Е1 манипуляторы: Пожарные рассказали, почему не могли потушить манипулятор в Екатеринбурге на улице Челюскинцев 25 июля 2019 года | e1.ru

>

Мустафа Найем уральского розлива

Одним из главных инструментов мобилизации протеста являются СМИ. На украинском майдане в 2013-14 гг СМИ и журналисты сыграли ключевую роль. Именно под этим углом стоит разобрать, почему протест в Екатеринбурге против строительства православного храма на митинге 7 апреля 2019 года возглавил известный в городе журналист, главный редактор СМИ Е1 Ринат Низамов. 

Низамов выступил как оратор, как организатор, с его подачи толпа скандировала «Скверу быть». По окончании акции он выложил в сеть своё политическое заявление по поводу своей роли в акции.

Протест против храма и майдан имеют одну и ту же природу: объект любой протестной технологии это всегда — люди. Для технологов протеста повод найдётся. В Екатеринбурге таким поводом стало строительство храма Святой Екатерины.

Общественным движением, которое выступило фактическим организатором акции 7 апреля против храма, стал «Фонд Навального».

Он взял на себя всю работу по рекламе акции в социальных сетях, печати и распространению листовок, работе с волонтерами. Навальный лично утрудился призвать своих сторонником идти на митинг: «В Екатеринбурге всё уже вышло за формат обычного противостояния, теперь это противостояние мракобесия и нормальных людей». Сейчас региональные отделения Навального испытывают дефицит денежных средств, отделения по всей стране сокращаются и закрываются. Так что акция в Екатеринбурге была в том числе проверкой боеспособности екатеринбургского отделения штаба Навального — сколько людей они могут вывести на протестную акцию, как грамотно работают, используя азбуку протестных технологий (чистая азбука — вывод в феврале 2019 года против храма людей с дуршлагами на голове, как на заре киевского майдана).

Но если со штабом Навального всё понятно, то как быть с главредом Е1? До 7 апреля возглавляемое им СМИ просто выступало как информационный спонсор акций протеста против храма (в частности, давая негативные сюжеты об общегородском молебне, посвященном торжеству православия и поддерживая концерт против строительства храма в «Ельцин-центре»):
https://www. e1.ru/news/spool/news_id-66019075.html 
https://www.e1.ru/news/spool/news_id-66019075-section_id-198.html 

https://www.e1.ru/news/spool/news_id-66019297.html 

Накануне митинга 7 апреля через Е1 шла основная информационная подготовка акции. Публиковались воззвания, угрозы гражданской войны и прочие атрибуты «кошмаривания» общественного мнения. То же публиковал и сам Низамов: «На мой взгляд, Екатеринбург в ближайшие месяцы станет горячей протестной точкой на карте России, потушить которую местными силами будет непросто. Это уже не веселые обнимашки и не срач в онлайне. Это идейная война, которая вот-вот перерастёт в вооруженный конфликт».

С 7 апреля Низамов стал одним из лидеров протеста, став его трибуном. Почему он пошёл на столь явный имиджевый риск? 

 

Сайт Е1 является частью структуры издательства с американским капиталом Hearst Shkulev Media. Любопытно, что до 2017 года Низамов не заботился о том, чтобы у Е1 была лицензия СМИ, несмотря на то, что он уже вошел в «региональную сеть» холдинга как Hearst Shkulev Digital.

Ural. Так делается, чтобы снять с издания ответственность перед Роскомнадзором, у которого есть инструмент вынесения двух предупреждений и затем закрытия СМИ, и заставить государство возиться в судах. Между прочим, это означает, что журналисты издания не могли быть аккредитованы в государственных органах власти, иметь доступ на пресс-конференции и к руководству государственных структур. Но они имели такой доступ. Более того Ринат Низамов входил в общественные советы ряда ведомств, используя свои личные связи, талант коммуникатора и личное обаяние. Публичную аккредитацию получил от УФСБ по Свердловской области: фото с ним и только с ним регулярно публиковала у себя в ФБ пресс-секретарь управления подполковник Анна Ластовецкая (сейчас её перевели в отдел кадров УФСБ). На тот момент Е1 было просто ООО «Херст Шкулев медиа». Глядя на такую «аккредитацию», другие ведомства тоже охотно сотрудничали с Е1: ГИБДД, полиция, СК, прокуратура, МЧС, и т.д. Никто из пресс-секретарей не мог объяснить, на каком основании они сотрудничают с коммерческой организацией.
Низамов стал даже членом Общественного совета в УФСИН по Свердловской области.

Не только это является отличительной особенностью Е1. Важно понимать, что подавляющая часть СМИ холдинга Hearst Shkulev Media это неполитические СМИ, гламурной и поп-культурной направленности, известные «женские» и «мужские» журналы. И совладельцы Hearst Corporation в США, и совладелец российского холдинга Виктор Шкулёв рассматривают издательский бизнес как бизнес и ничего большего. В отношении своего украинского филиала Виктор Шкулёв рассматривал в 2016 году вопрос о его закрытии после событий на майдане. Если вы изучите портфолио главы украинской дочки холдинга Сергея Мирошниченко — это бизнесмен максимально закрытый и не высказывающийся публично на политические темы, что, согласитесь, весьма непросто на Украине.

В 2012 году Виктор Шкулёв стал агрегатором сети российских региональных СМИ (так туда и попал Е1) Regional Network по просьбе тогда ещё главного политического администратора в АП Вячеслава Володина. Это было сделано как реакция федеральной власти на «Болотную» и на роль прессы в регионах. Шкулёв фактически выступил доверенным лицом со стороны медиабизнеса в интересах государственной информационной политики. Сеть городских порталов Hearst Shkulev Digital сегодня это 43 городских сайта, редакции в 15 городах – ngs.ru, 74.ru, nn.ru и другие городские медиабренды.

Поэтому неверно упрощать ситуацию вокруг Е1 как влияние западных разведок через подконтрольное издательство. Такого влияния нет, в том числе из-за позиции Виктора Шкулёва. И совершенно очевидно, что геройство Рината Низамова в протестной акции — это его личная инициатива и личная ответственность. Вот только сомнительно, что эта инициатива кристально чиста от политики. Куда более очевидно, что она мотивирована извне. Корни этой мотивации даже особо искать не нужно. В 2015 году Низамов посетил Киев и сделал в своем ФБ БОЛЕЕ 50 фотографий с того, что осталось от майдана. Вот такого плана. 

 

Нужно быть сильно мотивированным человеком, чтобы публиковать ареопаг «небесной сотни», когда на Донбассе шла война.

Если западные разведки не могут работать непосредственно через издательства, это не значит, что они не могут работать напрямую с руководителями отдельных СМИ. При этом причастность СМИ к американскому капиталу облегчает их сотрудникам коммуникации с США. Причастность Низамова к американского медиахолдингу является ответом на вопрос, почему он часто ездит в США и на Украину: по делу. Но это не вся правда.

С момента внесения в 2017 году СМИ с иностранным финансированием в список иноагентов (согласно ФЗ 121 «Об иностранных агентах») российское государство провело черту между «независимой» прессой и прессой как инструментом внешнего влияния.

Как и в случае с неправительственными организациями, закон «Об иноагентах» сильно осложнил работу большим и малым политическим организациям соросовского плана в России, но и изменил подходы. 

Западные фонды теперь работают с лидерами общественного мнения напрямую. Де-факто, активировав свою агентурную сеть в виде не организаций, а частных лиц. Выбираются те активисты и ЛОМы, которые обладают социальным статусом и инструментами, необходимыми для мобилизации граждан на протест. Это особенно важо сегодня, когда все прежние госдеповские «мурзилки» типа Чириковой и Пономарёва пришли в утиль.

 

Низамов, участвуя в деятельности холдинга Шкулёва, конечно, торгует лицом и влиянием, претендуя на лидирующие позиции внутри холдинга: «В нашей группе — самые большие интернет-площадки крупнейших городов страны. От Красноярска до Архангельска — 16 команд, 16 сайтов, на которых живут города… …редакции работают в три смены — 24 часа в сутки, как мы помогаем находить пропавших людей, пишем о городских проблемах, независимо от позиции власти».

Низамов, безусловно, является тем лидером общественного мнения в Екатеринбурге, который даже в силу личной вовлеченности в протестное сообщество способен организовать протестную акцию только на личных связях. Что собственно и показал митинг 7 апреля.

На этом видео главные лица протеста — ближайшее окружение Низамова. Включая несущих какой-то межгалактический бред про президента и китайцев, мешая работе прессы.

В коллекции Рината Низамова много иллюстраций, свидетельствующих о его открытом позиционировании: фото в Госдепартаменте США, где он был несколько раз. И как журналист, и как друг американского консула в Екатеринбурге. 

Именно друзья, коллеги и единомышленники Низамова приняли активное участие в протесте против храма, маркировав его яркими визуальными образами. 

 

«Пастафарианец» Ярослав Ширшиков с майданным дуршлагом на голове, участник акции «макаронный молебен» против храма, друг Низамова.

 

Виктор Норкин, представитель «Открытой России» Ходорковского в Екатеринбурге. Носит подрясник, который у него остался после дембеля из духовной семинарии. Бесы не пустили Норкина в служение, зато теперь он протестует против храма.

Федор Крашенинников, оппозиционный екатеринбургский политолог, друг Низамова.

 

Строительство храма, как и другие поводы — лишь часть технологии консолидации масс и их манипуляции. Майдан на Украине начался с мобилизации протестной группы «Автомайдан» на почве изнасилования и убийства 15-летней девушки во Врадиевке Николаевской области. К местным жителям, выразившим естественное человеческое негодование преступниками, присоединились активисты «Автомайдана», распространили гнев на органы внутренних дел как часть власти Януковича, тем самым мобилизовав в свои ряды тысячи своих сторонников, которые потом оказались на майдане. 

Ответ на вопрос, почему Ринат Низамов рискнул своим имиджем, простой: он включился в проект протестного движения в Екатеринбурге как человек, способный замкнуть на себя роль организатора. Вопрос в только в том, кто будет главным заинтересантом этой роли. Уж точно не издательство Шкулёва. 

Екатеринбург | У Макаровского моста загорелся кран-манипулятор, который задел провода ЛЭП. Есть погибший

Тело мужчины не могут извлечь из автомобиля На месте работают пожарные и машина реанимации 

В Екатеринбурге на улице Челюскинцев, у Макаровского моста, стрела манипулятора задела провода линии электропередачи, в результате произошло возгорание. Как сообщают Е1.RU очевидцы, загорелась кабина автомобиля.

По словам источника Е1.RU в правоохранительных органах, в результате аварии погиб человек. В настоящее время его пытаются достать из машины. Вероятно, речь идет о водителе манипулятора. 

В пресс-службе ГУ МЧС по Свердловской области пообещали предоставить комментарий позже.

Если вы стали свидетелем произошедшего, знаете, что случилось, сообщите нам на почту [email protected] или по телефону +7 (343) 34-555-34 . Также можно воспользоваться WhatsApp, Viber и Telegram — их номер +7 909 704 57 70 .

Текст: Ирина ВАРКЕНТИН
Фото: читатель Е1.RU

Есть погибший»>Ещё новости о событии:

Перекрытие улицы Серафимы Дерябиной и инцидент с краном-манипулятором в Екатеринбурге: дайджест новостей

  Оксана Жилина Улицу Серафимы Дерябиной от Зоологической до кольца на Объездной дороге перекрыли в обе стороны.
17:23 25.07.2019 Областная Газета — Екатеринбург

Прокуратура проводит проверку соблюдения техники безопасности в связи с гибелью водителя в результате возгорания манипулятора у Макаровского моста

Прокуратура Железнодорожного района г.Екатеринбурга организовала проверку исполнения требований безопасности и охраны труда в связи с несчастным случаем на производстве,
17:00 25.07.2019 Прокуратура — Екатеринбург

Прокуратура начала проверку после гибели рабочего на Макаровском мосту

В Екатеринбурге сотрудники прокуратуры начали проверку после гибели рабочего на Макаровском мосту.
16:53 25.07.2019 Екатеринбург в эфире — Екатеринбург

Прокуратура озаботилась безопасностью на стройке Макаровского моста

После гибели рабочего. После трагедии на стройплощадке Макаровского моста в Екатеринбурге прокуратура организовала проверку соблюдения на объекте техники безопасности и охраны труда.
16:52 25.07.2019 УралИнформБюро — Екатеринбург

В Екатеринбурге проводится проверка после гибели водителя при возгорании манипулятора

  Нина Георгиева В Екатеринбурге проводится проверка после гибели водителя при возгорании манипулятора.
15:02 25.07.2019 Областная Газета — Екатеринбург

Прокуратура проводит проверку техники безопасности на стройплощадке Макаровского моста

Утром там погиб рабочий.   Прокуратура Железнодорожного района проводит проверку на стройплощадке Макаровского моста в Екатеринбурге.
14:20 25.07.2019 JustMedia — Екатеринбург

При строительстве Макаровского моста погиб водитель манипулятора

фото: Дмитрий Егоркин ЕКАТЕРИНБУРГ. Прокуратура Железнодорожного района Екатеринбурга организовала проверку исполнения требований безопасности и охраны труда в связи с несчастным случаем на производстве,
14:20 25.07.2019 АПИ — Екатеринбург

В Екатеринбурге погиб водитель манипулятора, который работал у Макаровского моста

Машина своей стрелой задела высоковольтную линию электропередач и загорелась.
14:02 25. 07.2019 Эхо Москвы Екатеринбург — Екатеринбург

Прокуратура по факту гибели водителя манипулятора в Екатеринбурге организовала проверку

ЧП произошло сегодня на стройплощадке Макаровского моста, — рассказала старший помощник прокурора Свердловской области Марина Канатова Слушать Водитель получил удар током и сразу же погиб, рассказал порталу Е1 сотрудник МЧС.
14:02 25.07.2019 Эхо Москвы Екатеринбург — Екатеринбург

В Екатеринбурге возле Макаровского моста погиб водитель манипулятора

Сегодня утром в Екатеринбурге манипулятор зацепился стрелой за линию электропередач возле Макаровского моста.
13:32 25.07.2019 ОТВ — Екатеринбург

В Екатеринбурге полыхал кран-манипулятор, задевший ЛЭП

  Нина Георгиева В Екатеринбурге полыхал кран-манипулятор, задевший ЛЭП.
12:41 25.07.2019 Областная Газета — Екатеринбург

В ходе реконструкции моста в центре Екатеринбурга погиб рабочий

В Екатеринбурге на площадке реконструкции Макаровского моста погиб рабочий.
12:21 25.07.2019 EaNews.Ru — Екатеринбург

Пожар у Макаровского моста унёс жизнь рабочего

25 июля в утреннее время суток в Екатеринбурге около Макаровского моста произошёл пожар, который унёс жизнь рабочего.
12:12 25.07.2019 Екатеринбург в эфире — Екатеринбург

На стройплощадке возле закрытого на реконструкцию Макаровского моста в ЧП погиб оператор манипулятора

Как уточнила пресс-секретарь МЧС по Свердловской области Наталья Зырянова, возгорание произошло из-за того, что автомобильный манипулятор при производстве работ задел своей стрелой высоковольтную линию электропередач.
11:33 25.07.2019 Эхо Москвы Екатеринбург — Екатеринбург

В Екатеринбурге на стройплощадке Макаровского моста сгорел рабочий

Фото: instagram.com/ekb_chp Кран задел провода. Утром 25 июля в Екатеринбурге на строительной площадке Макаровского моста погиб рабочий.
11:22 25.07.2019 УралИнформБюро — Екатеринбург

У Макаровского моста загорелся кран-манипулятор, который задел провода ЛЭП. Есть погибший

Тело мужчины не могут извлечь из автомобиля На месте работают пожарные и машина реанимации  В Екатеринбурге на улице Челюскинцев, у Макаровского моста, стрела манипулятора задела провода линии электропередачи,
10:22 25.07.2019 e1.Ru — Екатеринбург

Ошибка Е1 в стиральной машине Korting.

Расшифровка

Стиральные машины марки Korting все чаще встречаются в наших домах. На сегодняшний день эта компания — одна из наиболее стремительно набирающих популярность. Западные пользователи уже давно оценили качество и функциональность техники данной марки. Стиральные машины «Кортинг» оборудованы надежным электронным управлением, позволяющим грамотно выполнять программу, а также сообщать пользователю при возникновении каких-то неполадок. Если вдруг машинка по какой-то причине не может отработать какой-либо из этапов стирки, то она выдаст на дисплей ошибку с кодом, соответствующим неисправности. В данной статье как раз и пойдет речь об одной из таких ошибок.

Ошибка е1

Ошибка с этим кодом указывает на отсутствие воды внутри системы. Данное явление может быть вызвано как неисправностью деталей самой стиральной машины так и внешними факторами. Данный код загорается обычно практически сразу после начала выполнения программы. Алгоритм стиральной машины построен таким образом, что при запуске устройство сначала блокирует люк, затем проверяет нет ли воды в баке (иногда включает сливной насос), а затем открывает клапан подачи воды. Вода в устройство поступает без помощи вспомогательных насосов, просто под давлением в системе водопровода. Если в течении отведенного времени датчик уровня воды не зафиксирует наличие воды, то процесс выполнения программы прервется и появится соответствующая ошибка. Причин у данной ошибки может быть несколько и их мы рассмотрим в данной статье.

Засорился фильтр или нет подачи воды

На входе подачи воды в бак установлена специальная сеточка — фильтр грубой очистки воды от крупного мусора. Также иногда пользователи устанавливают дополнительный солевой фильтр, который также имеет сетку на входе. Поэтому при появлении данной ошибки первым делом стоит проверить доходит ли вообще вода до устройства. Проверить не перекрыт ли вентиль, затем открутить подводящий шланг и прочистить сетку-фильтр. Если все эти манипуляции не дали результата, а именно: вода есть, фильтры чистые, а в машинку вода не поступает, то необходимо обратиться к специалисту за помощью.

Аквастоп

В большинстве современных стиральных машинах установлена система защиты от протечек — аквастоп (название функции может отличаться в зависимости от модели). Данная система предназначена, для того чтобы перекрыть воду в случае возникновения протечки. При сработке клапана аквастопа на дисплее появится соответствующий код. Но это не будет Е1, а будет конкретно ошибка протечки. Но вот если в клапане аквастоп произошла поломка и он не открывается, то блок управления это может не зафиксировать, а выдаст ошибку об отсутствии подачи воды. В данной ситуации придется заменить неисправный клапан на новый.

