона Dreamsundermyfeet не смог справиться с подъемом на 6 фунтов в Саутуэлле.Пятилетний NAIZAGAI (NAP) почти вдвое превысил отметку на фунт выше, и, возможно, это произошло из-за удачи, поэтому он получает кивок вместе с Shanacoole Prince и Marajman , которые лучше всего просматриваются в настоящее время.

Формоч

Only Money (IRE) 5-2 (11-0) Ведущий, прошел с 5-го по 8-е, попал в следующий, возглавил до 4-го, проиграл 2-й 4-й, проехал после следующего, пошел вторым снова 2-й, остался на том же темп, без шансов с победителем, 2-е место из 4, 7 1/2 л позади Дукарова (11-2) в Ньюбери 2 м hcp (3) gs в декабре.

Мараджман (Франция) 50-1 (11-7) Задержался, проехал и опередил до 3 аутов, подъехал на Маркет Расен 2 м 5f hcp (3) sft в декабре

Dreamsundermyfeet (IRE) 2-1fav (11-12) Прижатый лидер, ведущий после 2-го, ничья 6-го, узкое преимущество 4 аута, пройденный перед 3-м аутом, ослабленный перед последним, 3-й из 7, 8 1/2l позади Ahead Of The Field (11-12) в Southwell 2m 4f hcp (4) gs в декабре.

Найзагай 7-1 (10-9) Преследовали лидеров, ошибка 5-я, ехала вперед и опережала 4-ю после 3-х аутов, 4-е из 11, 21 л позади Brave Seasca (11-13) в Warwick 2m hcp (4) sft в декабре

г.

Shanacoole Prince (IRE) 40-1 (12-0) Полузащита снаружи, потерял позицию 3-й, проехал после 4-го, сзади при ошибке 5-й, потерял касание 3-й, вскоре отошел, 17-й из 18, дальний позади Оркана (11-2) в Warwick 2m hcp (4) hvy в феврале.

Знакомство с мотоциклетным туром по Эквадору с гидом

День 9

Куэнка – Алауси – Вулкан Чимборасо – Баньос

419 км/ 260 миль

Это длинный день катания, поэтому мы встаем рано утром и отправляемся в путь после отличного завтрака «шведский стол». Мы едем по Панамериканскому шоссе на север, сначала проезжая через густые сосновые и эвкалиптовые леса.Запах этих лесов останется с вами надолго после поездки. Мы продолжаем движение по этим горным дорогам, проезжая через высокогорные парамо и пересекая холодные высокогорные перевалы на высоте 11 000+ футов. После некоторых захватывающих дух видов мы поворачиваем направо на дорогу, которая ведет нас через живописные сельскохозяйственные угодья. Когда-то он был частью тропы инков во время правления империи инков. Люди, живущие вдоль этой дороги, до сих пор используют многовековые методы ведения сельского хозяйства. Это путешествие по прошлому.

Дорога ведет к самым обширным руинам инков в Эквадоре — Ингапирке. Иначе известный как «Макчу-Пикчу» в Эквадоре, вы можете посетить руины этого солнечного храма инков и поразиться их передовым методам орошения.

Затем мы прибываем в андский город Алауси, который известен своим теплым и гостеприимным коренным населением, которое носит яркую одежду. В городе есть очень активный рынок и несколько отличных ресторанов, где подают свежую форель, местные продукты и другие местные деликатесы.Алауси — подходящее место для обеда.

С постоянными ледниками на пике Чимборасо является самой высокой точкой Эквадора и самой высокой точкой на Земле. Этот относительно неизвестный фактор связан с тем, что Земля выпячивается на экваторе, а пик Чимборасо является самым дальним участком земли от ядра Земли. Это просто еще один способ сказать, что это буквально самое близкое к Небесам место на Земле.

Дорога, по которой мы едем, пересекает национальный заповедник дикой природы Чимборасо, где обитают тысячи диких викуний, меньших, легких и быстрых родственников ламы и верблюда.В Эквадоре находится одна из наиболее охраняемых популяций викуньи в мире, и мы обязательно увидим этих величественных существ, когда будем кружить вокруг гигантской горы. Мы достигнем высоты более 14 500 футов (4 500 метров), и здесь погода непредсказуема. Будьте готовы к яркому солнцу, ледяному дождю, граду или даже снегу!

В этой области вы почувствуете себя на другой планете.

Мы едем по окраине Амбато, четвертого по величине города Эквадора. Мы пройдем через пышные сельскохозяйственные угодья и долины, спустившись на высоту 5000 футов, чтобы прибыть в Баньос.

Баньос – Мекка приключенческого туризма, известная своими целебными термальными источниками. Город расположен в тени могучего вулкана Тунгурауа, очень активного вулкана, который время от времени извергается с пирокластическими выбросами и густым пеплом. Банос расположен в так называемом «магнитном вихре», уникальном месте, где находятся четыре основных элемента жизни планеты — Воздух, Земля, Вода и Огонь.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.