Заливной клапан

На входе подачи воды в стиральной машине установлен специальный клапан. Если по какой-либо причине клапан не открывается, то также появится ошибка Е1. Причин неработающего клапана может быть несколько. Первое что может выйти из строя — это сам клапан, перегорела катушка или еще что-либо. Также бывает, что окисленные контакты проводки не пропускают достаточный ток для активации запорного электромагнитного механизма. Также известковый налет от некачественной воды может заклинить подвижные части этого элемента. В случае с контактами и засором необходимо произвести просто чистку (контактов от ржавчины и окислений, клапан от мусора и налета). При выходе из строя самого клапана потребуется его замена.

Датчик уровня воды

Датчик уровня воды или прессостат находится в баке устройства и фиксирует уровень воды. Довольно распространенной проблемой данного элемента является засор поплавковой камеры. Мусор, который попадает в эту трубку, может зафиксировать поплавок в положении «пустой бак». При этом воды наберется больше положенного уровня и возможен даже перелив.

Следующее что ломается в данном элементе — это электронная часть. В некоторых устройствах прессостат электромеханический и замена его обойдется пользователю в приемлемые деньги. А вот если на машине установлен цифровой датчик уровня, то стоимость его может быть довольно велика и многие пользователи отказываются от ремонта в пользу приобретения нового устройства.

Модуль управления

Некорректная работа, программный сбой, выгоревшие элементы на плате — все это может стать причиной появления как данной ошибки, так и любой другой. Вся информация, отображаемая на дисплее устройства, выводится модулем управления. Соответственно если в нем происходит сбой то возможно появление либо некорректных ошибок, либо неверной работы механизмов системы. Из-за неработающего модуля клапан подачи воды может не открыться, информация с прессостата может неверно прочитаться и так далее.

Для ремонта данного элемента потребуется обратиться в сервисный центр. Желательно, чтобы он был аккредитован производителем, так как электронный контроллер — это самый дорогостоящий элемент в системе машины. Если его повредить или неправильно отремонтировать, то он в будущем доставит массу неудобств, вплоть до полного выхода из строя.

Новые стиральные машины Korting

Торговая марка Korting отличается особым подходом к разработке бытовой техники. Данный бренд уже много десятилетий популярен в Европе и постепенно находит поклонников в нашей стране. При создании стиральных машин применяются передовые немецкие технологии и качественные комплектующие. Это позволяет значительно увеличить срок службы устройств и увеличить их отказоустойчивость.

Модели от «Кортинг» можно разделить на встраиваемые и отдельностоящие. Оба этих типа устройств имеют свои плюсы и минусы. Сольные модели можно устанавливать в любых помещениях и (при необходимости) перевозить в другие помещения. Такие стиральные машины легче обслуживать и ремонтировать. Встраиваемые же модели можно устанавливать в кухонные гарнитуры, мебель ванной или прачечной комнаты. Использование таких решений позволяет сохранить целостность интерьера и уменьшить шум, вырабатываемый техникой.

Также стиральные машины Korting делятся на фронтальные и вертикальные. Особенностью вертикальных устройств является верхняя крышка, через которую белье попадает в бак. Также вертикальные машины занимают меньше места и могут устанавливаться даже в небольшие помещения. Фронтальные машины имеют люк в передней части устройства и требуют дополнительного места для эксплуатации. В каталоге нашего фирменного интернет-магазина можно найти как простые модели, так и стиральные машины, оборудованные функцией сушки. Вам больше не потребуется досушивать одежду на специальных вешалках. Вся ваша одежда будет высушена автоматически, при этом сохранит все свои свойства.

Другая бытовая техника

Но торговая марка «Кортинг» славится не только своими стиральными машинами. В каталоге нашего магазина вы сможете найти варочные панели и духовые шкафы, при помощи которых можно реализовать любые кулинарные фантазии. Микроволновые печи позволят быстро разогреть еду, а мощные вытяжки — удалят остатки горячего воздуха. Для хранения продуктов можно использовать холодильники и морозильные камеры, который потребляют значительно меньше электроэнергии. Во многих моделях применяется уникальная технология NoFrost, позволяющая нагнетать в камеры холодный воздух. Такие устройства не нужно размораживать.

Отдельно стоит поговорить о посудомоечных машинах, которые изготавливаются во встраиваемом, отдельностоящем и даже настольном вариантах. Посудомоечные машины Korting изготавливаются с применением передовых технологий, оснащены электронной платой управления и аквасенсором, который помогает корректировать работу устройства.

Покупайте в фирменном магазине!

Отличительной особенностью нашего фирменного магазина является возможность получить на 100% оригинальный продукт, на который распространяется гарантия от производителя в 12 месяцев. В каталоге реализован удобный фильтр, при помощи которого вы можете отсеивать ненужные модели бытовой техники и выбирать нужные. Вы можете посетить наши фирменные салоны в Москве и Санкт-Петербурге, либо же оформить доставку в любой регион России.

Ostberg RKB 400×200 E1 вентилятор . Доставка по Украине, монтаж оборудования

ПРЯМОУГОЛЬНЫЕ КАНАЛЬНЫЕ ВЕНТИЛЯТОРЫ OSTBERG СЕРИИ RKB

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ

Представленные вентиляторы серии RKB от известного бренда-производителя Ostberg предназначены для монтирования в прямоугольных каналах в всевозможном положении.

КОНСТРУКЦИЯ

Асинхронные двигатели с наружным ротором и утолщенные подшипники, которыми оснащены вентиляторы серии RKB, значительно увеличивают срок службы агрегата. Корпус вентиляционной системы изготовлен из антикоррозийной стали.

РЕГУЛИРОВАНИЕ СКОРОСТИ

Изменения скоростей функционирования устройств серии RKB возможны в пределах от минимального значения (нуля) до максимальновозможного (100%), что достигается регилировкой напряжения оборудования, благодаря использованию тиристора с плавной регулировкой или пятиступенчатого трансформатора. Комплектуются дополнительно по желанию клиента.

ЭЛЕКТРОДВИГАТЕЛЬ

Термоконтакты двигателя предохраняют его от поломок. Однофазные агрегаты содержат вмонтированный термоконтакт, способный перезагружаться автоматически. В наличии трехфазных двигателях – два подсоеденительных вывода вмонтированного термоконтакта. 

ОБСЛУЖИВАНИЕ

Дополнительного обслуживания вентиляционные агрегаты не требуют. Единственные манипуляции, которые следует проводить не реже, чем раз в полгода – осмотр и очистка. Данная процедура не сложная, благодаря наличию откидывающейся пластины, которая открывает полный доступ к двигателю и рабочему колесу, делая осмотр максимально простым и удобным, и значительно облегчает процесс чистки деталей вентиляционной системы.

Заказать прямоугольный канальный вентилятор Ostberg RKB 400×200 E1с доставкой вы можете в нашем Интернет-магазине Ventbazar, а если у вас возникли вопросы по условиям покупки и доставки товаров, интересует цена или вы хотите уточнить комплектацию оборудования и технические особенности, звоните нам по телефону: (044) 50 000 53.

Технологическая карта на погрузочно-разгрузочные работы с использованием кранов-манипуляторов на базе автомобиля УНИМОГ-1450

Технологическая карта на погрузочно-разгрузочные работы с использованием кранов-манипуляторов на базе автомобиля УНИМОГ-1450

Скачать PDF

Документ: 67-04 ТК
Название:Технологическая карта на погрузочно-разгрузочные работы с использованием кранов-манипуляторов на базе автомобиля УНИМОГ-1450
Начало действия:2004-02-27
Дата последнего изменения:2005-05-25
Область применения:В технологической карте приведены общие указания по производству работ кранами-манипуляторами, технология выполнения погрузочно-разгрузочных работ, технологическая оснастка и схемы строповки, а также даны требования по безопасности и охране труда, экологической и пожарной безопасности при производстве работ. Технологическая карта предназначена для производителей работ, мастеров и бригадиров, а также инженерно-технических работников строительных и проектно-технологических организаций.
Разработчики документа: ОАО ПКТИпромстрой(108),

Постраничный просмотр! Все страницы Отдельные страницы: << 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23
а 4 разряда      - 1 чел.

стропальщиков 2 разряда                                                       — 2 чел.

PN0000059′>5.2 Нормы времени на выполнение погрузочно-разгрузочных работ кранами-манипуляторами на 100 тонн грузов согласно Е1-5 приведены в таблице 6.

сборник Е1 - внутрипостроечные транспортные работы)

TO0000007′>

Общая масса поднимаемого груза, т, до

Нормы времени

машиниста, чел. -ч.

стропальщика, чел.-ч.

работы машины, маш.-ч.

Разные грузы (материалы) штучные, в пакетах, контейнерах или на поддонах

0,5

11,0

22

(11,0)

1,0

6,1

12,2

(6,0)

1,5

4,4

8,8

(4,4)

2. 0

3,6

7,2

(3,6)

3,0

2,7

5,4

(2,7)

4,0

2,3

4,6

(2,3)

5,0

2,1

4,2

(2,1)

PN0000061′>1 СНиП 12-03-2001 «Безопасность труда в строительстве. Часть 1. Общие требования».

PN0000062′>2 СНиП 12-04-2002 «Безопасность труда в строительстве. Часть 2. Строительное производство».

PN0000063′>3 СНиП 23-05-95 «Естественное и искусственное освещение».

PN0000064′>4 ГОСТ 12.0.004-90 «ССБТ. Организация обучения безопасности труда. Общие положения».

PN0000065′>5 ГОСТ 12.1.004-91* «ССБТ. Пожарная безопасность. Общие требования».

PN0000066′>6 ГОСТ 12.1.046-85 «ССБТ. Строительство. Нормы освещения строительных площадок».

PN0000067′>7 ГОСТ 12.3.009-76* «ССБТ. Работы погрузочно-разгрузочные. Общие требования безопасности».

P


Все страницы Постраничный просмотр:
<< 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23

Владимир Шахрин — о битве за сквер: Екатеринбуржцы стали жертвой манипуляторов

Лидер группы «Чайф» Владимир Шахрин по просьбе Е1. RU прокомментировал конфликт между противниками и сторонниками строительства храма Святой Екатерины в сквере у Театра драмы. Е1.RU приводит высказывание известного музыканта целиком.

«Казалось бы, всё хорошо, активное гражданское общество, люди отстаивают своё мнение, но вот что меня смущает. Храмы в городе строили всегда, и в далёком, и в недалёком прошлом, но активное противостояние получилось только нынче. Значит, появились некие силы, кому это понадобилось именно сейчас. Я по своей артистической работе имею некоторый опыт манипуляции общественным сознанием. Любой концерт или спектакль — так или иначе манипуляция. В данной ситуации с противостоянием строительству храма Святой Екатерины я вижу явные признаки именно таких манипуляций массами. Я не возьмусь утверждать, кто заказчик этих манипуляций и какова конечная цель, это не моей компетенции задача, но чьими руками это делается, вполне очевидно», — считает музыкант.

По его мнению, у этой истории множество бенефициаров: профессиональные политтехнологи, люди с политическими амбициями, жаждущие славы блогеры, артисты, музыканты и прочие публичные личности. «Конечно, есть ещё небольшая группа „профессиональных оппозиционеров“, которые, как та Баба-яга, всегда против. Но это уже почти диагноз, они бескорыстны, они просто так живут — в вечном протесте», — считает Шахрин.

Он пытается опровергнуть один из основных аргументов защитников сквера — то, что «храмов много, и они стоят пустые».

«Ребята, в музеях и театрах тоже не всегда есть народ, только во время хороших спектаклей и экспозиций, и это не повод перестать их финансировать и строить новые. — Полагает лидер группы „Чайф“. — Тут главное — не затоптать толпой желание делать что-то полезное для города и уже сделанные дела тех людей, кто действительно что-то делает. Делает своими руками и на свои деньги. Я бы поддержал противников застройки, если бы на этом месте собрались строить экологически опасное производство. Я призываю быть объективными в реальных оценках городской жизни. Нам необходимо наше городское мирное гражданское общество».

«Искренне желаю вам встать в список богатых и успешных, ну или хотя бы добрых, любящих жизнь и людей, умеющих по любому вопросу иметь собственное мнение. Второе гораздо реалистичнее, хотя и тоже непросто», — заключает Владимир Шахрин.

Панкреатическая эластаза в кале

Регистратура

Внимание!
Просим уточнять время приёма конкретного анализа и график работы врачей в графе: «Как сдавать» и в «Расписании приёма врачей»
Для Вашего удобства введены дополнительные телефоны:
  • 8(495) 380-20-19
  • 8(495) 459-17-18
  • 8-905-546-59-33
  • 8-905-546-59-35
  • 8-905-546-59-51

К оплате принимаются наличные и карты.

Панкреатическая эластаза в кале

КДЦ МНИИЭМ им.Г.Н.Габричевского » Гормональные исследования » Панкреатическая эластаза в кале
ИсследованиеЦена(первый/повторный)Как сдавать
Панкреатическая эластаза(копрологический тест, ИФА) 2205-00


Панкреатическая эластаза 1 в кале (Е1)
Панкреатическая эластаза 1- протеолитический фермент системы пищеварения, продуцируемый исключительно ПЖ. Эластаза расщепляет внутренние связи белка (нейтральные аминокислоты). Она присутствует в человеческом панкреатическом соке и кале. Фермент не подвергается воздействию при прохождении по кишечному тракту. При развитии недостаточности экзокринной функции поджелудочной железы содержание панкреатической Е1 в кале снижается. Снижение активности Е1 в кале также выявляется у больных с хроническим панкреатитом, раком поджелудочной железы, у детей с муковисцидозом. При муковисцидозе рекомендуется исследовать уровень эластазы 1 в кале не реже одного раза в 6 месяцев. Содержание Е1 в кале не изменяется при целом ряде других заболеваний: целиакии, воспалительных заболеваниях кишечника, инфекционной диарее. Высокая стабильность панкреатической Эластазы 1 позволяет не ограничивать время доставки анализа в диагностическую лабораторию. Материал для определения Е1 может храниться в течение недели в холодильнике. Одного образца кала достаточно для постановки диагноза (нет необходимости собирать суточный кал). Определение Е1 используется для оценки экзокринной функции поджелудочной железы. В отличие от фекального химотрипсина результаты определения Е1 не зависят от приема пациентами панкреатических ферментов.

E1 — Оценка и манипуляции с верхними конечностями

  • Программа интересов *

    MS — Патология речи и языкаДоктор физиотерапииФлекс-доктор физиотерапииДоктор производственной терапииФлекс-доктор производственной терапииМастер производственной терапииМастер-терапевт FlexNo — Медсестра MSN — Семейная медсестра EducatorMSN — Руководитель медсестрыBSN to DNPBSN to DNP — Руководитель медсестрыBSN to DNP — Практикующая семейная медсестраMSN to DNPМастер управления здравоохранения MHA — Медицинская информатикаMHA — ПредпринимательствоМастер здравоохранения Обучение и обучение onCertificate — Медсестринский педагог Сертификат — Семейная практикующая медсестраАвгустин, Флорида Остин, Техас Сан-Маркос, Калифорния

  • Предпочтительный кампус *

    Майами, Флорида. Августин, Флорида Остин, Техас Даллас, Техас Сан-Маркос, Калифорния

  • Предпочтительный кампус *

    Майами, Флорида. Августин, Флорида, Остин, Техас, Даллас, Техас, Сан-Маркос, Калифорния

  • 2-й выбор Кампус

    Майами, Флорида, штат Техас, Сан-Маркос, Калифорния Все кампусы

    Программа доктора физиотерапии (DPT) также доступна в Майами, Флорида, Остине, Техас и Кампусы Сан-Маркос, Калифорния. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Майами, Флорида, Остин, Техас. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа доктора физиотерапии (DPT) также доступна в наших кампусах в Остине, Техас, Майами, Флорида и Сент-Огастин, Флорида. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Майами, Флорида Сан-Маркос, Калифорния. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа доктора физиотерапии (DPT) также доступна в наших кампусах в Майами, Флорида, Сент-Огастин, Флорида и Сан-Маркос, Калифорния. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Остин, Техас, Майами, Флорида, Сан-Маркос, Калифорния. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа доктора физиотерапии (DPT) также доступна в наших кампусах в Остине, Техас, Майами, Флорида, Сент-Огастин, Флорида и Сан-Маркос, Калифорния. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Остин, Техас, Сан-Маркос, Калифорния. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа доктора физиотерапии (DPT) также доступна в нашем Остине, Техас, Св.Кампусы Августина, Флорида и Сан-Маркос, Калифорния. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Miami, FLAustin, TXSan Marcos, CA Все кампусы

    Программа Master of Occupational Therapy (MOT) также доступна в наших кампусах в Майами, Флорида, Остине, Техас и Сан-Маркос, Калифорния. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Майами, Флорида, Остин, Техас. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа магистра трудовой терапии (MOT) также доступна в наших городах Остин, Техас, Майами, Флорида и Св.Августин, штат Флорида. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Майами, Флорида Сан-Маркос, Калифорния. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа магистра профессиональной терапии (MOT) также доступна в наших кампусах в Майами, Флорида, Сан-Маркос, Калифорния и Сент-Огастин, Флорида. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Сан-Маркос, Калифорния, Остин, Техас. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа магистра профессиональной терапии (MOT) также доступна в наших Сан-Маркос, Калифорния, Остин, Техас и Св.Августин, штат Флорида. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • Предпочтительный кампус *

    Остин, Техас, Сан-Маркос, CASt. Августин, Флорида

  • Предпочтительный кампус *

    Остин, Техас, Майами, Флорида. Августин, Флорида Сан-Маркос, Калифорния

  • Предпочтительный кампус *

    Сан-Маркос, Калифорния

  • Предпочтительный кампус *

    Даллас, Техас

  • Кампус 2-го выбора

    Остин, Техас Майами, Флорида

    Программа Flex Master of Occupational Therapy также доступны в наших кампусах в Остине, Техас и Майами, Флорида.Выберите кампус 2-го выбора, если вы готовы принять участие в дополнительных кампусах.

  • 2nd Choice Campus

    Майами, Флорида. Августин, Флорида

    Программа Flex Master of Occupational Therapy (MOT) также доступна в наших кампусах в Майами, Флорида и Сент-Огастин. Выберите кампус 2-го выбора, если вы готовы принять участие в дополнительных кампусах.

  • Скрытый

    Предпочтительный кампус *

    Расстояние

  • Предпочтительный кампус *

    Остин, Техас Даллас, Техас

  • Скрытый

    Желаемая дата начала *

    9/7/2021

    Желаемое начало

    Дата *

    07. 09.2021

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211.10.20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20215/9/20229 / 06.2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20215/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.2015/9/20229/6/2022

  • Желаемая Дата начала *

    9/7/20211/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    7/9 / 20215/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    9/7/202 11/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    7/9/202 11/10/20229/6 / 2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211.10.20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211/10/20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211.10.20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    06.09.20229.05.2023

  • Желаемая дата начала *

    07.09.2011 / 20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    9/7/202 11/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    7/9/20211/10/20229/6 / 2022

  • Желаемая дата начала *

    07. 09.202 11/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.202 11/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    9/7/20211/10/20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211/10/20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    9/7/20211/10/20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211/10/20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    9 / 9/2019

  • Заинтересованы в MOT Flex?

    Программа Master of Occupational Therapy (MOT) также предлагается в удобном формате Flex (Online + Weekend Labs на территории кампуса).Проверьте здесь, если вы хотите узнать больше о Flex MOT, предлагаемом в настоящее время в Майами, Остине и Сент-Огастине.

  • Заинтересованы в DPT Flex?

    Программа «Доктор физиотерапевт» (DPT) также предлагается в удобном формате Flex (онлайн + лаборатории выходного дня на территории кампуса). Отметьте здесь, если вы хотите узнать больше о Flex DPT, который в настоящее время предлагается в Остине, Сан-Маркосе и Сент-Огастине.

  • Имя *
  • Фамилия *
  • Телефон *
  • Адрес электронной почты *
  • Почтовый индекс *
  • Без названия * Установив флажок, я даю свое явное письменное согласие Университету Св.Августин из отдела медицинских наук, чтобы связаться со мной по электронной почте, тексту, телефону и заранее записанному сообщению относительно продолжения моего образования. Я понимаю, что звонки могут производиться с использованием автоматизированных технологий. Вы можете отказаться в любой момент. Пожалуйста, просмотрите нашу Политику конфиденциальности или свяжитесь с нами для получения более подробной информации.
  • E1 — Оценка и манипуляции с нижними конечностями

  • Программа по интересам *

    MS — Патология речи и языка Доктор физиотерапииFlex Doctor of Physical TherapyДоктор производственной терапииFlex Доктор производственной терапииМастер производственной терапииFlexMS Мастер семейной терапии — Медсестра-педагогMSN — Руководитель медсестры от BSN до DNPBSN до DNP — Руководитель медсестры от BSN до DNP — Семейная медсестра, практикующая медсестра, от MSN до DNP, магистр управления здравоохранения MHA — Медицинская информатика LeadershipEdD — Teaching and LearningEdD — Медсестринское образованиеEdD — Спортивная подготовкаПереходный врач физиотерапии Получение сертификата об обучении медсестер Сертификат практикующего семейного медсестры Сертификат руководителя медсестры

  • Предпочтительный кампус *

    Майами, Флорида. Августин, Флорида Остин, Техас Сан-Маркос, Калифорния

  • Предпочтительный кампус *

    Майами, Флорида. Августин, Флорида Остин, Техас Даллас, Техас Сан-Маркос, Калифорния

  • Предпочтительный кампус *

    Майами, Флорида. Августин, Флорида, Остин, Техас, Даллас, Техас, Сан-Маркос, Калифорния

  • 2-й выбор Кампус

    Майами, Флорида, штат Техас, Сан-Маркос, Калифорния Все кампусы

    Программа доктора физиотерапии (DPT) также доступна в Майами, Флорида, Остине, Техас и Кампусы Сан-Маркос, Калифорния. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Майами, Флорида, Остин, Техас. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа доктора физиотерапии (DPT) также доступна в наших кампусах в Остине, Техас, Майами, Флорида и Сент-Огастин, Флорида. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Майами, Флорида Сан-Маркос, Калифорния. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа доктора физиотерапии (DPT) также доступна в наших кампусах в Майами, Флорида, Сент-Огастин, Флорида и Сан-Маркос, Калифорния.Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Остин, Техас, Майами, Флорида, Сан-Маркос, Калифорния. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа доктора физиотерапии (DPT) также доступна в наших кампусах в Остине, Техас, Майами, Флорида, Сент-Огастин, Флорида и Сан-Маркос, Калифорния. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Остин, Техас, Сан-Маркос, Калифорния. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа доктора физиотерапии (DPT) также доступна в нашем Остине, Техас, Св.Кампусы Августина, Флорида и Сан-Маркос, Калифорния. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Miami, FLAustin, TXSan Marcos, CA Все кампусы

    Программа Master of Occupational Therapy (MOT) также доступна в наших кампусах в Майами, Флорида, Остине, Техас и Сан-Маркос, Калифорния. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Майами, Флорида, Остин, Техас. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа магистра трудовой терапии (MOT) также доступна в наших городах Остин, Техас, Майами, Флорида и Св.Августин, штат Флорида. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Майами, Флорида Сан-Маркос, Калифорния. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа магистра профессиональной терапии (MOT) также доступна в наших кампусах в Майами, Флорида, Сан-Маркос, Калифорния и Сент-Огастин, Флорида. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • 2nd Choice Campus

    Сан-Маркос, Калифорния, Остин, Техас. Августин, Флорида Все кампусы

    Программа магистра профессиональной терапии (MOT) также доступна в наших Сан-Маркос, Калифорния, Остин, Техас и Св.Августин, штат Флорида. Выберите кампус 2-го выбора, если вы открыты для другого или всех кампусов.

  • Предпочтительный кампус *

    Остин, Техас, Сан-Маркос, CASt. Августин, Флорида

  • Предпочтительный кампус *

    Остин, Техас, Майами, Флорида. Августин, Флорида Сан-Маркос, Калифорния

  • Предпочтительный кампус *

    Сан-Маркос, Калифорния

  • Предпочтительный кампус *

    Даллас, Техас

  • Кампус 2-го выбора

    Остин, Техас Майами, Флорида

    Программа Flex Master of Occupational Therapy также доступны в наших кампусах в Остине, Техас и Майами, Флорида.Выберите кампус 2-го выбора, если вы готовы принять участие в дополнительных кампусах.

  • 2nd Choice Campus

    Майами, Флорида. Августин, Флорида

    Программа Flex Master of Occupational Therapy (MOT) также доступна в наших кампусах в Майами, Флорида и Сент-Огастин. Выберите кампус 2-го выбора, если вы готовы принять участие в дополнительных кампусах.

  • Скрытый

    Предпочтительный кампус *

    Расстояние

  • Предпочтительный кампус *

    Остин, Техас Даллас, Техас

  • Скрытый

    Желаемая дата начала *

    9/7/2021

    Желаемое начало

    Дата *

    07. 09.2021

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211.10.20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20215/9/20229 / 06.2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20215/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.2015/9/20229/6/2022

  • Желаемая Дата начала *

    9/7/20211/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    7/9 / 20215/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    9/7/202 11/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    7/9/202 11/10/20229/6 / 2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211.10.20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211/10/20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211.10.20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    06.09.20229.05.2023

  • Желаемая дата начала *

    07.09.2011 / 20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    9/7/202 11/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    7/9/20211/10/20229/6 / 2022

  • Желаемая дата начала *

    07. 09.202 11/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.202 11/10/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    9/7/20211/10/20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211/10/20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    9/7/20211/10/20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    07.09.20211/10/20225/9/20229/6/2022

  • Желаемая дата начала *

    9 / 9/2019

  • Заинтересованы в MOT Flex?

    Программа Master of Occupational Therapy (MOT) также предлагается в удобном формате Flex (Online + Weekend Labs на территории кампуса).Проверьте здесь, если вы хотите узнать больше о Flex MOT, предлагаемом в настоящее время в Майами, Остине и Сент-Огастине.

  • Заинтересованы в DPT Flex?

    Программа «Доктор физиотерапевт» (DPT) также предлагается в удобном формате Flex (онлайн + лаборатории выходного дня на территории кампуса). Отметьте здесь, если вы хотите узнать больше о Flex DPT, который в настоящее время предлагается в Остине, Сан-Маркосе и Сент-Огастине.

  • Имя *
  • Фамилия *
  • Телефон *
  • Адрес электронной почты *
  • Почтовый индекс *
  • Без названия * Установив флажок, я даю свое явное письменное согласие Университету Св.Августин из отдела медицинских наук, чтобы связаться со мной по электронной почте, тексту, телефону и заранее записанному сообщению относительно продолжения моего образования. Я понимаю, что звонки могут производиться с использованием автоматизированных технологий. Вы можете отказаться в любой момент. Пожалуйста, просмотрите нашу Политику конфиденциальности или свяжитесь с нами для получения более подробной информации.
  • Оптогенетическое манипулирование внутриклеточным кальцием с помощью BACCS способствует дифференцировке клеток MC3T3-E1

    Biochem Biophys Res Commun .2018 30 ноября; 506 (3): 716-722. DOI: 10. 1016 / j.bbrc.2018.10.107. Epub 2018 27 октября.

    Принадлежности Расширять

    Принадлежности

    • 1 Отделение ортодонтических наук, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицинских и стоматологических наук, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
    • 2 Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
    • 3 Отделение ортодонтии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
    • 4 Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония. Электронный адрес: [email protected]

    Элемент в буфере обмена

    Мо Сато и др.Biochem Biophys Res Commun. .

    Показать детали Показать варианты

    Показать варианты

    Формат АннотацияPubMedPMID

    Biochem Biophys Res Commun . 2018 30 ноября; 506 (3): 716-722. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2018.10.107. Epub 2018 27 октября.

    Принадлежности

    • 1 Отделение ортодонтических наук, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицинских и стоматологических наук, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
    • 2 Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
    • 3 Отделение ортодонтии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
    • 4 Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония. Электронный адрес: [email protected]

    Элемент в буфере обмена

    Полнотекстовые ссылки Опции CiteDisplay

    Показать варианты

    Формат АннотацияPubMedPMID

    Абстрактный

    Ремоделирование кости поддерживается за счет баланса между образованием кости остеобластами и резорбцией кости остеокластами. Предыдущие исследования показали, что внутриклеточная передача сигналов Ca 2+ играет важную роль в дифференцировке остеобластов; однако молекулярный механизм передачи сигналов Ca 2+ в дифференцировке остеобластов остается неясным. Чтобы выяснить влияние передачи сигналов Ca 2+ в остеобластах, мы использовали оптогенетический инструмент, активируемый синим светом переключатель каналов Ca 2+ (BACCS). BACCS использовали для пространственно-временного контроля внутриклеточного Ca 2+ с помощью стимуляции синим светом.Клетки MC3T3-E1, которые использовались в качестве модели дифференцировки от преостеобластов к остеобластам, стимулировались к дифференцировке за счет экспрессии BACCS и ритмической стимуляции синим светом. Результаты показали, что внутриклеточное изменение Ca 2+ извне клеток может регулировать передачу сигналов для дифференцировки клеток MC3T3-E1. Наши результаты подтверждают, что Ca 2+ может вызывать дифференцировку остеобластов.

    Ключевые слова: Дифференциация; Передача сигналов внутриклеточного Ca (2+); Оптогенетика; Остеобласт.

    Авторские права © 2018 Elsevier Inc. Все права защищены.

    Похожие статьи

    • Световая генерация внутриклеточных сигналов Ca (2+) генетически кодируемым белком BACCS.

      Исии Т., Сато К., Какумото Т., Миура С., Тухара К., Такеучи С., Наката Т. Исии Т. и др. Nat Commun. 2015 18 августа; 6: 8021. DOI: 10.1038 / ncomms9021. Nat Commun. 2015 г. PMID: 26282514 Бесплатная статья PMC.

    • Удаление Orai1 изменяет экспрессию нескольких генов во время созревания остеокластов и остеобластов.

      Хван С.Ю., Фоли Дж., Нумага-Томита Т., Петранка Дж. Г., Птица Г.С., Патни Дж. У. мл. Hwang SY, et al. Клеточный кальций. 2012 декабрь; 52 (6): 488-500. DOI: 10.1016 / j.ceca.2012.10.001. Epub 2012 31 октября.Клеточный кальций. 2012 г. PMID: 23122304 Бесплатная статья PMC.

    • Роль белка лизосомального канала TPC2 в дифференцировке остеокластов и ремоделировании костей в нормальных условиях и условиях с низким содержанием магния.

      Нотоми Т., Куно М., Хияма А., Нодзаки Т., Охура К., Эзура Ю., Нода М. Notomi T, et al. J Biol Chem. 2017 22 декабря; 292 (51): 20998-21010. DOI: 10.1074 / jbc.M117.780072.Epub 2017 30 октября. J Biol Chem. 2017 г. PMID: 244 Бесплатная статья PMC.

    • Передача сигналов кальция в дифференцировке остеокластов и резорбции кости.

      Каджиа Х. Каджа Х. Adv Exp Med Biol. 2012; 740: 917-32. DOI: 10.1007 / 978-94-007-2888-2_41. Adv Exp Med Biol. 2012 г. PMID: 22453976 Рассмотрение.

    • [Разработка и применение оптогенетических средств].

      Вэй Цюй, Сюй Ц., Ван М., Е Х. Вэй Кью и др. Шэн У Гун Чэн Сюэ Бао. 2019 25 декабря; 35 (12): 2238-2256. DOI: 10.13345 / j.cjb.1

    • . Шэн У Гун Чэн Сюэ Бао. 2019. PMID: 31880133 Рассмотрение. Китайский язык.

    Типы публикаций

    • Поддержка исследований, за пределами США. Правительство

    Условия MeSH

    • Кальциевые каналы / метаболизм *
    • Внутриклеточное пространство / метаболизм
    • Стробирование ионных каналов * / радиационные эффекты
    [Икс]

    цитировать

    Копировать

    Формат: AMA APA ГНД NLM

    35 U.

    S. Кодекс § 271 — Нарушение патента | Кодекс США | Закон США Исторические и редакционные заметки

    Первый абзац данного раздела носит декларативный характер и определяет нарушение.

    Пункты (b) и (c) определяют и ограничивают сопутствующее нарушение патента, а пункт (d) является вспомогательным по отношению к этим параграфам, см. Предварительное общее описание законопроекта. Тот, кто активно побуждает к нарушению, содействуя и подстрекательствуя к нему, несет ответственность как нарушитель, равно как и тот, кто продает составную часть запатентованного изобретения или материал или устройство для использования в нем, зная, что то же самое должно быть специально изготовлено или специально адаптировано для использования. в случае нарушения патента, за исключением случаев использования основного продукта или коммерческого товара для других целей.Не считается, что патентообладатель злоупотребил своим патентом только по причине того, что он сделал что-либо, разрешенное разделом.

    Редакционные примечания

    Ссылки в тексте

    Федеральный закон о пищевых продуктах, лекарствах и косметических средствах, упомянутый в подст. (e) (1), (2), закон от 25 июня 1938 г., гл. 675, 52 Стат. 1040, который обычно классифицируется по главе 9 (§301 и последующие) Раздела 21, Продукты питания и лекарства. Разделы 505 и 512 Закона подразделяются на разделы 355 и 360b, соответственно, Раздела 21.Для полной отнесения этого Закона к Кодексу см. Раздел 301 Раздела 21 и Таблицы.

    Закон от 4 марта 1913 г., упомянутый в пп. (e) (1), (2), закон от 4 марта 1913 г., гл. 145, 37 Стат. 828. Положения такого закона, касающиеся вирусов и т. Д., Применимые к домашним животным, широко известные как Закон о вирусах, сыворотках и токсинах, содержатся в восьмом параграфе под заголовком «Бюро животноводства» закона от 4 марта. , 1913, на 37 стат. 832 и обычно относятся к главе 5 (§151 и след.) Раздела 21, Продукты питания и лекарства. Для полной отнесения этого Закона к Кодексу см. Примечание к Краткому названию, изложенное в разделе 151 Раздела 21 и Таблицах.

    Раздел 351 Закона об общественном здравоохранении, упомянутый в подст. (e) (2) (C), (4) (D), (6) (A), (C), относится к разделу 262 Раздела 42 «Общественное здравоохранение и благосостояние».

    Поправки

    2010 — Подст. (д) (2). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (A) (iv), в заключительных положениях заменили «ветеринарный биологический продукт или биологический продукт» на «или ветеринарный биологический продукт».

    Подсек. (e) (2) (C). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (A) (i) — (iii), добавлен подпункт. (С).

    Подсек. (д) (4). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (B) (iv), в заключительных положениях заменены «(C) и (D)» на «и (C)».

    Подсек. (д) (4) (В). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (B) (i), заменил «ветеринарный биологический продукт или биологический продукт» на «или ветеринарный биологический продукт» и вычеркнул «и» в конце.

    Подсек. (e) (4) (C). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (B) (ii), заменены «ветеринарный биологический продукт или биологический продукт» на «или ветеринарный биологический продукт» и «и» на конец периода.

    Подсек. (e) (4) (D). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (B) (iii), добавлен подпункт. (D).

    Подсек. (д) (6). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (C), добавлен п. (6).

    2003 — п. (д) (5). Паб. Л. 108–173 доп. П. (5).

    1994 — пп. (а). Паб. L. 103–465, §533 (a) (1), после слов «использует» и «или импортирует в США любое запатентованное изобретение» после слов «Соединенные Штаты» вставлено «предлагает к продаже».

    Подсек. (c). Паб. L. 103–465, §533 (a) (2), заменил «предложения о продаже или продаже в Соединенных Штатах или импорт в Соединенные Штаты» на «продажи».

    Подсек. (д) (1). Паб. L. 103–465, §533 (a) (3) (A), заменено «предложение продать или продать в Соединенных Штатах или импортировать в Соединенные Штаты» на «или продать».

    Подсек. (д) (3). Паб. L. 103–465, §533 (a) (3) (B), заменено «предложение на продажу или продажа в Соединенных Штатах или импорт в Соединенные Штаты» на «или продажа».

    Подсек. (e) (4) (B), (C). Паб. L. 103–465, §533 (a) (3) (C), (D), заменено «предложение о продаже или продаже в Соединенных Штатах или ввоз в Соединенные Штаты» на «или продажа».

    Подсек. (грамм). Паб. L. 103–465, §533 (a) (4), заменены «предложения о продаже, продажа» на «продает», «импорт, предложение о продаже, продажа» на «импорт, продажа» и «другое использовать, предлагать к продаже или »для« другого использования или ».

    Подсек. (я). Паб. L. 103–465, §533 (a) (5), добавлен подст. (я).

    1992 — п. (час). Паб. Л. 102–560 добавлен пп. (час).

    1988 — п. (г). Паб. Л. 100–703 доп. Кл. (4) и (5).

    Подсек. (д) (1). Паб. L. 100–670, §201 (i) (1), вставлен «который в основном производится с использованием рекомбинантной ДНК, рекомбинантной РНК, гибридомной технологии или других процессов, включающих методы сайт-специфических генетических манипуляций» после «4 марта 1913 г.)» и «Или ветеринарные биологические продукты» после «продажа лекарств».

    Подсек. (д) (2). Паб. L. 100–670, §201 (i) (2), пар. (2) в общем. До внесения изменений в п. (2) гласит следующее: «Подача заявки в соответствии с разделом 505 (j) Федерального закона о пищевых продуктах, лекарствах и косметических средствах или описанным в разделе 505 (b) (2) такого Закона является актом нарушения прав. лекарство, заявленное в патенте, или использование которого заявлено в патенте, если целью такого представления является получение разрешения в соответствии с таким Законом на коммерческое производство, использование или продажу лекарственного средства, заявленного в патенте или использование которых заявлено в патенте до истечения срока действия такого патента.”

    Подсек. (д) (4). Паб. L. 100–670, §201 (i) (3), добавлено «или ветеринарный биологический продукт» после слова «лекарственное средство» в подпунктах. (А) — (С).

    Подсек. (грамм). Паб. Л. 100–418 добавлен пп. (грамм).

    1984 — Подст. (е). Паб. Л. 98–417 добавлен пп. (е).

    Подсек. (е). Паб. Л. 98–622 добавлен пп. (е).

    Обязательства и связанные с ними дочерние компании

    Дата вступления в силу поправки 1994 г.

    Поправка Pub. L. 103–465 вступает в силу через год после даты вступления в силу Соглашения ВТО в отношении Соединенных Штатов [янв.1, 1995], с положениями, относящимися к самой ранней поданной заявке на патент, см. Раздел 534 (a), (b) (3) Pub. L. 103–465, изложенный в виде примечания к разделу 154 этого заголовка.

    Дата вступления в силу поправки 1988 г.

    Паб. L. 100–703, раздел II, §202, 19 ноября 1988 г., 102 Stat. 4676, при условии, что:

    «Поправка, внесенная в этот заголовок [поправка к этому разделу], применяется только к делам, поданным на дату вступления в силу настоящего Закона или после этой даты [ноябрь. 19, 1988] ».

    Паб. L. 100–418, раздел IX, §9006, август.23, 1988, 102 Stat. 1566, при условии, что:

    «(А) В целом. Поправки, внесенные этим подзаголовком [подзаголовок A (§§9001–9007) раздела IX Pub. L. 100–418, вводящий в действие раздел 295 этого раздела и изменяющий этот раздел и разделы 154 и 287 этого раздела] вступают в силу через 6 месяцев после даты вступления в силу настоящего Закона [август. 23, 1988] и, с учетом подразделов (b) и (c), применяется только в отношении продуктов, произведенных или импортированных после даты вступления в силу поправок, внесенных в этот подзаголовок.«(B) Исключения.

    Изменения, внесенные в этот подзаголовок, не должны ограничивать или влиять на право любого лица или любого правопреемника такого лица продолжать использовать, продавать или импортировать любой конкретный продукт, уже находящийся в значительной и постоянной продаже или использовании таким лицом в Соединенные Штаты 1 января 1988 г., или в отношении которых такое лицо к такой продаже или использованию было подготовлено до такой даты, в той степени, в которой это справедливо для защиты сделанных коммерческих инвестиций или ведения бизнеса в Соединенных Штатах до такой даты.Этот подраздел не применяется к любому лицу или любому правопреемнику такого лица, использующему, продающему или импортирующему продукт, произведенный с помощью запатентованного процесса, который является предметом процессуального действия по обеспечению соблюдения патента, начатого до 1 января 1987 г. , до начала международной торговли. Комиссия, ожидающая рассмотрения или по которой был выставлен ордер.

    «(C) Сохранение других средств правовой защиты. Поправки, внесенные в этот подзаголовок, не должны лишать патентообладателя любых средств правовой защиты, доступных в соответствии с подразделами (а) — (f) раздела 271 раздела 35 Кодекса США, в соответствии с разделом 337 Закона о тарифах 1930 г. [19 U.S.C. 1337] или в соответствии с любым другим положением закона ». Отчеты Конгрессу; Влияние на отечественную промышленность Закона об изменениях в патентах 1988 г.

    Паб. L. 100–418, раздел IX, §9007, 23 августа 1988 г., 102 Stat. 1567, при условии, что министр торговли должен был представлять Конгрессу ежегодные отчеты, охватывающие каждый из пяти последовательных однолетних периодов, начинающихся через 6 месяцев после 23 августа 1988 г., о влиянии поправок, внесенных в подзаголовок A (§§9001– 9007) раздела IX Pub. L. 100–418, вводящий в действие раздел 295 настоящего раздела и изменяющий разделы 154, 271 и 287 этого раздела в отношении тех отечественных предприятий, которые подают жалобы в Министерство торговли, утверждая, что их законные источники поставок были подвергнуты неблагоприятному воздействию из-за поправки.

    E1 Убиквитин-активирующий фермент UBA-1 играет несколько ролей в процессе разработки C. elegans

    Abstract

    Полиубиквитинирование белков-мишеней обычно отмечает их разрушение через протеасомы и обеспечивает важный механизм для динамического контроля уровней белка. Фермент, активирующий убиквитин E1, находится на вершине каскада убиквитинирования, и его активность необходима для всех последующих стадий реакции. Мы выделили чувствительную к температуре мутацию в гене Caenorhabditis elegans uba-1 , который кодирует единственный фермент E1 в этом организме.Манипулирование активностью UBA-1 на разных стадиях развития выявляет множество функций для убиквитинирования, включая новые роли в фертильности сперматозоидов, контроле размера тела и развитии в зависимости от пола. Уровни конъюгатов убиквитина у мутанта существенно снижены, что согласуется со сниженной активностью E1. Мутация uba-1 вызывает задержку мейотической прогрессии у ранних эмбрионов, процесс, который, как известно, регулируется убиквитин-опосредованным протеолизом. Мутация uba-1 также демонстрирует синтетические летальные взаимодействия с аллелями комплекса, стимулирующего анафазу, убиквитинлигазы E3.Мутация uba-1 обеспечивает сенсибилизированный генетический фон для идентификации новых функций in vivo для нижестоящих компонентов каскада ферментов убиквитина, и это одна из первых условных мутаций, описанных для основного фермента E1 в модели многоклеточных животных.

    Сведения об авторе

    Белки, контролирующие развитие организма, необходимо сначала включить в нужное время и в нужном месте, а затем выключить, когда они больше не нужны. Один из «выключенных» сигналов возникает из-за присоединения небольшого белка, известного как убиквитин, к белку-мишени, что обычно приводит к разрушению мишени.Присоединение убиквитина контролируется рядом ферментов, первый из которых известен как E1. У большинства организмов есть единственный ген фермента E1, и его активность имеет решающее значение для деградации широкого спектра целевых белков на протяжении всего развития. Мы идентифицировали чувствительную к температуре мутацию в ферменте E1 нематоды Caenorhabditis elegans . Управляя температурой роста, мы определили различные функции E1 на разных этапах развития.Мы обнаружили, что этот фермент контролирует развитие эмбрионов и личинок, фертильность сперматозоидов и размер тела. Мы также охарактеризовали половые роли для E1; у самцов прогрессирующий паралич и дефекты хвоста, который используется для спаривания. В дополнение к полученным знаниям эта мутация предоставляет средства идентификации как функций других ферментов убиквитина во время развития, так и целевых белков, которые помечены для разрушения.

    Образец цитирования: Kulkarni M, Smith HE (2008) E1 Убиквитин-активирующий фермент UBA-1 играет несколько ролей в C.elegans Разработка. PLoS Genet 4 (7): e1000131. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131

    Редактор: Мэри Маллинс, Медицинский факультет Пенсильванского университета, Соединенные Штаты Америки

    Поступила: 13 февраля 2008 г .; Одобрена: 18 июня 2008 г .; Опубликовано: 18 июля 2008 г.

    Авторские права: © 2008 Kulkarni et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

    Финансирование: Эта работа была частично поддержана грантом Национального научного фонда № 0445684 HES.

    Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

    Введение

    Посттрансляционная модификация белков играет критическую роль в регуляции активности белков, а убиквитин-опосредованный протеолиз стал ключевым игроком в контроле белкового обмена. Убиквитин, высококонсервативный небольшой белок, ковалентно присоединяется к белку-мишени посредством ферментативного каскада, и сборка полиубиквитиновой цепи обычно определяет этот белок для быстрой деградации через протеасому 26S [1].Таким образом, убиквитин-опосредованный протеолиз обеспечивает «выключенный» переключатель для управления пространственным и временным распределением белков, которые больше не нужны. Этот способ регуляции необходим для нормальных клеточных процессов (например, прогрессии и дифференцировки клеточного цикла), а дефекты связаны с такими заболеваниями человека, как рак и нейродегенеративные расстройства [2], [3].

    Убиквитинирование белков-мишеней может также регулировать функцию с помощью механизмов, отличных от опосредованной протеасомами деградации.Моноубиквитинирование служит сигналом для эндоцитоза и транспорта различных белков клеточной поверхности, а также участвует в регуляции гистонов и факторов транскрипции [4] — [6]. Сборка полиубиквитиновых цепей может происходить в разных лизинах убиквитина, что способствует разным результатам для меченого белка. Конъюгация по лизину 48 обычно ведет к протеасомной деградации, тогда как связывание через лизин 63 может модулировать белковые активности в таких разнообразных процессах, как ядерная локализация, репарация ДНК или образование включений при нейродегенеративных заболеваниях [7] — [9].

    Три фермента опосредуют присоединение убиквитина к белку-субстрату: убиквитин-активирующий фермент E1, убиквитин-конъюгированный фермент E2 и убиквитинлигаза E3 [10]. Повторные циклы лигирования с исходным убиквитином приводят к полиубиквитинированию. Субстратная специфичность обеспечивается избирательным связыванием отдельных лигаз E3 с одним или несколькими белками-мишенями [11]. Эукариоты обычно обладают одним геном, кодирующим E1-активирующий фермент, десятками E2-конъюгированных ферментов и несколькими сотнями E3-лигаз.Некоторые лигазы E3 сами по себе представляют собой мультисубъединичные комплексы, в которых субъединица распознавания субстрата определяет белок, нацеленный на убиквитинирование.

    In vivo Роль убиквитинирования в развитии организма была определена, прежде всего, путем характеристики специфических лигаз E3. У нематоды Caenorhabditis elegans лигазы E3 регулируют такие разнообразные процессы, как определение пола, прогрессирование клеточного цикла и синаптическая передача сигналов [12] — [16]. Исследования ферментов, конъюгирующих с E2, указывают на взаимодействие с несколькими E3, как можно было бы предположить по их относительному количеству.Например, инактивация ubc-2 дает более широкий спектр фенотипов, чем инактивация его известного партнера E3 apc-11 [17].

    Одна из наиболее хорошо охарактеризованных функций для убиквитинирования и протеасомной деградации у C. elegans — это координация ранних событий эмбриогенеза [18]. Комплекс, способствующий анафазе (APC), представляет собой мультисубъединичную лигазу E3, которая необходима для завершения мейоза сразу после оплодотворения ооцита спермой [19], [20].Убиквитин-опосредованный протеолиз также играет роль в деградации некоторых белков, которые участвуют в установлении передне-задней (A-P) полярности у ранних эмбрионов. Эти белки становятся асимметрично локализованными при первом делении клетки, и неспособность деградировать эти компоненты коррелирует с дефектами развития, такими как изменения в спецификации клеточной судьбы и эмбриональной летальности. Формирование оси A-P и прогрессирование эмбрионального клеточного цикла требует активности класса комплексов E3, известных как лигазы Cullin-RING [21] — [27].Мутации в компонентах APC также влияют на полярность A-P, возможно, как следствие дефектов мейоза [28], [29].

    Фермент, активирующий убиквитин E1, находится на вершине ферментативного каскада, и манипулирование его активностью может обеспечить решающую точку входа для идентификации бесчисленных ролей, выполняемых убиквитином во время развития. Чувствительные к температуре аллели E1 были идентифицированы в линиях клеток млекопитающих как мутации клеточного цикла, которые демонстрируют снижение убиквитинирования и деградации субстратных белков [30], [31].Точно так же чувствительный к температуре аллель E1 у дрожжей резко снижает конъюгацию убиквитина, а также приводит к остановке клеточного цикла [32]. Условные аллели также были выделены у Drosophila при скрининге супрессоров , индуцированного -индуцированным апоптозом во время развития глаз [33]. Подробная характеристика продемонстрировала сложность регуляции убиквитина в этой системе. В то время как слабые аллели гена Uba1 , кодирующего E1, блокируют апоптоз, сильные аллели способствуют остановке клеточного цикла и гибели.Более того, эти проаптотические аллели способствуют неавтономной пролиферации в соседних клетках посредством повышенных уровней передачи сигналов Notch.

    Мы сообщаем о выделении чувствительной к температуре мутации в гене C. elegans uba-1 , который кодирует единственный фермент E1 в этом организме. Предыдущие результаты для RNAi uba-1 сообщили о материнском бесплодии и эмбриональной летальности с дефектами мейотической прогрессии [34] — [36]. Мутация uba-1 (it129) повторяет эти фенотипы, а также раскрывает несколько новых функций, включая роль в фертильности сперматозоидов, размере тела и половозависимом развитии.Мутация uba-1 (it129) снижает уровни in vivo конъюгатов убиквитина и вызывает задержку мейотической прогрессии у ранних эмбрионов, что согласуется со снижением активности E1. Мутация uba-1 (it129) также демонстрирует синтетические летальные взаимодействия с известными компонентами комплекса, стимулирующего анафазу, и, как таковая, обеспечивает сенсибилизированный генетический фон для идентификации новых функций in vivo для других компонентов каскада убиквитина.

    Результаты

    Фенотипическая характеристика

    Чувствительный к температуре аллель it129 был выделен Дайан Шейкс и на основании стерильности сперматозоидов и летальности личинок был условно обозначен как spe-32 (S. Ward, личное сообщение). Мы определили, что spe-32 является аллельным к uba-1 (см. Ниже), единственному ферменту, активирующему убиквитин E1 в C. elegans , и приняли последнее название гена для ясности.Наша подробная характеристика uba-1 (it129) демонстрирует ряд фенотипов, некоторые из которых зависят от пола, в дополнение к упомянутым выше.

    Различные фенотипы проявляются на разных стадиях развития (обобщены в Таблице 1). Для облегчения характеристики эксперименты по температурному сдвигу были выполнены с синхронизированными по возрасту популяциями гермафродитов uba-1 (it129) . Взрослые особи, переведенные на ограничительную температуру, производят мертвые эмбрионы, и их количество равно количеству потомства, производимого животными дикого типа при этой температуре (рис. 1А).Остановка эмбриона неоднородна, что обусловлено различной морфологией эмбрионов и широким диапазоном количества ядер, наблюдаемых при окрашивании DAPI (рис. 1B). Сдвиг температуры на любой стадии эмбриогенеза приводит к нормальному вылуплению, но 100% образующихся личинок погибают на стадии L2 (данные не показаны). Таким образом, продукт гена uba-1 важен как для эмбрионального, так и для личиночного развития.

    Рис. 1. Дефекты в гермафродитах uba-1 .

    A) Количество жизнеспособного и нежизнеспособного потомства, полученного гермафродитами дикого типа (WT) или uba-1 (it129) при 15 ° C или 25 ° C.Показаны средние значения и стандартные отклонения (N = 6) всего потомства. B) Окрашивание DAPI uba-1 (it129) эмбрионов взрослых, сдвинутых до 25 ° C. C) Сперматозоидное бесплодие. Количество жизнеспособного потомства, полученного при 25 ° C гермафродитами дикого типа или uba-1 (it129) , либо без спаривания (самостоятельно), либо с самцами дикого типа (кросс). Показаны средние значения и стандартные отклонения (N = 6) потомства, полученного через 48 часов. Г) Длина тела. Средняя длина тела и стандартные отклонения (N = 20) синхронизированных по возрасту взрослых гермафродитов.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g001

    Личинки, переведенные на рестриктивную температуру на стадии L3, демонстрируют нормальное соматическое развитие. Однако у взрослого гермафродита это отрицательно сказывается на воспроизводстве. Эти стерильные животные откладывают только неоплодотворенные ооциты вместо эмбрионов, но дают жизнеспособное потомство при спаривании с самцами дикого типа, что указывает на то, что стерильность является специфической для сперматозоидов (рис. 1С). Жизнеспособность этого ауткроссного потомства высока (96%), что позволяет предположить, что развитие ооцитов (которое происходит после выработки сперматозоидов у гермафродита) в значительной степени не зависит от мутации.Подробная характеристика дефекта сперматогенеза (описанная ниже) показывает, что эти гермафродиты производят соответствующее количество морфологически нормальных сперматозоидов, но эти сперматозоиды неспособны к оплодотворению.

    Все вышеперечисленные фенотипы полностью рецессивны, поскольку гетерозиготные гермафродиты неотличимы от дикого типа. Эти фенотипы в значительной степени, хотя и не полностью, спасаются у uba-1 (it129) гомозиготных животных при разрешающей температуре. Наблюдается увеличение эмбриональной летальности, а также уменьшение количества продуцируемых эмбрионов (рис. 1A), что указывает на то, что продукт гена uba-1 (it129) не полностью функционирует при 15 ° C.Кроме того, температура вызывает небольшую, но значительную (p <0,001 по t-критерию Стьюдента) разницу в размерах тела между взрослыми особями дикого типа и uba-1 (it129) взрослых особей (рис. 1D). При выращивании при 15 ° C uba-1 (it129) гермафродитов на 16% длиннее, чем у дикого типа. Противоположный фенотип наблюдается при 25 ° C, мутанты uba-1 (it129) на 16% короче взрослых особей дикого типа.

    В процессе создания гетерозиготных штаммов для фенотипической характеристики мы наблюдали сильный материнский эффект восстановления ранних дефектов развития.Гомозиготное потомство uba-1 (it129) , полученное от гермафродитов + / uba-1 (it129) , выращенных при ограничительной температуре, показало небольшую эмбриональную или личиночную летальность (Таблица 2). Спасение матери не было полным для всех фенотипов; хотя гомозиготные гермафродиты нормально развивались во взрослом возрасте, у этих животных все еще наблюдалась спермоспецифическая стерильность. Мы также проверили спасение отцов путем скрещивания uba-1 (it129) / + гетерозиготных самцов с uba-1 (it129) гомозиготных гермафродитов.Опять же, эмбриональная и личиночная летальность (но не стерильность сперматозоидов) была в значительной степени снижена (Таблица 2). Поскольку присутствие единственной копии uba-1 дикого типа у гермафродита или самца-родителя эффективно подавляет эмбриональную и личиночную летальность в гомозиготном мутантном потомстве, это предполагает, что материнский или отцовский вклад белка UBA-1 достаточен для позволить соматическому развитию нормально протекать до зрелого возраста.

    Мужские фенотипы

    Чтобы облегчить фенотипическую характеристику самцов, мы сконструировали штамм uba-1 (it129) him-5 (e1490) [мутация him-5 (e1490) дает самцов за счет нерасхождения Х-хромосомы] [37] .Эксперименты по температурному сдвигу проводились с синхронизированными по возрасту популяциями, и у самцов наблюдались те же фенотипы, что и выше: эмбриональная и личиночная летальность и уменьшение размера тела (данные не показаны). Спермоспецифическая стерильность мутантных самцов оценивалась путем скрещивания с гермафродитами fem-1 (hc17) , у которых отсутствует сперма, но они продуцируют ооциты, которые можно оплодотворять при спаривании. Описанные ниже эксперименты показывают, что спаривание было успешным, но не было получено перекрестного потомства, демонстрируя, что мужские сперматозоиды неспособны к оплодотворению.Таким образом, такой же набор дефектов вызывает мутация uba-1 (it129) у мужчин и гермафродитов.

    Мы также наблюдали дополнительные фенотипы у uba-1 (it129) самцов. Наиболее заметным фенотипом у взрослых было конститутивное удлинение спикул (рис. 2А, первая и вторая панель). Эти структуры являются частью репродуктивного аппарата мужского хвоста и обычно расширяются только во время введения в вульву для передачи спермы. Дефект ретракции спикулы был очевиден у взрослых самцов как при разрешающей, так и при ограничительной температуре.Постоянно вытянутые спикулы наблюдались примерно у одной трети из uba-1 (it129) самцов, выращиваемых при 15 ° C, и почти у всех — при 25 ° C. В некоторых случаях спикулы, бугорки и окружающие ткани вывернуты, что также свидетельствует о структурных дефектах целостности мужских половых путей.

    Рис. 2. Дефекты у самцов уба-1 .

    А) Дефекты хвоста самцов. Показаны микрофотографии DIC хвоста самцов дикого типа или uba-1 (it129) животных, выращенных при указанной температуре.Скобка указывает веерные и сенсорные лучи. Стрелка указывает на спикулы. Б) Репродуктивный успех самцов. График показывает среднее количество потомства мужских особей и гермафродитов, произведенных гермафродитами дикого типа (N = 6), скрещенными с диким типом, или uba-1 (it129) самцов, выращенных при 15 ° C. Только первые 500 потомков были подсчитаны для дикого типа. Спаривания объединяли одного гермафродита с пятью мужчинами или трех гермафродитов с 12 мужчинами (высокое #) в течение 24 часов. Процент ауткроссирования рассчитывается путем умножения количества потомства мужского пола на два, а затем деления на общее количество потомства.В) Передача спермы. Стрелка указывает флуоресцентно меченую сперму от самцов дикого типа или uba-1 (it129) , локализованную в сперматеке немеченых гермафродитов после спаривания. D – F, мужской паралич. Г) Молодой взрослый уба-1 (it129) самец. Стрелка указывает нормальный синусоидальный изгиб хвоста. E) Пожилой человек uba-1 (it129) самец. Стрелка указывает вялое положение хвоста. F) Мертвые уба-1 (it129) самец (стрелка) и два уба-1 (it129) гермафродиты.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g002

    Дополнительные аномалии копулятивного аппарата самцов наблюдались у животных, выращенных при ограничительной температуре. Хвост самца дикого типа имеет кутикулярный веер, содержащий девять пар сенсорных лучей (рис. 2А, первая панель), которые участвуют в обнаружении партнера и поведенческих реакциях, необходимых для обнаружения вульвы гермафродита. Размер веера значительно уменьшился у гомозиготных самцов uba-1 (it129) , выращенных при 25 ° C, что также приводит к укорочению кончика хвоста и сенсорных лучей (рис. 2А, третья панель).На количество лучей это не влияет, и другие мужские репродуктивные структуры внешне кажутся нормальными при световой микроскопии. Фенотип укороченного веера является полудоминантным: у гетерозиготных самцов + / uba-1 (it129) размер веерообразной формы меньше, чем у дикого типа, но больше, чем у гомозиготных животных (данные не показаны). Следовательно, правильное формирование мужских копулятивных структур оказывается весьма чувствительным к дозировке белка UBA-1.

    Строения хвоста самца имеют решающее значение для брачного поведения и передачи сперматозоидов, поэтому аберрации в веере или функции спикул могут отрицательно повлиять на репродуктивный успех самцов.Сперма от самцов дикого типа имеет приоритет над сперматозоидами гермафродитов, так что вырабатывается только ауткроссное потомство до тех пор, пока мужская сперма не истощится, и в это время производство самопроизвольного потомства продолжается [38]. Мужская сперма производит потомство мужского пола и гермафродита в равных количествах, в то время как сперма гермафродита дает потомство исключительно гермафродита. Следовательно, количество потомков ауткроссинга, показатель репродуктивного успеха самцов, можно легко подсчитать, определив количество произведенных самцов.

    Репродуктивная успешность установлена ​​у гомозиготных самцов uba-1 (it129) , выращенных при разрешенной температуре. У некоторых из этих животных есть выступающие спикулы, которые, как можно предположить, нарушают передачу сперматозоидов. Фертильность гермафродитов uba-1 (it129) при 15 ° C демонстрирует, что функция сперматозоидов нормальна при этой температуре, поэтому получение потомства ауткроссирования использовалось как индикатор успешного спаривания. В результате спаривания с самцами дикого типа были получены самцы и гермафродиты в ожидаемом соотношении 1: 1, что указывает на то, что все потомство в измеренном временном интервале произошло в результате оплодотворения мужской спермой (рис. 2B, WT).Напротив, спаривание с uba-1 (it129) самцов дало в среднем только 56 самцов по сравнению с 236 потомками гермафродитов (Рисунок 2B, uba-1 ), что позволяет предположить, что количество ауткроссных потомков снижается. Те же данные можно было бы объяснить, если бы сперматозоиды nullo-X, производящие мужское потомство, менее пригодны для оплодотворения, чем X-несущие сперматозоиды, производящие гермафродитов. Это объяснение кажется маловероятным, потому что процент потомства самцов увеличивается, если увеличивается плотность самцов для спаривания (Рисунок 2B, uba-1 , высокий #).Чтобы окончательно исключить эту возможность, uba-1 (it129) самцов были скрещены с fem-1 (hc17) взрослых гермафродитов, у которых отсутствует сперма. В этом эксперименте получают только ауткроссное потомство, и, хотя численность была низкой, самцы и гермафродиты наблюдались в соотношении 1–1 (данные не показаны). Следовательно, фенотип выступающих спикул, наблюдаемый у самцов uba-1 (it129) при разрешающей температуре, снижает успешный перенос сперматозоидов для оплодотворения.

    Репродуктивный успех был таким же образом охарактеризован для uba-1 (it129) самцов, перешедших на ограничительную температуру на L3. От скрещивания потомства с гермафродитами дикого типа или fem-1 (hc17) не наблюдалось потомства. Этот сбой может возникнуть из-за неспособности сперматозоидов оплодотворять ооциты (как это верно для спермы гермафродитов при 25 ° C) или может быть следствием серьезных морфологических дефектов копулятивного аппарата мужчины, которые возникают при ограничительной температуре.Была проведена прямая оценка передачи спермы, чтобы различить две возможности. Самцов из штаммов him-5 (e1490) , которые являются диким типом или мутантными по uba-1 (it129) , выращивали как при 15 ° C, так и при 25 ° C, окрашивали флуоресцентным красителем, затем скрещивали с fem. -1 (hc17) гермафродитов, лишенных спермы. Самцы дикого типа, выращенные при любой температуре, и мутантные самцы, выращенные при 15 ° C, успешно спаривались в 50–70% случаев, о чем свидетельствует присутствие меченых сперматозоидов у гермафродитов fem-1 (hc17) (рис. 2C). , первые две панели).Напротив, uba-1 (it129) самцов, выращенных при 25 ° C, успешно перенесли сперму только в двух из 10 случаев. Хотя эффективность спаривания снижается при 25 ° C, дефекты копулятивных структур самцов, возникающие из-за мутации uba-1 (it129) , не отменяют полностью передачу сперматозоидов (рис. 2C, третья панель). Однако даже эти относительно редкие успешные спаривания не приводят к появлению потомства ауткроссинга, что указывает на то, что uba-1 (it129) сперматозоидов от самцов неспособны к оплодотворению при ограничительной температуре.

    Дополнительный, специфичный для пола фенотип наблюдался у uba-1 (it129) самцов: поздний прогрессирующий паралич у двух третей животных (Рисунок 2, D – F). Паралич начинается в задней части самца и продолжается спереди по мере старения червя, достигая кульминации в полностью парализованном животном со значительно сокращенной продолжительностью жизни. Прогрессирующий паралич наблюдается только у мужчин, так как uba-1 (it129) гермафродитов демонстрируют нормальную подвижность и продолжительность жизни (рис. 2F).Фенотип не является следствием аберрантного соматического развития, а возникает после развития, поскольку отсрочка температурного сдвига до взрослого возраста все еще приводит к параличу. Следовательно, продукт гена uba-1 необходим для поддержания нервно-мышечной функции у взрослого мужчины.

    Специфический для сперматозоидов дефект

    uba-1 Мутация

    Развитие сперматозоидов C. elegans было подробно описано [39], [40], что позволяет идентифицировать специфические цитологические и функциональные дефекты в программе развития, которые возникают как следствие мутации.Нормальный сперматогенез инициируется митотически делящейся популяцией стволовых клеток зародышевой линии. Первичные сперматоциты отделяются от синцитиального ядра цитоплазмы и подвергаются скоординированной программе мейоза и дифференцировки. Два мейотических деления дают начало четырем гаплоидным сперматидам с сильно конденсированными ядрами. Эти маленькие круглые клетки отделяются от более крупного остаточного тела, которое содержит компоненты, не необходимые для последующих этапов развития. Активация внеклеточным сигналом превращает неподвижные сперматиды в зрелые ползающие сперматозоиды, способные к оплодотворению, и было идентифицировано несколько соединений, которые способствуют активации in vitro [41] — [43].Активация у гермафродитов происходит в сперматеке, где хранятся зрелые сперматозоиды. Активация мужских сперматид происходит во время осеменения, и мужские сперматозоиды выползают из матки в сперматеку. Оплодотворение происходит в сперматеке, когда ооцит проталкивается в эту камеру репродуктивного тракта гермафродита, а вновь образованная зигота затем переходит в матку. Большая часть сперматозоидов вытесняется и должна вернуться обратно в сперматеку, чтобы дождаться следующего ооцита.

    Спермоспецифическая стерильность, вызванная мутацией uba-1 (it129) , была охарактеризована более подробно, начиная с ранних событий, ведущих к образованию сперматид. Окрашивание DAPI L4 и молодых взрослых гермафродитов и самцов не выявило различий в мейотической прогрессии, количестве продуцируемых сперматозоидов или (для гермафродитов) их исходной локализации в сперматеках (Рисунок 3, A – B и данные не показаны). Активация сперматид была нормальной in vivo и in vitro и приводила к ползущим сперматозоидам без заметных дефектов движения псевдопод или подвижности клеток (рис. 3С).Поскольку подвижность и локализация кажутся нормальными, но зиготы не образуются, мутация uba-1 (it129) дает зрелые сперматозоиды, которые, тем не менее, неспособны к оплодотворению.

    Рисунок 3. Дефекты спермы.

    А) Локализация сперматозоидов в репродуктивном тракте гермафродита. Взрослые особи дикого типа и uba-1 (it129) при 25 ° C фиксировали и окрашивали DAPI для подсчета ядер сперматозоидов. Кончики стрел, расположение сперматеек; маленькие стрелки, сперма вытеснена в матку.Б) Сводка данных о локализации сперматозоидов. Показаны средние значения и стандартные отклонения на гермафродит (N = 6). T0, до начала яйцекладки; Т1 — после 1-2 овуляций; T2, 8 ч после T1; T3, через 8 часов после T2. C) Активация in vitro . Сперматиды дикого типа и uba-1 (it129) самцов при 25 ° C были активированы монензином. Стрелка указывает псевдоножку ползающего сперматозоида.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g003

    Вторичный дефект функции сперматозоидов был позже обнаружен у взрослых гермафродитов.Сперматозоиды перемещаются из сперматеки в матку каждым проходящим ооцитом и должны вернуться в сперматеку и дождаться следующей яйцеклетки. Эффективность оплодотворения составляет практически 100% у животных дикого типа, при этом почти каждый сперматозоид используется для воспроизводства [38]. Таким образом, количество сперматозоидов в сперматеке уменьшается в соответствии с увеличением количества произведенного потомства. Поскольку сперматозоиды uba-1 (it129) подвижны, но неспособны к оплодотворению, можно предсказать, что их количество в сперматеке останется высоким на протяжении всего производства ооцитов.Вместо этого наблюдалось противоположное явление, поскольку количество сперматозоидов уменьшалось у uba-1 (it129) гермафродитов быстрее, чем у дикого типа (рис. 3В). Кроме того, значительное количество сперматозоидов было обнаружено в матке, а не в сперматеке (рис. 3A, uba-1 ). Эти клетки уносятся из сперматеки неоплодотворенным ооцитом, но не могут вернуться и вместо этого выбрасываются через вульву, когда ооциты откладываются. Таким образом, хотя подвижность и локализация сперматозоидов изначально кажутся нормальными, у старых животных эти процессы явно нарушены.Это наблюдение может указывать на дефект в поддержании качества спермы с течением времени, что отрицательно влияет либо на подвижность, либо на взаимодействие сперматозоидов и сперматеков.

    Обозначение

    it129 as uba-1

    Идентичность аллеля it129 была определена с помощью комбинации генетических и физических стратегий картирования (рис. 4A). Трехфакторные скрещивания поместили этот аллель на хромосому IV между elt-1 и dpy-20 (F.Фелл и С. Уорд, чел. комм., и наши собственные результаты; картографические данные доступны на сайте www.wormbase.org). Однонуклеотидные полиморфизмы, которые перекрывают сайты рестрикции (snip-SNP), были проанализированы в рекомбинантных линиях [44]. Штаммы, содержащие дефицит eDf19 или mDf7 , не смогли дополнить it129 , дополнительно ограничивая свое положение перекрывающимся интервалом 310 т.п.н. Всего 80 генов-кандидатов в пределах интервала были доступны из крупномасштабной библиотеки питания РНКи [35].Все они были протестированы на способность воспроизводить два из фенотипов it129 : эмбриональная летальность F1 у обработанных взрослых гермафродитов и деформация хвоста у взрослых самцов, которых лечили как личинки. Только одна из протестированных плазмид воспроизводила оба фенотипа. Эта плазмида содержит фрагмент гена, кодирующего убиквитин-активирующий фермент E1, который в C. elegans известен как uba-1 .

    Рисунок 4. Клонирование и дополнение.

    A) Схема стратегии клонирования.Вверху показан интервал хромосомы IV от elt-1 до dpy-20 . Вторая линия указывает положение snip-SNP, идентифицированных в рекомбинантных линиях из N2 uba-1 (it129) dpy-20 (e1282) , скрещенных с гавайским штаммом CB4856. Следующие две строки указывают на конечные точки и перекрывающиеся области хромосомных дефицитов eDf19 и mDf7 , которые не смогли дополнить uba-1 (it129) . Восемьдесят генов в пределах 0,31 Мб наложения были проверены с помощью РНКи-кормления на два фенотипа uba-1 (it129) : эмбриональная летальность и дефекты мужского хвоста.Б) Прогнозируемая структура гена uba-1 . Показаны положение миссенс-мутации Pro1024Ser, идентифицированной в аллеле it129 , и протяженность удаленной области аллеля ok1374 . C) Данные о комплементации для гетерозигот it129 / ok1374 . Условия анализа эмбриональной летальности F1 (N = 6 гермафродитов), личиночной летальности (минимум 500 эмбрионов) и спермоспецифической стерильности (N = 10 гермафродитов) были идентичны тем, которые использовались для характеристики гомозигот it129 ; см. рисунок 1 и сопроводительный текст.Г) Дефекты зародышевой линии у гетерозигот it129 / ok1374 . Ядра зародышевой линии визуализировали окрашиванием DAPI фиксированных взрослых животных. Для ориентации показан дистальный конец гонады. В верхнем ряду показана одна рука гонады (слева направо) у it129 гомозиготного гермафродита, it129 / ok1374 гетерозиготного гермафродита, it129 гомозиготного самца и it129 / ok1374 гетерозиготного самца. В нижнем ряду показано изображение области проксимального отдела гонады с большим увеличением.Стрелки — ядра ооцитов при диакинезе.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g004

    Тесты комплементации подтвердили, что it129 является аллелем uba-1 . Консорциум Gene Knockout (http://celeganskoconsortium.omrf.org) сгенерировал делеционный аллель uba-1 (ok1374) , который удаляет большую часть третьего и четвертого экзонов и, по прогнозам, является нулевой мутацией (рис. 4B). ). Мутанты, гомозиготные по uba-1 (ok1374) , проявляют эмбриональную летальность или раннюю задержку личинок, поэтому ok1374 / it129 животных были получены от скрещиваний при разрешающей температуре, чтобы обеспечить восстановление жизнеспособных линий.Комплементацию между двумя аллелями проверяли по температурному сдвигу на различных стадиях развития, как описано выше. Идентичные фенотипы, описанные для it129 гомозигот, наблюдались для ok1374 / it129 гетерозигот: эмбриональная летальность, личиночная летальность, сперматоспецифическая стерильность, дефекты в формировании мужского хвоста и мужской прогрессирующий паралич (Рисунок 4C, и данные не показаны. ). Таким образом, ok1374 и it129 не могут дополнять друг друга и оба являются аллелями uba-1 .

    Делеция ok1374 является предполагаемым нулевым аллелем, в то время как мутация it129 , вероятно, гипоморфна (то есть снижение функции; см. Обсуждение). Таким образом, мы стремились установить, были ли гетерозиготы it129 / ok1374 более неблагоприятными, чем гомозиготы it129 . Большинство фенотипов, наблюдаемых у гомозиготных животных it129 , обладают высокой проникающей способностью, что затрудняет обнаружение усиления. Однако данные анализа комплементации на стерильность сперматозоидов убедительно указывают на более серьезный дефект у животных it129 / ok1374 .Перекрестное оплодотворение стерильных it129 гомозиготных гермафродитов самцами дикого типа дает потомство с высокой жизнеспособностью (96%; см. Рисунок 1C). Напротив, перекрестное оплодотворение стерильных гермафродитов it129 / ok1374 дает эмбрионы с очень низкой жизнеспособностью (6%; рис. 4C). Кроме того, те же данные демонстрируют, что количество оплодотворенных эмбрионов значительно ниже у it129 / ok1374 гетерозигот, чем у it129 гомозигот (10 против 48, соответственно).Сперма обычно является ограниченной гаметой для оплодотворения у C. elegans , но эти результаты предполагают, что продукция ооцитов может быть дефектной у гермафродитов it129 / ok1374 . Поэтому мы исследовали гонады этих штаммов непосредственно с помощью окрашивания DAPI.

    Развитие зародышевых клеток C. elegans происходит от дистального к проксимальному отделу внутри гонады и наиболее легко различимо по изменениям в морфологии ядра [45]. У гермафродитов проксимальное плечо взрослых гонад дикого типа содержит ряд отдельных ооцитов, ядра которых блокируются при диакинезе мейоза I.Наш анализ показывает, что зародышевые линии гомозигот it129 подобны гермафродитам дикого типа, а проксимальная половая железа содержит морфологически нормальные ооциты, шесть диакинетических бивалентов которых легко видны (рис. 4D, верхняя и нижняя левая панели). Напротив, зародышевые линии животных it129 / ok1374 демонстрируют увеличенную популяцию половых клеток и сопутствующее снижение количества ооцитов в проксимальном плече гонады. Этот дефект оогенеза изменчив; некоторые зародышевые линии выглядят в основном нормальными, в то время как в других примерах ооциты отсутствуют и были полностью вытеснены избыточным количеством половых клеток (как на рис. 4D, верхняя и нижняя вторая панели).Сходный фенотип описан для мутаций в ряде генов, которые управляют выбором пролиферация против мейоза, таких как glp-1 [46].

    Кроме того, мы также наблюдали дефект сперматогенеза в зародышевой линии самцов. Взрослые самцы дикого типа накапливают большое количество сильно конденсированных ядер сперматид внутри семенного пузырька. Гомозиготные самцы it129 также содержат большое количество компактных ядер сперматид (рис. 4D, верхняя и нижняя третьи панели).Однако семенные пузырьки самцов it129 / ok1374 содержат относительно мало ядер, которые также кажутся более крупными или менее конденсированными, чем ядра сперматид (рис. 4D, крайние правые верхняя и нижняя панели). И у гермафродитов, и у мужчин митотические и пахитенные области зародышевой линии в дистальных отделах гонады кажутся нормальными (хотя иногда и уменьшаются в размерах). Эти результаты предполагают, что дифференцировка гамет у обоих полов нарушена у гетерозиготных мутантов it129 / ok1374 , но с противоположными эффектами в зависимости от типа гамет: самцы обладают меньшим количеством сперматид, чем обычно, в то время как гермафродиты содержат избыток ядер зародышевых клеток. а не ооциты.О гамет-специфических различиях в пролиферации и дифференцировке сообщалось ранее. Например, потеря gld-1 вызывает избыточную пролиферацию зародышевой линии только у гермафродитов, подвергающихся оогенезу [47], тогда как потеря puf-8 вызывает избыточную пролиферацию только в продуцирующих сперму зародышевых линиях [48].

    Спасение трансгена it129 с геном uba-1 дикого типа дополнительно подтвердило его идентификацию. Первоначальные попытки спасения с помощью микроинъекции зародышевой линии показали, что черви могут быть чрезвычайно чувствительны к дозе этого гена.Контрольные инъекции маркера rol-6 [49] дали многочисленные прокатные потомства F1 со стабильной передачей в последующих поколениях. Напротив, совместная инъекция uba-1 с rol-6 в типичных концентрациях привела к низким размерам расплода с очень небольшим количеством валиков F1 и отсутствием стабильно передающих линий, что свидетельствует о токсичности трансгена. Чтобы уменьшить дозировку гена, концентрация ДНК uba-1 была снижена по сравнению с rol-6 , и геномная ДНК N2 также была включена в инъекции.При самой низкой протестированной концентрации четыре из шестнадцати стабильно передающих линий продемонстрировали частичное восстановление как сперматоспецифической стерильности, так и эмбриональной летальности при ограничительной температуре. Следовательно, трансген uba-1 дикого типа способен дополнять мутацию it129 .

    Об экспрессии репортерного трансгена uba-1 :: GFP сообщалось в различных соматических тканях, но не в зародышевой линии [50], хотя функциональная роль UBA-1 в этой ткани указывается мутантным фенотипом.Трансгены часто заглушаются внутри зародышевой линии, поэтому гибридизация in situ была использована для обнаружения транскрипции эндогенного гена uba-1 в гонаде. Обильная экспрессия была обнаружена в половых клетках, которые инициировали мейоз у гермафродитов дикого типа (во время образования сперматозоидов и ооцитов) и у мужчин (рис. 5). Интенсивность сигнала оказалась выше во время продукции ооцитов; это наблюдение было подтверждено сравнением гермафродитов fem-1 (hc17) , которые образуют только ооциты, с гермафродитами fem-3 (q23) , которые производят только сперму.Пик экспрессии происходит в пахитене первого деления мейоза, отсутствует сразу после этого и снова обнаруживается в позднем оогенезе. Эта закономерность более очевидна в гонаде fem-1 (hc17) , которая принадлежит взрослому человеку более старшего возраста, чем гермафродит дикого типа.

    Рисунок 5. Гибридизация гонад in situ .

    Панели слева показывают паттерн экспрессии uba-1 в рассеченных гонадах. Панели справа показывают морфологию ядра по окрашиванию DAPI.Сверху вниз гонады происходят от взрослых гермафродитов во время оогенеза, взрослых мужчин во время сперматогенеза, fem-1 (hc17) взрослых гермафродитов, которые производят только ооциты, и fem-3 (q23) взрослых гермафродитов, которые производят только сперму. Было исследовано не менее 20 гонад на каждый генотип или пол. DT, дистальный конец гонады; П, пахитенная область.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g005

    Определение последовательности кодирующей области uba-1 из штамма, несущего it129 , выявило молекулярное поражение.Была обнаружена простая нуклеотидная замена, которая превращает пролин в положении 1024 в серин (Pro1024Ser, фигура 4B). Полная структура E1-убиквитин-активирующего фермента еще не определена, но доступны рентгеновские кристаллические структуры активирующих ферментов для убиквитин-подобных белков SUMO и NEDD8 [51], [52]. Остаток пролина, который мутирован в uba-1 (it129) , отображается рядом с активным сайтом, где, как предполагается, фрагмент убиквитина ковалентно присоединен к белку E1.На основании структурных данных можно ожидать, что мутация Pro1024Ser изменит каталитическую активность фермента.

    In vivo Дефекты убиквитинирования и эмбриогенеза

    Ген uba-1 кодирует единственный известный фермент, активирующий убиквитин E1 в C. elegans , поэтому предполагается, что дефект его активности нарушит последующие этапы ферментативного каскада и вызовет общее снижение уровня убиквитинирования. на субстратных белках.Мы проверили эту гипотезу напрямую, используя убиквитин-специфические антитела для оценки степени убиквитинирования в лизатах белков червей. Чтобы контролировать вариации в активности убиквитинирования на разных стадиях развития, мы экстрагировали белок из синхронизированных по возрасту молодых взрослых гермафродитов, сдвинутых как личинки L3. Поскольку эти животные uba-1 (it129) бесплодны из-за стерильности сперматозоидов, мы включили в качестве дополнительного контроля штамм, содержащий spe-26 (it112) (чувствительная к температуре, специфическая для сперматозоидов стерильная мутация).Вестерн-блоттинг показывает значительное снижение количества убиквитинового сигнала в экстрактах белка uba-1 (it129) по сравнению с контролями дикого типа и spe-26 (it112) (Фиг.6). Обратите внимание, что уровень убиквитина в высокомолекулярной области блоттинга особенно снижен, предположительно отражая существенное уменьшение количества полиубиквитинированных субстратов. Следовательно, мутация uba-1 (it129) демонстрирует in vivo снижение убиквитинирования белка.

    Рисунок 6. Вестерн-блоттинг для определения убиквитина.

    Панель слева (анти-Ub) показывает общий уровень конъюгатов убиквитина от дикого типа, spe-26 (it112) или uba-1 (it129) молодых взрослых гермафродитов. Равные количества экстрактов растворимых белков были обнаружены с помощью убиквитин-специфичных моноклональных антител. На панели справа (Кумасси) показаны те же экстракты, окрашенные на общий белок. Стандарты размеров (MW) указаны справа.

    https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1000131.g006

    Согласно прогнозам, пониженное убиквитинирование отрицательно влияет на протеасомную деградацию целевых белков. Хорошо изученные роли ubiquitin-обеспечиваемого протеолиза у C. elegans происходят во время ранних событий эмбриогенеза. Комплекс, стимулирующий анафазу (APC), представляет собой лигазу E3, которая необходима для деградации мейотического ингибитора секурина [53]. Полная потеря активности APC приводит к остановке метафазы у одноклеточного эмбриона [19].

    Мутация uba-1 (it129) не вызывает одноклеточного ареста, вызванного потерей активности APC, а вместо этого имитирует летальность многоклеточного эмбриона в результате снижения функции APC.Этот фенотип вызывается гипоморфными мутациями в компонентах APC или синтетическими взаимодействиями между некоторыми парами термочувствительных аллелей (т. Е. Каждая отдельная мутация не влияет на допустимую температуру, тогда как комбинация обеих мутаций вызывает гибель материнского эмбриона) [29] . Поскольку UBA-1 и APC функционируют в одном и том же ферментативном каскаде, мутации в обоих аналогично могут проявлять синтетическое взаимодействие. Поэтому мы протестировали аллель uba-1 (it129) в сочетании с компонентами APC.Двойные мутанты uba-1 (it129) либо с субъединицей APC mat-3 (или 180) [19], либо с активатором APC fzy-1 (h2983) [53], приводили к гибели материнского эмбриона на разрешающем уровне. температура (таблица 3).

    Ранний эмбриогенез был исследован у uba-1 (it129) взрослых гермафродитов, сдвинутых на 25 ° на дефекты мейотической прогрессии или полярности A-P в первом делении клетки. Трансген oma-1 :: GFP был использован для визуализации эмбриональной полярности [54].У гермафродитов дикого типа белок OMA-1 :: GFP равномерно распределен по цитозолю и исключен из интактных пронуклеусов одноклеточного эмбриона. Наши наблюдения при 25 ° C показывают, что белок также концентрируется на центриолях сперматозоидов и митотическом веретене. Убиквитин-опосредованный протеолиз при первом делении клетки разрушает основную часть OMA-1 :: GFP. Белок отсутствует в передней (A) клетке двухклеточного эмбриона, а оставшийся OMA-1 :: GFP становится связанным с гранулами P в задней (P) клетке.У uba-1 (it129) животных паттерн OMA-1 :: GFP в одноклеточных эмбрионах неотличим от дикого типа. Распад OMA-1 :: GFP во время первого деления клетки также идентичен, и белок сохраняется только в P-клетке. Однако прогрессирование зиготы через первое деление происходит медленнее, чем обычно для эмбрионов uba-1 (it129) . Отсроченное прогрессирование приводит к увеличению количества одноклеточных эмбрионов в матке, что легко визуализируется по присутствию OMA-1 :: GFP (рис. 7A).Гермафродиты дикого типа обычно содержат по одному одноклеточному эмбриону в каждом плече гонады; Напротив, мутанты uba-1 (it129) имеют в среднем по три одноклеточных эмбриона на одну руку гонад (фиг. 7B). Кроме того, 35% гермафродитов uba-1 (it129) содержали раздробленную зиготу в матке. Формирование жесткой яичной скорлупы завершается в конце мейоза, поэтому эти раздробленные зиготы могут быть либо косвенным следствием наблюдаемой задержки мейоза, либо указывать на структурную потребность в убиквитинировании у эмбриона сразу после оплодотворения.

    Рисунок 7. Выражение OMA-1 :: GFP.

    A) Взрослые гермафродиты, экспрессирующие интегрированный трансген oma-1 :: GFP . Показаны примеры животных дикого типа uba-1 (it129) и животных, которые содержат один и четыре одноклеточных эмбриона, соответственно. Б) Частота появления одноклеточных эмбрионов в матке. Подсчитывали количество одноклеточных эмбрионов на одну гонадную руку для гермафродитов дикого типа (N = 40) и uba-1 (it129), (N = 34). C) Распределение одноклеточных эмбрионов в мейотической, пронуклеарной и митотической стадиях развития, как это визуализировано с помощью OMA-1 :: GFP.

    https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g007

    Задержка в прогрессировании через первое эмбриональное деление было исследовано более подробно. После оплодотворения ядро ​​ооцита завершает первое и второе деления мейоза. Пронуклеусы ооцитов и сперматозоидов встречаются и сливаются, а затем претерпевают первое митотическое деление. Процент эмбрионов, наблюдаемых на каждой из этих стадий (мейоз, миграция и слияние пронуклеусов и митоз), был определен для животных дикого типа и uba-1 (it129) животных.Доля одноклеточных эмбрионов на мейотической и пронуклеарной стадиях была эквивалентна для эмбрионов дикого типа, но примерно в два раза выше на мейотической стадии для эмбрионов uba-1 (it129) (рис. 7C), что свидетельствует об острой чувствительности мейоза. в UBA-1. Несмотря на это значительно искаженное распределение (p <0,001 по критерию хи-квадрат Пирсона), не было никаких грубых дефектов ядерной или клеточной морфологии или распределения OMA-1 :: GFP по мере развития эмбриона.

    Обсуждение

    Здесь мы сообщаем о выделении и характеристике чувствительной к температуре мутации гена uba-1 , который кодирует фермент, активирующий убиквитин E1 C.elegans . Активация E1 является первым этапом ферментативного пути, который приводит к конъюгации убиквитина с белками-мишенями. Манипулирование активностью E1 с помощью сдвига температуры обеспечивает механизм для идентификации многих ролей убиквитинирования на протяжении всего развития. Эффекты мутации uba-1 (it129) проявляются как на организменном (т. Е. Эмбриональная и личиночная летальность, уменьшение размеров тела), так и на клеточном (сперматоспецифическая стерильность) уровнях, а также приводят к половозависимым различиям онтогенетические (формирование мужского копулятивного аппарата) и пост-онтогенетические (поздний мужской паралич) процессы.Мутация uba-1 (it129) вызывает существенное снижение in vivo уровней убиквитин-конъюгированных субстратов, демонстрирует синтетическую эмбриональную летальность с компонентами комплекса, стимулирующего анафазу (убиквитин-лигаза E3), и вызывает задержки в раннем эмбриональном развитии. события, которые, как известно, регулируются убиквитин-опосредованным протеолизом.

    В совокупности данные показывают, что мутация uba-1 (it129) приводит к чувствительному к температуре снижению его ферментативной активности, активирующей убиквитин.Поскольку продукт гена uba-1 является единственным ферментом E1 в C. elegans , прогнозируется, что снижение его активности отрицательно повлияет на функцию ферментов E2 и E3 во всем мире. Это уменьшение могло бы продлить период полужизни белков, обычно нацеленных на протеасому, а также изменить локализацию и / или активность других субстратов, конъюгированных с убиквитином. Некоторые из этих нисходящих путей будут более или менее чувствительны к снижению активности E1, но результатом будет снижение скорости убиквитинирования для широкого ряда белков-субстратов.В подтверждение этой модели вестерн-блоттинг с антителами против убиквитина продемонстрировал общее снижение мечения убиквитином экстрактов из мутантного штамма uba-1 (it129) (рис. 6). Кроме того, структурные данные родственных ферментов E1 предсказывают, что мутация Pro1024Ser в uba-1 (it129) может изменять его каталитическую активность. Наконец, модель согласуется с нашими результатами в скрининге генов-кандидатов (в котором сниженные уровни UBA-1 с помощью РНКи воспроизводили как эмбриональную летальность, так и дефекты мужского хвоста), а также фенокопию гипоморфных аллелей APC, а не сильную потерю -функции мутации (т.е., многоклеточный или одноклеточный эмбриональный арест).

    Альтернативная гипотеза о том, что мутация uba-1 (it129) блокирует только один или несколько путей E2 / E3, менее вероятна. Наблюдаемое снижение убиквитинирования in vivo у мутанта потребовало бы, чтобы основная часть конъюгации убиквитина опосредовалась одной или несколькими лигазами E3; однако сотни E3, присутствующие в C. elegans , выступают против этой модели. Более того, диапазон фенотипов, продуцируемых мутацией uba-1 , намного шире, чем те, о которых сообщается для инактивации любого отдельного фермента E2 или E3 [55], что согласуется с его участием во множестве путей E2 / E3.Мы четко демонстрируем генетические взаимодействия между uba-1 (it129) и одним путем E3, APC, посредством синтетической эмбриональной летальности с аллелями mat-3 или fzy-1 . Однако дефект оплодотворения, специфичный для сперматозоидов, по-видимому, связан с другим путем E3. Этот фенотип не наблюдается у мутантов APC, но сообщается о мутациях в spe-16 , который, как недавно было определено, кодирует гомолог убиквитинлигазы E3 (Стив Л’Эрно, личное сообщение).

    Некоторые эффекты мутации uba-1 можно интерпретировать в свете разнообразия фенотипов, возникающих в результате потери отдельных активностей E2 или E3. Напр., Эмбриональная и личиночная летальность была описана для ряда гомологов E2 и E3 в крупномасштабных скринингах РНКи [34] — [36]. Однако большинство этих генов не были дополнительно охарактеризованы, и в отсутствие дополнительных сведений о том, какие белки являются субстратами для определенных ферментов E2 и E3, трудно строить предположения о молекулярных механизмах, ответственных за наблюдаемую летальность.

    В других случаях фенотип мутанта uba-1 предполагает ранее не идентифицированную роль убиквитинирования. Размер тела у C. elegans регулируется каноническим путем передачи сигнала TGF-ß, который инициируется лигандом DBL-1 [56], [57]. Компоненты пути TGF-ß у других организмов, как известно, регулируются конъюгацией убиквитина [58]. Различные модификации убиквитина оказывают антагонистическое действие на передачу сигнала: моноубиквитинирование Co-Smad стабилизирует белок и способствует передаче сигналов, в то время как полиубиквитинирование R-Smad приводит к его протеасомной деградации и подавлению передачи сигналов.Учитывая эффекты мутации uba-1 на размер тела C. elegans , кажется вероятным, что компоненты пути DBL-1 / TFG-ß аналогичным образом регулируются убиквитином.

    Спермоспецифическая стерильность uba-1 (it129) в сочетании с недавней идентификацией spe-16 как гомолога убиквитин-лигазы E3 (Стив Л’Эрно, личное сообщение), указывает на ранее не охарактеризованную роль убиквитина. в C. elegans сперматогенез.Известно, что убиквитинирование имеет важное значение для функции сперматозоидов у самых разных организмов, и роли в сперматогенезе млекопитающих включают регуляцию мейотического клеточного цикла, модификацию гистонов и ремоделирование хроматина, сортировку белков во время дифференциации сперматозоидов и контроль качества дефектных сперматозоидов [59] — [62]. У C. elegans на ранние события, такие как мейоз, по-видимому, не влияет мутация uba-1 (it129) , предполагая, что бесплодие этих морфологически нормальных сперматозоидов происходит из-за более позднего дефекта в развитии сперматозоидов.Аналогично сперматозоидам млекопитающих, убиквитинирование в C. elegans может функционировать в сортировке белков, когда сперматиды отделяются от остаточного тела. Известно, что ошибки в этом процессе отрицательно влияют на функцию сперматозоидов: мутация spe-15 , кодирующая гомолог миозина, нарушает асимметричную сегрегацию белков во время почкования сперматид и вызывает специфическую стерильность сперматозоидов [63]. С другой стороны, убиквитинирование может способствовать протеасомной деградации белка, который ингибирует оплодотворение, а снижение активности UBA-1 может привести к несоответствующей персистенции предлагаемого ингибитора.Активация сперматид и последующие события происходят в отсутствие синтеза нового белка, поэтому деградация уже существующих компонентов является вероятным механизмом регуляции. Другая возможность заключается в том, что бесплодие uba-1 (it129) может отражать роль убиквитин-опосредованного протеолиза во взаимодействии сперматозоидов и ооцитов. Оплодотворение у асцидий опосредуется внеклеточным ферментом из сперматозоидов, который конъюгирует убиквитин с рецептором сперматозоидов на поверхности яйца, что приводит к его деградации через протеасомы [64].Постоянный анализ предназначен для определения правильности одной (или нескольких) из этих гипотез.

    Множественные лигазы E3 участвуют в формировании репродуктивных структур мужского хвоста, поэтому дефекты, наблюдаемые у мутантных самцов uba-1 , могут возникать из-за нарушения одного или нескольких известных путей убиквитинирования. Мутация mat-1 , которая кодирует CDC27 субъединицу APC, вызывает уменьшение размера веерных и сенсорных лучей, аналогично дефекту, производимому uba-1 (it129) [29].Гетерохронный ген lin-41 , который кодирует гомолог подкласса RING finger лигаз E3, также необходим для правильного формирования мужского хвоста. Снижение функции LIN-41 вызывает преждевременное втягивание мужского хвоста, так что веер и лучи уменьшаются или отсутствуют [65], [66]. Путь DBL-1 / TGF-ß (упомянутый выше), который определяет размер тела, также играет роль в формировании спикул [67] и может быть вовлечен в фенотип выступающих спикул у мужчин uba-1 (it129) .

    Поздний паралич и связанная с ним летальность, вызванная мутацией uba-1 (it129) , необычны в двух отношениях: он специфичен для пола, затрагивает только мужчин и может быть вызван после завершения всего соматического развития. Имеется немного сообщений о таких пост-онтогенетических фенотипах для C. elegans , и это свойство указывает на дефект в поддержании нейрональной и / или мышечной функции, а не на ее установление. Роль убиквитинирования в нервно-мышечной активности C. elegans сообщалась ранее.Множественные ферменты, конъюгирующие с E2, участвуют в агрегации полиглутаминового белка в мышцах [68]. Комплексы лигазы E3, которые, как было продемонстрировано, влияют на мышечную или нейрональную функцию, включают CHN-1 / UDF-2, APC, KEL-8 / CUL-3, SCF / FSN-1 / RPM-1, SCF / LIN-23 и SCF / SEL-10 [15], [16], [69] — [72]. Однако паралич uba-1 (it129) мужчин отличается от более тонких нервно-мышечных дефектов, о которых сообщалось для других компонентов пути убиквитина, таких как APC (уменьшение продолжительности движения вперед) или KEL-8 / CUL-3 (изменения носа. сенсорная реакция и частота спонтанного разворота) [15], [16].Более того, функциональная роль всех этих ферментов была продемонстрирована у гермафродитов, поэтому специфичное для пола убиквитинирование, которое отвечает за мужской паралич, еще предстоит выяснить.

    Почему специфические для мужчин процессы, включая дефект фертильности мужской гаметы (то есть сперматозоидов), так остро чувствительны к уровню активности UBA-1? Одна интригующая возможность связана с недавно обнаруженной ролью убиквитин-опосредованного протеолиза в пути определения пола. Фактор транскрипции TRA-1 является критическим регулятором определения пола соматической и зародышевой линии и действует в первую очередь как ингибитор мужской половой судьбы [73].Три белка FEM негативно регулируют активность TRA-1 и тем самым способствуют судьбе мужских клеток, включая развитие сперматозоидов у гермафродитов [74]. Старостина и др. [12] демонстрируют, что белки FEM образуют комплекс убиквитин-лигазы E3 с CUL-2, который связывается с протеасомозависимой деградацией TRA-1 и способствует ее разрушению. Предполагается, что нарушение функции UBA-1 в результате мутации приведет к снижению активности комплекса FEM / CUL-2 E3, что приведет к увеличению уровней TRA-1, что будет ингибировать процессы развития мужчин.Этот слабо феминизирующий эффект может действовать синергетически с одним или несколькими путями E3, описанными выше. Если эта гипотеза верна, то некоторые из половых дефектов мутации uba-1 могут быть подавлены снижением активности TRA-1.

    Наблюдение за синтетической эмбриональной летальностью между uba-1 (it129) и мутациями в компонентах APC предлагает мощный подход для идентификации новых функций нижестоящих компонентов пути убиквитина.Ряд гомологов E2 и E3 обнаруживают фенотипы, обнаруживаемые при скрининге РНКи в масштабе генома, но большинство из них неотличимы от дикого типа [34], [35]. Одно из возможных объяснений состоит в том, что многие из этих ферментов функционально избыточны, и что определение их роли потребует инактивации нескольких E2 или E3. Альтернативно, в некоторых случаях снижение уровней E2 или E3 с помощью RNAi может быть недостаточным для нарушения функции. Однако мутация uba-1 обеспечивает сенсибилизированный генетический фон для обнаружения пониженной активности нижестоящих ферментов.Повторный анализ с помощью РНКи-скрининга гомологов E2 и E3 в мутантном штамме uba-1 , вероятно, выявит новые функции для ряда тех генов, роль которых в настоящее время неизвестна.

    Материалы и методы

    Генетика

    Штаммы C. elegans были получены из изолята дикого типа N2 (Bristol) и содержали одну или несколько из следующих мутаций: uba-1 (it129) IV , uba-1 (ok1374) IV , dpy-20 (e1282) IV , fem-1 (hc17) IV , fem-3 (q20) IV , him-5 (e1490) V , mat-3 (or180) III , fzy-1 (h2983) II , spe-26 (it112) или дефицит хромосомы IV eDf19 или mDf7 .Связанный двойной мутантный штамм uba-1 (it129) dpy-20 (e1282) был создан для облегчения различения гомозиготных и гетерозиготных линий в некоторых экспериментах. Интегрированная трансгенная линия oma-1 :: GFP была сконструирована Рейлингом Лином [54]. Штаммы поддерживали на чашках NGM, засеянных штаммом OP50 E. coli . Синхронизированные по возрасту популяции эмбрионов были получены обработкой беременных гермафродитов гипохлоритом натрия. Штаммы поддерживали при 15 ° C и сдвигали до 25 ° C, как указано для фенотипического анализа.Генетические манипуляции проводили по Бреннеру [75].

    Микроскопия

    Микроскопию выполняли с помощью Olympus BX51TF или Zeiss Axio Imager, оснащенного объективами Nomarski DIC и соответствующими наборами фильтров для флуоресцентной визуализации и охлаждаемой камерой CCD для захвата изображения. Изображения были обработаны с помощью пакета AxioVision (выпуск 4.6) и подготовлены к публикации с помощью Adobe Photoshop CS v. 9.0.2. Интактных животных обычно помещали на подушечки из 2% агарозы для визуализации.Длина тела измерялась по полученным изображениям с использованием программного обеспечения ImageJ v. 1.38.

    Анализы спермы

    Морфологию сперматозоидов оценивали путем отделения гонад от взрослых гермафродитов или самцов в среде SM [43]. Морфологию ядерной ДНК визуализировали окрашиванием DAPI сперматозоидов из рассеченных гонад. In vitro активация мужских сперматид проводилась обработкой монензином на предметных стеклах, покрытых полилизином [43]. Подвижность и локализацию сперматозоидов-гермафродитов определяли у интактных животных путем фиксации и окрашивания DAPI с последующим подсчетом числа ядер сперматозоидов в сперматеке и матке.Перенос сперматозоидов был подтвержден при витальном окрашивании самцов [76] митохондриальным красителем MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes), затем скрещивании с неокрашенными гермафродитами, анестезированными трикаином и тетрамизолом. Через 12 или 24 ч флуоресцентно меченную мужскую сперму в репродуктивном тракте гермафродита визуализировали под микроскопом с использованием родаминовых фильтров. Самостоятельную фертильность гермафродитов оценивали, перемещая отдельных животных L3 на температуру 25 ° C и подсчитывая весь размер выводка. Перекрестную фертильность самцов определяли путем спаривания с отдельными гермафродитами дикого типа или самками fem-1 (hc17) , затем подсчитывая количество потомков самцов и гермафродитов, произведенных каждым животным после спаривания.

    Клонирование и молекулярный анализ

    Мутация uba-1 (it129) была локализована на хромосоме IV между elt-1 и dpy-20 путем трехфакторного скрещивания. Однонуклеотидные полиморфизмы, которые влияют на сайты рестрикции (snip-SNP), использовали в качестве маркеров физического картирования индивидуальных рекомбинантов uba-1 (it129) dpy-20 (e1282) с гавайским штаммом CB4856 [44]. Картирование дефицита проводили путем тестирования комплементации в гетерозиготных штаммах uba-1 (it129) / Df .РНКи генов-кандидатов выполняли путем кормления [77] и оценивали по фенокопии эмбриональной летальности F1 для обработанных взрослых гермафродитов и по дефектам морфологии взрослого хвоста для обработанных самцов L3. Комплементация аллеля с делецией uba-1 (ok1374) была определена путем создания гетерозиготных животных it129 / ok1374 и проведения анализов температурного сдвига, как описано для фенотипической характеристики. Спасение трансформации [49] было получено с помощью микроинъекции в зародышевую линию 6.Геномный фрагмент 0 kb гена uba-1 дикого типа, смешанный с плазмидой pRF4, которая содержит доминантный роликовый маркер rol-6 (su1006) , и линеаризованную геномную ДНК N2 в концентрациях 1, 50 и 100 мкг / мл соответственно. Стабильные роликовые трансгенные линии получали из uba-1 (it129) гермафродитов, поддерживаемых при 15 ° C, затем оценивали спасение спермоспецифической стерильности и эмбриональную летальность после перехода на 25 ° C.

    Молекулярное поражение аллеля uba-1 (it129) было идентифицировано с помощью ПЦР-амплификации аллеля 6.0 Kb uba-1 геномный интервал мутантных червей с последующим определением последовательности. Гибридизацию in situ для экспрессии зародышевой линии uba-1 проводили на рассеченных гонадах после фиксации [78]. Меченые дигоксигенином одноцепочечные смысловые и антисмысловые зонды были получены из фрагмента кДНК размером 1 т.п.н. линейной амплификацией в соответствии с протоколом производителя (Roche, Indianapolis, IN). После гибридизации обнаружение зонда проводили с помощью колориметрического анализа с использованием конъюгированных с щелочной фосфатазой антител к дигоксигенину и субстрата NBT / BCIP.

    Вестерн-блот анализ проводили на растворимых лизатах червей синхронизированных по возрасту молодых взрослых гермафродитов, сдвинутых на 25 ° в виде личинок L2. Лизаты получали с помощью одного цикла замораживания-оттаивания, гомогенизации и центрифугирования в течение 10 минут при 10000 RCF. Концентрацию белка в растворимой фракции определяли количественно с помощью анализа Брэдфорда. Образцы по 10 мкг фракционировали с помощью SDS-PAGE и переносили на мембраны из ПВДФ. Конъюгированные с убиквитином белки детектировали с помощью мышиных моноклональных антител против убиквитина (1 °), а затем с помощью конъюгированных с HRP поликлональных антител козы против IgG мыши (2 °; оба Stressgen, Ann Arbor, MI).Двойные гели окрашивали Gelcode Blue (Pierce, Rockford, IL) для визуализации общего белка.

    Благодарности

    Мы хотим поблагодарить Дайан Шейкс за выделение и Сэма Уорда за предоставление аллеля uba-1 (it129) , Майкла Ститцеля из лаборатории Джеральдин Сейду за предоставление штамма oma-1 :: GFP , Генетический центр Caenorhabditis и C.elegans Gene Knockout Consortium за предоставление штаммов, Энди Голден за предоставление штаммов и предложение синтетического летального эксперимента, Юджина Меламуда за помощь в структурном прогнозировании, Сару Хапип за помощь в скрининге кандидатов на РНКи, а также членов лаборатории и Балтимора / Вашингтонскому червячному сообществу за плодотворные обсуждения.

    Вклад авторов

    Задумал и спроектировал эксперименты: MK HES. Проведены опыты: МК ГЭС. Проанализированы данные: МК ГЭС. Написал бумагу: МК ГЭС.

    Ссылки

    1. 1. Хершко А., Цехановер А. (1998) Система убиквитина. Анну Рев Биохим 67: 425–479.
    2. 2. Накаяма К.И., Накаяма К. (2006) Убиквитин-лигазы: контроль клеточного цикла и рак. Нат Рев Рак 6: 369–381.
    3. 3. Ardley HC, Robinson PA (2004) Роль убиквитин-протеиновых лигаз в нейродегенеративных заболеваниях.Neurodegener Dis 1: 71–87.
    4. 4. Schnell JD, Hicke L (2003) Нетрадиционные функции убиквитина и убиквитин-связывающих белков. J Biol Chem 278: 35857–35860.
    5. 5. Haglund K, Dikic I (2005) Убиквитилирование и передача сигналов клеток. EMBO J 24: 3353–3359.
    6. 6. Mukhopadhyay D, Riezman H (2007) Независимые от протеасомы функции убиквитина в эндоцитозе и передаче сигналов. Наука 315: 201–205.
    7. 7. Geetha T, Kenchappa RS, Wooten MW, Carter BD (2005) TRAF6-опосредованное убиквитинирование регулирует ядерную транслокацию NRIF, взаимодействующего с рецептором p75.EMBO J 24: 3859–68.
    8. 8. Чиу Р.К., Брун Дж., Рамаекерс К., Тейс Дж., Вен Л и др. (2006) Lysine 63-polyubiquitination gurads против мутаций, индуцированных трансфузионным синтезом. PLoS Genet 2: e116.
    9. 9. Lim KL, Chew KC, Tan JM, Wang C, Chung KK и др. (2005) Паркин опосредует неклассическое, протеасомно-независимое убиквитинирование синфилина-1: последствия для образования телец Леви. J Neurosci 25: 2002–2009.
    10. 10. Hershko A, Heller H, Elias S, Ciechanover A (1983) Компоненты системы убиквитин-протеин-лигаза Разрешение, аффинная очистка и роль в распаде белка.J Biol Chem 258: 8206–8214.
    11. 11. Джексон П.К., Элдридж А.Г., Фрид Э., Фурстенталь Л., Хсу Дж.Й. и др. (2000) История колец: распознавание субстрата и катализ убиквитинлигазами. Тенденции Cell Biol 10: 429–439.
    12. 12. Старостина Н.Г., Лим Дж. М., Шварцштейн М., Уэллс Л., Спенс А. М. и др. (2007) Убиквитинлигаза CUL-2, содержащая три белка FEM, разрушает TRA-1, регулируя определение пола C. elegans . Dev Cell 13: 127–129.
    13. 13.Feng H, Zhong W, Punkosdy G, Gu S, Zhou L и др. (1999) CUL-2 необходим для фазового перехода G1-to-S и конденсации митотических хромосом у Caenorhabditis elegans . Nat Cell Biol. 1: 486–492.
    14. 14. Burbea M, Dreier L, Dittman JS, Grunwald ME, Kaplan JM (2002) Убиквитин и AP180 регулируют количество рецепторов глутамата GLR-1 в постсинаптических элементах в C. elegans . Нейрон 35: 107–120.
    15. 15. Juo P, Kaplan JM (2004) Комплекс, стимулирующий анафазу, регулирует количество рецепторов глутамата GLR-1 в вентральном нервном канатике C.elegans. Curr Biol 14: 2057–2062.
    16. 16. Schaefer H, Rongo C (2006) KEL-8 является субстратным рецептором для CUL-3-зависимой убиквитинлигазы, которая регулирует оборот синаптического рецептора глутамата. Mol Cell Biol 17: 1250–1260.
    17. 17. Frazier T, Shakes D, Hota U, Boyd L (2004) Caenorhabditis elegans UBC-2 функционирует с комплексом, способствующим анафазе, но также имеет другие активности. J Cell Sci 117: 5427–5435.
    18. 18. Bowerman B, Kurz T (2006) Degrade to create: требования развития для убиквитин-опосредованного протеолиза во время ранней стадии C.elegans эмбриогенез. Развитие 133: 773–784.
    19. 19. Golden A, Sadler PL, Wallenfang MR, Schumacher JM, Hamill DR и др. (2000) Переходно-дефектные мутанты от метафазы к анафазе ( mat ) у Caenorhabditis elegans . J Cell Biol 151: 1469–1482.
    20. 20. Дэвис Э.С., Вилле Л., Честнат Б.А., Сэдлер П.Л., Шейкс Д.К. и др. (2002) Множественные субъединицы комплекса Caenorhabditis elegans анафазы необходимы для сегрегации хромосом во время мейоза I.Генетика 160: 805–813.
    21. 21. Bosu DR, Kipreos ET (2008) Убиквитин-лигазы Cullin-RING: глобальные циклы регуляции и активации. Ячейка Div 3: 7.
    22. 22. Пинтар Л., Уиллис Дж. Х., Виллемс А., Джонсон Дж. Л., Срайко М. и др. (2003) Белок BTB MEL-26 является субстрат-специфическим адаптером убиквитин-лигазы CUL-3. Природа 425: 311–316.
    23. 23. Xu L, Wei Y, Reboul J, Vaglio P, Shin TH и др. (2003) Белки BTB являются субстрат-специфическими адаптерами в SCF-подобной модульной убиквитинлигазе, содержащей CUL-3.Природа 425: 316–321.
    24. 24. Kemphues KJ, Wolf N, Wood WB, Hirsh D (1986) Два локуса, необходимые для цитоплазматической организации у ранних эмбрионов Caenorhabditis elegans . Дев Биол 113: 449–460.
    25. 25. Sonneville R, Gonczy P (2004) Zyg-11 и cul-2 регулируют прогрессию через мейоз II и установление полярности у C. elegans . Развитие 131: 3527–3543.
    26. 26. Liu J, Vasudevan S, Kipreos ET (2004) CUL-2 и ZYG-11 способствуют мейотической анафазе II и правильному размещению передне-задней оси в C.elegans . Разработка 131: 3513–3525.
    27. 27. DeRenzo C, Reese KJ, Seydoux (2003) Исключение белков зародышевой плазмы из соматических клонов путем cullin-зависимой деградации. Природа 424: 685–689.
    28. 28. Rappleye CA, Tagawa A, Lyczak R, Bowerman B, Aroian RV (2002) Комплекс, стимулирующий анафазу, и сепарин необходимы для формирования передне-задней оси эмбриона. Dev Cell 2: 195–206.
    29. 29. Shakes DC, Sadler PL, Schumacher JM, Abdolrasulnia M, Golden A (2003) Дефекты развития, наблюдаемые у гипоморфных мутантов, способствующих анафазе, связаны с аномалиями клеточного цикла.Развитие 130: 1605–1620.
    30. 30. Finley D, Ciechanover A, Varshavsky A (1984) Термолабильность убиквитин-активирующего фермента из мутанта клеточного цикла млекопитающих ts85. Ячейка 37: 43–55.
    31. 31. Ciechanover A, Finley D, Varshavsky A (1984) Убиквитиновая зависимость селективной деградации белка, продемонстрированная в мутанте ts85 клеточного цикла млекопитающих. Cell 37: 57–66.
    32. 32. Ghaboosi N, Deshaies RJ (2007) Условный мутант дрожжей E1 блокирует путь убиквитин-протеасома и обнаруживает роль конъюгатов убиквитина в нацеливании Rad23 на протеасому.Mol Biol Cell 18: 1953–1963.
    33. 33. Ли ТВ, Дин Т., Чен З., Раджендран В., Шерр Х. и др. (2008) E1-убиквитин-активирующий фермент Uba1 у Drosophila автономно контролирует апоптоз и неавтономно рост тканей. Развитие 135: 43–52.
    34. 34. Jones D, Crowe E, Stevens TA, Candido EP (2002) Функциональный и филогенетический анализ системы убиквитилирования в Caenorhabditis elegans : убиквитин-конъюгирующие ферменты, убиквитин-активирующие ферменты и убиквитин-подобные белки.Genome Biol 3: RESEARCH00021-15.
    35. 35. Камат Р.С., Фрейзер А.Г., Донг Й., Пулин Г., Дурбин Р. и др. (2003) Систематический функциональный анализ генома Caenorhabditis elegans с использованием РНКи. Природа 421: 231–237.
    36. 36. Сонничсен Б., Коски Л. Б., Уолш А., Маршал П., Нойман Б. и др. (2005) Полногеномное профилирование РНКи раннего эмбриогенеза у Caenorhabditis elegans. Природа 434: 462–469.
    37. 37. Hodgkin JA, Horvitz HR, Brenner S (1979) Неразрывные мутанты нематоды Caenorhabditis elegans .Генетика 91: 67–94.
    38. 38. Ward S, Carrel JS (1979) Оплодотворение и конкуренция сперматозоидов у нематоды Caenorhabditis elegans . Дев Биол 73: 304–321.
    39. 39. Wolf N, Hirsh D, McIntosh JR (1978) Сперматогенез у самцов свободноживущей нематоды, Caenorhabditis elegans . J Ultrastruct Res 63: 155–169.
    40. 40. Ward S, Argon Y, Nelson GA (1981) Морфогенез сперматозоидов у мутантов Caenorhabditis elegans дикого типа и мутантов с дефектом оплодотворения.J Cell Biol 91: 26–44.
    41. 41. Нельсон Г.А., Уорд С. (1980) Слияние везикул, расширение псевдоподов и подвижность амебов индуцируются в сперматидах нематод ионофором монензином. Cell 19: 457–464.
    42. 42. Уорд С., Хоган Э., Нельсон Г. А. (1983) Инициирование спермиогенеза у нематоды Caenorhabditis elegans. Дев Биол 98: 70–79.
    43. 43. Shakes DC, Ward S (1989) Инициирование спермиогенеза у C. elegans : фармакологический и генетический анализ.Дев Биол 134: 189–200.
    44. 44. Wicks SR, Yeh RT, Gish WR, Waterston RH, Plasterk RH (2001) Быстрое картирование генов в Caenorhabditis elegans с использованием карты полиморфизма высокой плотности. Нат Генет 28: 160–164.
    45. 45. Hirsh D, Oppenheim D, Klass M (1976) Развитие репродуктивной системы Caenorhabditis elegans . Дев Биол 49: 200–219.
    46. 46. Berry LW, Westlund B, Schedl T (1997) Образование опухоли зародышевой линии, вызванное активацией glp-1 , члена Caenorhabditis elegans семейства рецепторов Notch.Разработка 124: 925–936.
    47. 47. Francis R, Barton MK, Kimble J, Schedl T (1995) gld-1 , ген-супрессор опухоли, необходимый для развития ооцитов у Caenorhabditis elegans . Генетика 139: 579–606.
    48. 48. Subramanian K, Seydoux G (2003) Дедифференцировка первичных сперматоцитов в опухоли зародышевых клеток у C. elegans , лишенных пумилиоподобного белка PUF-8. Curr Biol 13: 134–139.
    49. 49. Mello CC, Kramer JM, Stinchcomb D, Ambros V (1991) Эффективный перенос генов в C.elegans : внехромосомное поддержание и интеграция трансформирующих последовательностей. EMBO J 10: 3959–3970.
    50. 50. Маккей С.Дж., Джонсен Р., Хаттра Дж., Асано Дж., Бэйли Д.Л. и др. (2004) Профили экспрессии генов клеток, тканей и стадий развития нематоды C. elegans . Колд-Спринг-Харб Symp Quant Biol 68: 159–169.
    51. 51. Lois LM, Lima CD (2005) Структуры SUMO E1 обеспечивают механистическое понимание активации SUMO и рекрутирования E2 в E1.EMBO J 24: 439–451.
    52. 52. Walden H, Podgorski MS, Schulman BA (2003) Понимание каскада переноса убиквитина из структуры активирующего фермента для NEDD8. Природа 422: 330–334.
    53. 53. Kitagawa R, Law E, Tang L, Rose AM (2002) Гомолог Cdc20, FZY-1, и его взаимодействующий белок, IFY-1, необходимы для правильной сегрегации хромосом у Caenorhabditis elegans . Curr Biol 12: 2118–2123.
    54. 54. Lin R (2003) Мутация увеличения функции в oma-1 , C.elegans , необходимый для созревания ооцитов, приводит к замедленной деградации материнских белков и гибели эмбрионов. Дев Биол 258: 226–239.
    55. 55. Kipreos ET, C. elegans Research Community, редакторы (2005) Пути, опосредованные убиквитином. WormBook. Доступно: http://www.wormbook.org.
    56. 56. Savage C, Das P, Finelli AL, Townsend SR, Sun CY и др. (1996) Caenorhabditis elegans гены sma-2 , sma-3 и sma-4 определяют консервативное семейство компонентов пути трансформирующего фактора роста бета.Proc Natl Acad Sci U S A 93: 790–794.
    57. 57. Сузуки Ю., Янделл, доктор медицины, Рой П.Дж., Кришна С., Сэвидж-Данн С. и др. (1999) Гомолог BMP действует как дозозависимый регулятор размера тела и паттерна мужского хвоста у Caenorhabditis elegans . Развитие 126: 241–250.
    58. 58. Itoh S, ten Dijke P (2007) Отрицательная регуляция передачи сигнала рецептора TGF-бета / Smad. Curr Opin Cell Biol 19: 176–184.
    59. 59. Baarends WM, Hoogerbrugge JW, Roest HP, Ooms M, Vreeburg J, et al.(1999) Убиквитинирование гистонов и ремоделирование хроматина в сперматогенезе мышей. Дев Биол 207: 322–333.
    60. 60. Сутовский П., Морено Р., Рамальо-Сантос Дж., Доминко Т., Томпсон В.Е. и др. (2001) Предполагаемый убиквитин-зависимый механизм распознавания и устранения дефектных сперматозоидов в придатке яичка млекопитающих. J Cell Sci 114: 1665–1675.
    61. 61. Guardavaccaro D, Kudo Y, Boulaire J, Barchi M, Busino L и др. (2003) Контроль мейотической и митотической прогрессии с помощью белка F-бокса бета-Trcp1 in vivo.Dev Cell 4: 799–812.
    62. 62. Морокума Ю., Накамура Н., Като А., Нотоя М., Ямамото Ю. и др. (2007) MARCH-XI, новая трансмембранная убиквитинлигаза, участвующая в убиквитин-зависимом сортировке белков в развивающихся сперматидах. J Biol Chem 282: 24806–24815.
    63. 63. Kelleher JF, Mandell MA, Moulder G, Hill KL, L’Hernault SW и др. (2000) Myosin VI необходим для асимметричной сегрегации клеточных компонентов во время сперматогенеза C. elegans .Curr Biol 10: 1489–1496.
    64. 64. Sawada H, Sakai N, Abe Y, Tanaka E, Takahashi Y и др. (2002) Внеклеточное убиквитинирование и опосредованная протеасомами деградация рецептора асцидиевой спермы. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 1223–1228.
    65. 65. Slack FJ, Basson M, Liu Z, Ambros V, Horvitz HR и др. (2000) Ген lin-41 RBCC действует в гетерохронном пути C. elegans между регуляторной РНК let-7 и фактором транскрипции LIN-29.Mol Cell 5: 659–669.
    66. 66. del Rio-Albrechtsen T, Kiontke K, Chiou SY, Fitch DH (2006) Новые аллели усиления функции демонстрируют роль гетерохронного гена lin-41 в морфогенезе кончика мужского кончика хвоста C. elegans . Дев Биол 297: 74–86.
    67. 67. Baird SE, Ellazar SA (1999) TGFbeta-подобная передача сигналов и развитие спикул у Caenorhabditis elegans . Дев Биол 212: 93–100.
    68. 68. Говард Р.А., Шарма П., Хаджар С., Колдуэлл К.А., Колдуэлл Г.А. и др.(2007) Ферменты, конъюгирующие с убиквитином, участвуют в агрегации полиглутаминового белка. BMC Cell Biol 8: 32.
    69. 69. Хоппе Т., Кассата Дж., Баррал Дж. М., Спрингер В., Хутагалунг А. Х. и др. (2004) Регулирование миозин-направленного шаперона UNC-45 с помощью нового комплекса мультиубиквитилирования E3 / E4 у C. elegans . Cell 118: 337–349.
    70. 70. Liao EH, Hung W, Abrams B, Zhen M (2004) SCF-подобный комплекс убиквитин-лигазы, который контролирует пресинаптическую дифференцировку.Природа 430: 345–350.
    71. 71. Mehta N, Loria PM, Hobert O (2004). Генетический скрининг мутантов роста нейритов у Caenorhabditis elegans обнаруживает новую функцию F-box ubiquitin ligase component LIN-23. Генетика 166: 1253–1267.
    72. 72. Ding M, Chao D, Wang G, Shen K (2007) Пространственная регуляция убиквитинлигазы E3 направляет селективное устранение синапсов. Наука 317: 947–951.
    73. 73. Hodgkin J (1987) Генетический анализ гена, определяющего пол, tra-1 , у нематоды Caenorhabditis elegans .Genes Dev 1: 731–745.
    74. 74. Хансен Д., Пилигрим Д. (1999) Пол и один червь: определение пола у нематоды C. elegans . Механический Дев 83: 3–15.
    75. 75. Бреннер С. (1974) Генетика Caenorhabditis elegans . Генетика 77: 71–94.
    76. 76. Hill KL, L’Hernault SW (2001) Анализ репродуктивных взаимодействий, которые происходят после гетероспецифических спариваний в пределах рода Caenorhabditis . Дев Биол 232: 105–114.
    77. 77. Timmons L, Fire A (1998) Специфическое вмешательство проглоченной дцРНК. Nature 395: 854.
    78. 78. Lee MH, Schedl T, The C. elegans Research Community, editors (2006) RNA in situ гибридизация рассеченных гонад. WormBook. Доступно: http://www.wormbook.org.

    VPAT — Oracle Server E1-2c 1.0

    5 & nbsp. 404 Сохранение информации для обеспечения доступности

    Критерии

    Уровень соответствия

    Примечания и пояснения

    & nbsp 402 Требуется заголовок 61 Функциональная возможность ячейка — ответа не требуется
    & nbsp 402.2 Общие Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    402.2 Речевой вывод включен Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    402.2.1 Информация, отображаемая на экране Неприменимо Продукт не является закрытым оборудованием.
    402.2.2 Транзакционные выходы Неприменимо Продукт не является закрытым оборудованием.
    402.2.3 Тип передачи речи и координация Неприменимо Продукт не является закрытым оборудованием.
    402.2.4 Пользовательский контроль Неприменимо Продукт не является закрытым оборудованием.
    402.2.5 Инструкции по Брайлю Не применимо Продукт не является закрытым оборудованием.
    & nbsp 402,3 Объем Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    402.3.1 Частное прослушивание Неприменимо Продукт не является закрытым оборудованием.
    402.3.2 Неприватное прослушивание Неприменимо Продукт не является закрытым оборудованием.
    402,4 символов на экранах дисплея Неприменимо Продукт не является закрытым оборудованием.
    402,5 символов на знаках переменных сообщений Неприменимо Продукт не является закрытым оборудованием.
    & nbsp 403 Биометрия Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    403.1 Общие Поддерживает

    Продукт был протестирован на:

    Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    404.1 Общие Поддерживает

    Продукт был протестирован для:

    • Продукт не содержит информации о доступности
    405 Конфиденциальность Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — нет требуется
    405.1 Общие Поддерживает

    Продукт был протестирован для:

    • Устройство не имеет встроенного пользовательского интерфейса для ввода или вывода.
    & nbsp 406 Стандартные соединения Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    406.1 Общие Поддерживает

  • Продукт был протестирован для продукта
  • . устройство содержит по крайней мере одно соединение отраслевого стандарта
    & nbsp 407 Рабочие части Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    407.2 Контрастность Не применимо Продукт имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    & nbsp 407.3 Элементы управления вводом Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    407.3.1 Различимо тактильно Неприменимо Продукт имеет предназначенные функции помещения, которые посещает только обслуживающий персонал для обслуживания, ремонта или периодического наблюдения за оборудованием.
    407.3.2 Буквенные клавиши Не применимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.3.3 Цифровые клавиши Не применимо Продукт имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.4 Повтор клавиш Неприменимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407,5 Время реагирования Неприменимо Продукт имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.6 Эксплуатация Неприменимо Продукт имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для технического обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.7 Билеты, платы за проезд и карточки-ключи Не применимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    & nbsp 407,8 Вылет, высота и глубина Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    407.8.1 Вертикальная контрольная плоскость Не применимо Продукт имеет функции находиться в местах, которые посещает только обслуживающий персонал для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.8.1.1 Вертикальная плоскость для бокового вылета Неприменимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.8.1.2 Вертикальная плоскость для прямого действия Не применимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для технического обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.8.2 Вылет сбоку Не применимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.8.2.1 Свободный боковой вылет Не применимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для технического обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.8.2.2 Боковой вылет с препятствиями Неприменимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые посещает только обслуживающий персонал для технического обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.8.3 Прямая досягаемость Не применимо Продукт имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.8.3.1 Беспрепятственный прямой доступ Неприменимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для технического обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.8.3.2 Препятствие для прямого доступа Неприменимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для технического обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    407.8.3.2.1 Эксплуатационная высота части для ИКТ с препятствием для прямого действия Неприменимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для технического обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудование.
    407.8.3.2.2 Пространство для колен и пальцев под ИКТ с ограниченным досягаемостью вперед Неприменимо Устройство имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического наблюдения оборудования.
    & nbsp 408 Экраны дисплея Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    408.2 Видимость Не применимо

    В продукте нет экранов дисплея.

    408.3 Перепрошивка Поддерживает

    Продукт был протестирован на:

    • Индикаторы активности мигают, и эти вспышки имеют значение, указанное в документации к продукту, но ни один из них не мигает более трех раз за 1 секунду .
    & nbsp 409 Индикаторы состояния Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    409.1 Общие Не применимо Изделие имеет функции, предназначенные для размещения в местах, которые часто посещаются только обслуживающим персоналом для обслуживания, ремонта или периодического контроля оборудования.
    & nbsp 410 Цветовое кодирование Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    410.1 Общие Поддерживает

    Информация о продукте протестирована на:

  • 90 передается с использованием цвета
  • & nbsp 411 Звуковые сигналы Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    411.1 Общие Поддерживает

    Этот продукт не передает информацию через аудио.

    & nbsp 41ICT с двусторонней голосовой связью Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    412.2.1 Увеличение громкости для проводных телефонов Не применимо у продукта нет двусторонней голосовой связи
    412.2.2 Увеличение громкости для ИКТ без проводной связи Неприменимо В продукте нет двусторонней голосовой связи
    & nbsp 412.3 Подавление помех и магнитная связь Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    412.3.1 Беспроводные трубки Неприменимо В продукте нет двусторонней голосовой связи
    412.3.2 Проводные телефоны Неприменимо Изделие не поддерживает двустороннюю голосовую связь
    412.4 Цифровое кодирование речи Неприменимо Изделие не поддерживает двустороннюю голосовую связь
    & nbsp 412.5 Текстовые функции в реальном времени [Зарезервировано] Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    412.6 Идентификатор вызывающего абонента Неприменимо Продукт не поддерживает двустороннюю голосовую связь
    412.7 Видеосвязь Неприменимо Продукт не поддерживает двустороннюю голосовую связь
    & nbsp 413 Закрыто Технологии обработки титров Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    413.1.1 Декодирование и отображение скрытых титров Неприменимо В продукте нет мультимедиа.
    413.1.2 Передача данных со скрытыми субтитрами Неприменимо В продукте нет мультимедиа.
    & nbsp 414 Технологии обработки аудио-описаний Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    414.1.1 Цифровой телевизионный тюнер Неприменимо В продукте нет мультимедиа.
    414.1.2 Другое ИКТ Не применимо В продукте нет мультимедиа.
    & nbsp 415 Пользовательские элементы управления для субтитров и аудиоописаний Ячейка заголовка — ответа не требуется Ячейка заголовка — ответа не требуется
    415.1.1 Элементы управления субтитрами Применимо Не применимо Продукт не имеет мультимедиа.
    415.1.2 Элементы управления звуковым описанием Неприменимо В продукте нет мультимедиа.

    Американский журнал акушерства и гинекологии

    Если вы не помните свой пароль, вы можете сбросить его, введя свой адрес электронной почты и нажав кнопку «Сбросить пароль».Затем вы получите электронное письмо, содержащее безопасную ссылку для сброса пароля

    Если адрес совпадает с действующей учетной записью, на __email__ будет отправлено электронное письмо с инструкциями по сбросу пароля

    .
  • Добавить комментарий

    Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *