Е1 манипуляторы: Пожарные рассказали, почему не могли потушить манипулятор в Екатеринбурге на улице Челюскинцев 25 июля 2019 года | e1.ru

Расстояние

Остин, Техас Даллас, Техас

9/7/2021

Желаемое начало

Дата *

07. 09.2021

07.09.20211.10.20225/9/20229/6/2022

07.09.20215/9/20229 / 06.2022

07.09.20215/9/20229/6/2022

07.09.2015/9/20229/6/2022

9/7/20211/10/20229/6/2022

07.09.20211/10/20229/6/2022

7/9 / 20215/9/20229/6/2022

9/7/202 11/10/20229/6/2022

7/9/202 11/10/20229/6 / 2022

07.09.20211.10.20225/9/20229/6/2022

07.09.20211/10/20225/9/20229/6/2022

07.09.20211.10.20225/9/20229/6/2022

06.09.20229.05.2023

07.09.2011 / 20225/9/20229/6/2022

9/7/202 11/10/20229/6/2022

7/9/20211/10/20229/6 / 2022

07. 09.202 11/10/20229/6/2022

07.09.202 11/10/20229/6/2022

9/7/20211/10/20225/9/20229/6/2022

07.09.20211/10/20225/9/20229/6/2022

9/7/20211/10/20225/9/20229/6/2022

07.09.20211/10/20225/9/20229/6/2022

9 / 9/2019

Программа Master of Occupational Therapy (MOT) также предлагается в удобном формате Flex (Online + Weekend Labs на территории кампуса).Проверьте здесь, если вы хотите узнать больше о Flex MOT, предлагаемом в настоящее время в Майами, Остине и Сент-Огастине.

Программа «Доктор физиотерапевт» (DPT) также предлагается в удобном формате Flex (онлайн + лаборатории выходного дня на территории кампуса). Отметьте здесь, если вы хотите узнать больше о Flex DPT, который в настоящее время предлагается в Остине, Сан-Маркосе и Сент-Огастине.

Принадлежности Расширять

Принадлежности

• ¹ Отделение ортодонтических наук, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицинских и стоматологических наук, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
• ² Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
• ³ Отделение ортодонтии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
• ⁴ Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония. Электронный адрес: [email protected].

Элемент в буфере обмена

Мо Сато и др.Biochem Biophys Res Commun. 2018 .

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Принадлежности

• ¹ Отделение ортодонтических наук, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицинских и стоматологических наук, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
• ² Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
• ³ Отделение ортодонтии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония.
• ⁴ Департамент клеточной биологии, Высшая школа медицины и стоматологии, Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония; Центр исследований интеграции мозга (CBIR), Токийский медицинский и стоматологический университет, Токио, 113-8510, Япония. Электронный адрес: [email protected].

Элемент в буфере обмена

Показать варианты

Формат АннотацияPubMedPMID

Абстрактный

Ремоделирование кости поддерживается за счет баланса между образованием кости остеобластами и резорбцией кости остеокластами. Предыдущие исследования показали, что внутриклеточная передача сигналов Ca ²⁺ играет важную роль в дифференцировке остеобластов; однако молекулярный механизм передачи сигналов Ca ²⁺ в дифференцировке остеобластов остается неясным. Чтобы выяснить влияние передачи сигналов Ca ²⁺ в остеобластах, мы использовали оптогенетический инструмент, активируемый синим светом переключатель каналов Ca ²⁺ (BACCS). BACCS использовали для пространственно-временного контроля внутриклеточного Ca ²⁺ с помощью стимуляции синим светом.Клетки MC3T3-E1, которые использовались в качестве модели дифференцировки от преостеобластов к остеобластам, стимулировались к дифференцировке за счет экспрессии BACCS и ритмической стимуляции синим светом. Результаты показали, что внутриклеточное изменение Ca ²⁺ извне клеток может регулировать передачу сигналов для дифференцировки клеток MC3T3-E1. Наши результаты подтверждают, что Ca ²⁺ может вызывать дифференцировку остеобластов.

Ключевые слова: Дифференциация; Передача сигналов внутриклеточного Ca (2+); Оптогенетика; Остеобласт.

Авторские права © 2018 Elsevier Inc. Все права защищены.

Похожие статьи

• Световая генерация внутриклеточных сигналов Ca (2+) генетически кодируемым белком BACCS.

  Исии Т., Сато К., Какумото Т., Миура С., Тухара К., Такеучи С., Наката Т. Исии Т. и др. Nat Commun. 2015 18 августа; 6: 8021. DOI: 10.1038 / ncomms9021. Nat Commun. 2015 г. PMID: 26282514 Бесплатная статья PMC.

• Удаление Orai1 изменяет экспрессию нескольких генов во время созревания остеокластов и остеобластов.

  Хван С.Ю., Фоли Дж., Нумага-Томита Т., Петранка Дж. Г., Птица Г.С., Патни Дж. У. мл. Hwang SY, et al. Клеточный кальций. 2012 декабрь; 52 (6): 488-500. DOI: 10.1016 / j.ceca.2012.10.001. Epub 2012 31 октября.Клеточный кальций. 2012 г. PMID: 23122304 Бесплатная статья PMC.

• Роль белка лизосомального канала TPC2 в дифференцировке остеокластов и ремоделировании костей в нормальных условиях и условиях с низким содержанием магния.

  Нотоми Т., Куно М., Хияма А., Нодзаки Т., Охура К., Эзура Ю., Нода М. Notomi T, et al. J Biol Chem. 2017 22 декабря; 292 (51): 20998-21010. DOI: 10.1074 / jbc.M117.780072.Epub 2017 30 октября. J Biol Chem. 2017 г. PMID: 244 Бесплатная статья PMC.

• Передача сигналов кальция в дифференцировке остеокластов и резорбции кости.

  Каджиа Х. Каджа Х. Adv Exp Med Biol. 2012; 740: 917-32. DOI: 10.1007 / 978-94-007-2888-2_41. Adv Exp Med Biol. 2012 г. PMID: 22453976 Рассмотрение.

• [Разработка и применение оптогенетических средств].

  Вэй Цюй, Сюй Ц., Ван М., Е Х. Вэй Кью и др. Шэн У Гун Чэн Сюэ Бао. 2019 25 декабря; 35 (12): 2238-2256. DOI: 10.13345 / j.cjb.1

. Шэн У Гун Чэн Сюэ Бао. 2019. PMID: 31880133 Рассмотрение. Китайский язык.

Типы публикаций

• Поддержка исследований, за пределами США. Правительство

Условия MeSH

• Кальциевые каналы / метаболизм *
• Внутриклеточное пространство / метаболизм
• Стробирование ионных каналов * / радиационные эффекты

цитировать

Формат: AMA APA ГНД NLM

35 U.

Первый абзац данного раздела носит декларативный характер и определяет нарушение.

Пункты (b) и (c) определяют и ограничивают сопутствующее нарушение патента, а пункт (d) является вспомогательным по отношению к этим параграфам, см. Предварительное общее описание законопроекта. Тот, кто активно побуждает к нарушению, содействуя и подстрекательствуя к нему, несет ответственность как нарушитель, равно как и тот, кто продает составную часть запатентованного изобретения или материал или устройство для использования в нем, зная, что то же самое должно быть специально изготовлено или специально адаптировано для использования. в случае нарушения патента, за исключением случаев использования основного продукта или коммерческого товара для других целей.Не считается, что патентообладатель злоупотребил своим патентом только по причине того, что он сделал что-либо, разрешенное разделом.

Редакционные примечания

Федеральный закон о пищевых продуктах, лекарствах и косметических средствах, упомянутый в подст. (e) (1), (2), закон от 25 июня 1938 г., гл. 675, 52 Стат. 1040, который обычно классифицируется по главе 9 (§301 и последующие) Раздела 21, Продукты питания и лекарства. Разделы 505 и 512 Закона подразделяются на разделы 355 и 360b, соответственно, Раздела 21.Для полной отнесения этого Закона к Кодексу см. Раздел 301 Раздела 21 и Таблицы.

Закон от 4 марта 1913 г., упомянутый в пп. (e) (1), (2), закон от 4 марта 1913 г., гл. 145, 37 Стат. 828. Положения такого закона, касающиеся вирусов и т. Д., Применимые к домашним животным, широко известные как Закон о вирусах, сыворотках и токсинах, содержатся в восьмом параграфе под заголовком «Бюро животноводства» закона от 4 марта. , 1913, на 37 стат. 832 и обычно относятся к главе 5 (§151 и след.) Раздела 21, Продукты питания и лекарства. Для полной отнесения этого Закона к Кодексу см. Примечание к Краткому названию, изложенное в разделе 151 Раздела 21 и Таблицах.

Раздел 351 Закона об общественном здравоохранении, упомянутый в подст. (e) (2) (C), (4) (D), (6) (A), (C), относится к разделу 262 Раздела 42 «Общественное здравоохранение и благосостояние».

2010 — Подст. (д) (2). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (A) (iv), в заключительных положениях заменили «ветеринарный биологический продукт или биологический продукт» на «или ветеринарный биологический продукт».

Подсек. (e) (2) (C). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (A) (i) — (iii), добавлен подпункт. (С).

Подсек. (д) (4). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (B) (iv), в заключительных положениях заменены «(C) и (D)» на «и (C)».

Подсек. (д) (4) (В). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (B) (i), заменил «ветеринарный биологический продукт или биологический продукт» на «или ветеринарный биологический продукт» и вычеркнул «и» в конце.

Подсек. (e) (4) (C). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (B) (ii), заменены «ветеринарный биологический продукт или биологический продукт» на «или ветеринарный биологический продукт» и «и» на конец периода.

Подсек. (e) (4) (D). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (B) (iii), добавлен подпункт. (D).

Подсек. (д) (6). Паб. L. 111–148, §7002 (c) (1) (C), добавлен п. (6).

2003 — п. (д) (5). Паб. Л. 108–173 доп. П. (5).

1994 — пп. (а). Паб. L. 103–465, §533 (a) (1), после слов «использует» и «или импортирует в США любое запатентованное изобретение» после слов «Соединенные Штаты» вставлено «предлагает к продаже».

Подсек. (c). Паб. L. 103–465, §533 (a) (2), заменил «предложения о продаже или продаже в Соединенных Штатах или импорт в Соединенные Штаты» на «продажи».

Подсек. (д) (1). Паб. L. 103–465, §533 (a) (3) (A), заменено «предложение продать или продать в Соединенных Штатах или импортировать в Соединенные Штаты» на «или продать».

Подсек. (д) (3). Паб. L. 103–465, §533 (a) (3) (B), заменено «предложение на продажу или продажа в Соединенных Штатах или импорт в Соединенные Штаты» на «или продажа».

Подсек. (e) (4) (B), (C). Паб. L. 103–465, §533 (a) (3) (C), (D), заменено «предложение о продаже или продаже в Соединенных Штатах или ввоз в Соединенные Штаты» на «или продажа».

Подсек. (грамм). Паб. L. 103–465, §533 (a) (4), заменены «предложения о продаже, продажа» на «продает», «импорт, предложение о продаже, продажа» на «импорт, продажа» и «другое использовать, предлагать к продаже или »для« другого использования или ».

Подсек. (я). Паб. L. 103–465, §533 (a) (5), добавлен подст. (я).

1992 — п. (час). Паб. Л. 102–560 добавлен пп. (час).

1988 — п. (г). Паб. Л. 100–703 доп. Кл. (4) и (5).

Подсек. (д) (1). Паб. L. 100–670, §201 (i) (1), вставлен «который в основном производится с использованием рекомбинантной ДНК, рекомбинантной РНК, гибридомной технологии или других процессов, включающих методы сайт-специфических генетических манипуляций» после «4 марта 1913 г.)» и «Или ветеринарные биологические продукты» после «продажа лекарств».

Подсек. (д) (2). Паб. L. 100–670, §201 (i) (2), пар. (2) в общем. До внесения изменений в п. (2) гласит следующее: «Подача заявки в соответствии с разделом 505 (j) Федерального закона о пищевых продуктах, лекарствах и косметических средствах или описанным в разделе 505 (b) (2) такого Закона является актом нарушения прав. лекарство, заявленное в патенте, или использование которого заявлено в патенте, если целью такого представления является получение разрешения в соответствии с таким Законом на коммерческое производство, использование или продажу лекарственного средства, заявленного в патенте или использование которых заявлено в патенте до истечения срока действия такого патента.”

Подсек. (д) (4). Паб. L. 100–670, §201 (i) (3), добавлено «или ветеринарный биологический продукт» после слова «лекарственное средство» в подпунктах. (А) — (С).

Подсек. (грамм). Паб. Л. 100–418 добавлен пп. (грамм).

1984 — Подст. (е). Паб. Л. 98–417 добавлен пп. (е).

Подсек. (е). Паб. Л. 98–622 добавлен пп. (е).

Обязательства и связанные с ними дочерние компании

Поправка Pub. L. 103–465 вступает в силу через год после даты вступления в силу Соглашения ВТО в отношении Соединенных Штатов [янв.1, 1995], с положениями, относящимися к самой ранней поданной заявке на патент, см. Раздел 534 (a), (b) (3) Pub. L. 103–465, изложенный в виде примечания к разделу 154 этого заголовка.

Паб. L. 100–703, раздел II, §202, 19 ноября 1988 г., 102 Stat. 4676, при условии, что:

«Поправка, внесенная в этот заголовок [поправка к этому разделу], применяется только к делам, поданным на дату вступления в силу настоящего Закона или после этой даты [ноябрь. 19, 1988] ».

Паб. L. 100–418, раздел IX, §9006, август.23, 1988, 102 Stat. 1566, при условии, что:

Изменения, внесенные в этот подзаголовок, не должны ограничивать или влиять на право любого лица или любого правопреемника такого лица продолжать использовать, продавать или импортировать любой конкретный продукт, уже находящийся в значительной и постоянной продаже или использовании таким лицом в Соединенные Штаты 1 января 1988 г., или в отношении которых такое лицо к такой продаже или использованию было подготовлено до такой даты, в той степени, в которой это справедливо для защиты сделанных коммерческих инвестиций или ведения бизнеса в Соединенных Штатах до такой даты.Этот подраздел не применяется к любому лицу или любому правопреемнику такого лица, использующему, продающему или импортирующему продукт, произведенный с помощью запатентованного процесса, который является предметом процессуального действия по обеспечению соблюдения патента, начатого до 1 января 1987 г. , до начала международной торговли. Комиссия, ожидающая рассмотрения или по которой был выставлен ордер.

Паб. L. 100–418, раздел IX, §9007, 23 августа 1988 г., 102 Stat. 1567, при условии, что министр торговли должен был представлять Конгрессу ежегодные отчеты, охватывающие каждый из пяти последовательных однолетних периодов, начинающихся через 6 месяцев после 23 августа 1988 г., о влиянии поправок, внесенных в подзаголовок A (§§9001– 9007) раздела IX Pub. L. 100–418, вводящий в действие раздел 295 настоящего раздела и изменяющий разделы 154, 271 и 287 этого раздела в отношении тех отечественных предприятий, которые подают жалобы в Министерство торговли, утверждая, что их законные источники поставок были подвергнуты неблагоприятному воздействию из-за поправки.

E1 Убиквитин-активирующий фермент UBA-1 играет несколько ролей в процессе разработки C. elegans

Abstract

Полиубиквитинирование белков-мишеней обычно отмечает их разрушение через протеасомы и обеспечивает важный механизм для динамического контроля уровней белка. Фермент, активирующий убиквитин E1, находится на вершине каскада убиквитинирования, и его активность необходима для всех последующих стадий реакции. Мы выделили чувствительную к температуре мутацию в гене Caenorhabditis elegans uba-1 , который кодирует единственный фермент E1 в этом организме.Манипулирование активностью UBA-1 на разных стадиях развития выявляет множество функций для убиквитинирования, включая новые роли в фертильности сперматозоидов, контроле размера тела и развитии в зависимости от пола. Уровни конъюгатов убиквитина у мутанта существенно снижены, что согласуется со сниженной активностью E1. Мутация uba-1 вызывает задержку мейотической прогрессии у ранних эмбрионов, процесс, который, как известно, регулируется убиквитин-опосредованным протеолизом. Мутация uba-1 также демонстрирует синтетические летальные взаимодействия с аллелями комплекса, стимулирующего анафазу, убиквитинлигазы E3.Мутация uba-1 обеспечивает сенсибилизированный генетический фон для идентификации новых функций in vivo для нижестоящих компонентов каскада ферментов убиквитина, и это одна из первых условных мутаций, описанных для основного фермента E1 в модели многоклеточных животных.

Сведения об авторе

Белки, контролирующие развитие организма, необходимо сначала включить в нужное время и в нужном месте, а затем выключить, когда они больше не нужны. Один из «выключенных» сигналов возникает из-за присоединения небольшого белка, известного как убиквитин, к белку-мишени, что обычно приводит к разрушению мишени.Присоединение убиквитина контролируется рядом ферментов, первый из которых известен как E1. У большинства организмов есть единственный ген фермента E1, и его активность имеет решающее значение для деградации широкого спектра целевых белков на протяжении всего развития. Мы идентифицировали чувствительную к температуре мутацию в ферменте E1 нематоды Caenorhabditis elegans . Управляя температурой роста, мы определили различные функции E1 на разных этапах развития.Мы обнаружили, что этот фермент контролирует развитие эмбрионов и личинок, фертильность сперматозоидов и размер тела. Мы также охарактеризовали половые роли для E1; у самцов прогрессирующий паралич и дефекты хвоста, который используется для спаривания. В дополнение к полученным знаниям эта мутация предоставляет средства идентификации как функций других ферментов убиквитина во время развития, так и целевых белков, которые помечены для разрушения.

Образец цитирования: Kulkarni M, Smith HE (2008) E1 Убиквитин-активирующий фермент UBA-1 играет несколько ролей в C.elegans Разработка. PLoS Genet 4 (7): e1000131. https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131

Редактор: Мэри Маллинс, Медицинский факультет Пенсильванского университета, Соединенные Штаты Америки

Поступила: 13 февраля 2008 г .; Одобрена: 18 июня 2008 г .; Опубликовано: 18 июля 2008 г.

Авторские права: © 2008 Kulkarni et al. Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Финансирование: Эта работа была частично поддержана грантом Национального научного фонда № 0445684 HES.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Посттрансляционная модификация белков играет критическую роль в регуляции активности белков, а убиквитин-опосредованный протеолиз стал ключевым игроком в контроле белкового обмена. Убиквитин, высококонсервативный небольшой белок, ковалентно присоединяется к белку-мишени посредством ферментативного каскада, и сборка полиубиквитиновой цепи обычно определяет этот белок для быстрой деградации через протеасому 26S [1].Таким образом, убиквитин-опосредованный протеолиз обеспечивает «выключенный» переключатель для управления пространственным и временным распределением белков, которые больше не нужны. Этот способ регуляции необходим для нормальных клеточных процессов (например, прогрессии и дифференцировки клеточного цикла), а дефекты связаны с такими заболеваниями человека, как рак и нейродегенеративные расстройства [2], [3].

Убиквитинирование белков-мишеней может также регулировать функцию с помощью механизмов, отличных от опосредованной протеасомами деградации.Моноубиквитинирование служит сигналом для эндоцитоза и транспорта различных белков клеточной поверхности, а также участвует в регуляции гистонов и факторов транскрипции [4] — [6]. Сборка полиубиквитиновых цепей может происходить в разных лизинах убиквитина, что способствует разным результатам для меченого белка. Конъюгация по лизину 48 обычно ведет к протеасомной деградации, тогда как связывание через лизин 63 может модулировать белковые активности в таких разнообразных процессах, как ядерная локализация, репарация ДНК или образование включений при нейродегенеративных заболеваниях [7] — [9].

Три фермента опосредуют присоединение убиквитина к белку-субстрату: убиквитин-активирующий фермент E1, убиквитин-конъюгированный фермент E2 и убиквитинлигаза E3 [10]. Повторные циклы лигирования с исходным убиквитином приводят к полиубиквитинированию. Субстратная специфичность обеспечивается избирательным связыванием отдельных лигаз E3 с одним или несколькими белками-мишенями [11]. Эукариоты обычно обладают одним геном, кодирующим E1-активирующий фермент, десятками E2-конъюгированных ферментов и несколькими сотнями E3-лигаз.Некоторые лигазы E3 сами по себе представляют собой мультисубъединичные комплексы, в которых субъединица распознавания субстрата определяет белок, нацеленный на убиквитинирование.

In vivo Роль убиквитинирования в развитии организма была определена, прежде всего, путем характеристики специфических лигаз E3. У нематоды Caenorhabditis elegans лигазы E3 регулируют такие разнообразные процессы, как определение пола, прогрессирование клеточного цикла и синаптическая передача сигналов [12] — [16]. Исследования ферментов, конъюгирующих с E2, указывают на взаимодействие с несколькими E3, как можно было бы предположить по их относительному количеству.Например, инактивация ubc-2 дает более широкий спектр фенотипов, чем инактивация его известного партнера E3 apc-11 [17].

Одна из наиболее хорошо охарактеризованных функций для убиквитинирования и протеасомной деградации у C. elegans — это координация ранних событий эмбриогенеза [18]. Комплекс, способствующий анафазе (APC), представляет собой мультисубъединичную лигазу E3, которая необходима для завершения мейоза сразу после оплодотворения ооцита спермой [19], [20].Убиквитин-опосредованный протеолиз также играет роль в деградации некоторых белков, которые участвуют в установлении передне-задней (A-P) полярности у ранних эмбрионов. Эти белки становятся асимметрично локализованными при первом делении клетки, и неспособность деградировать эти компоненты коррелирует с дефектами развития, такими как изменения в спецификации клеточной судьбы и эмбриональной летальности. Формирование оси A-P и прогрессирование эмбрионального клеточного цикла требует активности класса комплексов E3, известных как лигазы Cullin-RING [21] — [27].Мутации в компонентах APC также влияют на полярность A-P, возможно, как следствие дефектов мейоза [28], [29].

Фермент, активирующий убиквитин E1, находится на вершине ферментативного каскада, и манипулирование его активностью может обеспечить решающую точку входа для идентификации бесчисленных ролей, выполняемых убиквитином во время развития. Чувствительные к температуре аллели E1 были идентифицированы в линиях клеток млекопитающих как мутации клеточного цикла, которые демонстрируют снижение убиквитинирования и деградации субстратных белков [30], [31].Точно так же чувствительный к температуре аллель E1 у дрожжей резко снижает конъюгацию убиквитина, а также приводит к остановке клеточного цикла [32]. Условные аллели также были выделены у Drosophila при скрининге супрессоров , индуцированного -индуцированным апоптозом во время развития глаз [33]. Подробная характеристика продемонстрировала сложность регуляции убиквитина в этой системе. В то время как слабые аллели гена Uba1 , кодирующего E1, блокируют апоптоз, сильные аллели способствуют остановке клеточного цикла и гибели.Более того, эти проаптотические аллели способствуют неавтономной пролиферации в соседних клетках посредством повышенных уровней передачи сигналов Notch.

Мы сообщаем о выделении чувствительной к температуре мутации в гене C. elegans uba-1 , который кодирует единственный фермент E1 в этом организме. Предыдущие результаты для RNAi uba-1 сообщили о материнском бесплодии и эмбриональной летальности с дефектами мейотической прогрессии [34] — [36]. Мутация uba-1 (it129) повторяет эти фенотипы, а также раскрывает несколько новых функций, включая роль в фертильности сперматозоидов, размере тела и половозависимом развитии.Мутация uba-1 (it129) снижает уровни in vivo конъюгатов убиквитина и вызывает задержку мейотической прогрессии у ранних эмбрионов, что согласуется со снижением активности E1. Мутация uba-1 (it129) также демонстрирует синтетические летальные взаимодействия с известными компонентами комплекса, стимулирующего анафазу, и, как таковая, обеспечивает сенсибилизированный генетический фон для идентификации новых функций in vivo для других компонентов каскада убиквитина.

Результаты

Фенотипическая характеристика

Чувствительный к температуре аллель it129 был выделен Дайан Шейкс и на основании стерильности сперматозоидов и летальности личинок был условно обозначен как spe-32 (S. Ward, личное сообщение). Мы определили, что spe-32 является аллельным к uba-1 (см. Ниже), единственному ферменту, активирующему убиквитин E1 в C. elegans , и приняли последнее название гена для ясности.Наша подробная характеристика uba-1 (it129) демонстрирует ряд фенотипов, некоторые из которых зависят от пола, в дополнение к упомянутым выше.

Различные фенотипы проявляются на разных стадиях развития (обобщены в Таблице 1). Для облегчения характеристики эксперименты по температурному сдвигу были выполнены с синхронизированными по возрасту популяциями гермафродитов uba-1 (it129) . Взрослые особи, переведенные на ограничительную температуру, производят мертвые эмбрионы, и их количество равно количеству потомства, производимого животными дикого типа при этой температуре (рис. 1А).Остановка эмбриона неоднородна, что обусловлено различной морфологией эмбрионов и широким диапазоном количества ядер, наблюдаемых при окрашивании DAPI (рис. 1B). Сдвиг температуры на любой стадии эмбриогенеза приводит к нормальному вылуплению, но 100% образующихся личинок погибают на стадии L2 (данные не показаны). Таким образом, продукт гена uba-1 важен как для эмбрионального, так и для личиночного развития.

Рис. 1. Дефекты в гермафродитах uba-1 .

A) Количество жизнеспособного и нежизнеспособного потомства, полученного гермафродитами дикого типа (WT) или uba-1 (it129) при 15 ° C или 25 ° C.Показаны средние значения и стандартные отклонения (N = 6) всего потомства. B) Окрашивание DAPI uba-1 (it129) эмбрионов взрослых, сдвинутых до 25 ° C. C) Сперматозоидное бесплодие. Количество жизнеспособного потомства, полученного при 25 ° C гермафродитами дикого типа или uba-1 (it129) , либо без спаривания (самостоятельно), либо с самцами дикого типа (кросс). Показаны средние значения и стандартные отклонения (N = 6) потомства, полученного через 48 часов. Г) Длина тела. Средняя длина тела и стандартные отклонения (N = 20) синхронизированных по возрасту взрослых гермафродитов.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g001

Личинки, переведенные на рестриктивную температуру на стадии L3, демонстрируют нормальное соматическое развитие. Однако у взрослого гермафродита это отрицательно сказывается на воспроизводстве. Эти стерильные животные откладывают только неоплодотворенные ооциты вместо эмбрионов, но дают жизнеспособное потомство при спаривании с самцами дикого типа, что указывает на то, что стерильность является специфической для сперматозоидов (рис. 1С). Жизнеспособность этого ауткроссного потомства высока (96%), что позволяет предположить, что развитие ооцитов (которое происходит после выработки сперматозоидов у гермафродита) в значительной степени не зависит от мутации.Подробная характеристика дефекта сперматогенеза (описанная ниже) показывает, что эти гермафродиты производят соответствующее количество морфологически нормальных сперматозоидов, но эти сперматозоиды неспособны к оплодотворению.

Все вышеперечисленные фенотипы полностью рецессивны, поскольку гетерозиготные гермафродиты неотличимы от дикого типа. Эти фенотипы в значительной степени, хотя и не полностью, спасаются у uba-1 (it129) гомозиготных животных при разрешающей температуре. Наблюдается увеличение эмбриональной летальности, а также уменьшение количества продуцируемых эмбрионов (рис. 1A), что указывает на то, что продукт гена uba-1 (it129) не полностью функционирует при 15 ° C.Кроме того, температура вызывает небольшую, но значительную (p <0,001 по t-критерию Стьюдента) разницу в размерах тела между взрослыми особями дикого типа и uba-1 (it129) взрослых особей (рис. 1D). При выращивании при 15 ° C uba-1 (it129) гермафродитов на 16% длиннее, чем у дикого типа. Противоположный фенотип наблюдается при 25 ° C, мутанты uba-1 (it129) на 16% короче взрослых особей дикого типа.

В процессе создания гетерозиготных штаммов для фенотипической характеристики мы наблюдали сильный материнский эффект восстановления ранних дефектов развития.Гомозиготное потомство uba-1 (it129) , полученное от гермафродитов + / uba-1 (it129) , выращенных при ограничительной температуре, показало небольшую эмбриональную или личиночную летальность (Таблица 2). Спасение матери не было полным для всех фенотипов; хотя гомозиготные гермафродиты нормально развивались во взрослом возрасте, у этих животных все еще наблюдалась спермоспецифическая стерильность. Мы также проверили спасение отцов путем скрещивания uba-1 (it129) / + гетерозиготных самцов с uba-1 (it129) гомозиготных гермафродитов.Опять же, эмбриональная и личиночная летальность (но не стерильность сперматозоидов) была в значительной степени снижена (Таблица 2). Поскольку присутствие единственной копии uba-1 дикого типа у гермафродита или самца-родителя эффективно подавляет эмбриональную и личиночную летальность в гомозиготном мутантном потомстве, это предполагает, что материнский или отцовский вклад белка UBA-1 достаточен для позволить соматическому развитию нормально протекать до зрелого возраста.

Мужские фенотипы

Чтобы облегчить фенотипическую характеристику самцов, мы сконструировали штамм uba-1 (it129) him-5 (e1490) [мутация him-5 (e1490) дает самцов за счет нерасхождения Х-хромосомы] [37] .Эксперименты по температурному сдвигу проводились с синхронизированными по возрасту популяциями, и у самцов наблюдались те же фенотипы, что и выше: эмбриональная и личиночная летальность и уменьшение размера тела (данные не показаны). Спермоспецифическая стерильность мутантных самцов оценивалась путем скрещивания с гермафродитами fem-1 (hc17) , у которых отсутствует сперма, но они продуцируют ооциты, которые можно оплодотворять при спаривании. Описанные ниже эксперименты показывают, что спаривание было успешным, но не было получено перекрестного потомства, демонстрируя, что мужские сперматозоиды неспособны к оплодотворению.Таким образом, такой же набор дефектов вызывает мутация uba-1 (it129) у мужчин и гермафродитов.

Мы также наблюдали дополнительные фенотипы у uba-1 (it129) самцов. Наиболее заметным фенотипом у взрослых было конститутивное удлинение спикул (рис. 2А, первая и вторая панель). Эти структуры являются частью репродуктивного аппарата мужского хвоста и обычно расширяются только во время введения в вульву для передачи спермы. Дефект ретракции спикулы был очевиден у взрослых самцов как при разрешающей, так и при ограничительной температуре.Постоянно вытянутые спикулы наблюдались примерно у одной трети из uba-1 (it129) самцов, выращиваемых при 15 ° C, и почти у всех — при 25 ° C. В некоторых случаях спикулы, бугорки и окружающие ткани вывернуты, что также свидетельствует о структурных дефектах целостности мужских половых путей.

Рис. 2. Дефекты у самцов уба-1 .

А) Дефекты хвоста самцов. Показаны микрофотографии DIC хвоста самцов дикого типа или uba-1 (it129) животных, выращенных при указанной температуре.Скобка указывает веерные и сенсорные лучи. Стрелка указывает на спикулы. Б) Репродуктивный успех самцов. График показывает среднее количество потомства мужских особей и гермафродитов, произведенных гермафродитами дикого типа (N = 6), скрещенными с диким типом, или uba-1 (it129) самцов, выращенных при 15 ° C. Только первые 500 потомков были подсчитаны для дикого типа. Спаривания объединяли одного гермафродита с пятью мужчинами или трех гермафродитов с 12 мужчинами (высокое #) в течение 24 часов. Процент ауткроссирования рассчитывается путем умножения количества потомства мужского пола на два, а затем деления на общее количество потомства.В) Передача спермы. Стрелка указывает флуоресцентно меченую сперму от самцов дикого типа или uba-1 (it129) , локализованную в сперматеке немеченых гермафродитов после спаривания. D – F, мужской паралич. Г) Молодой взрослый уба-1 (it129) самец. Стрелка указывает нормальный синусоидальный изгиб хвоста. E) Пожилой человек uba-1 (it129) самец. Стрелка указывает вялое положение хвоста. F) Мертвые уба-1 (it129) самец (стрелка) и два уба-1 (it129) гермафродиты.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g002

Дополнительные аномалии копулятивного аппарата самцов наблюдались у животных, выращенных при ограничительной температуре. Хвост самца дикого типа имеет кутикулярный веер, содержащий девять пар сенсорных лучей (рис. 2А, первая панель), которые участвуют в обнаружении партнера и поведенческих реакциях, необходимых для обнаружения вульвы гермафродита. Размер веера значительно уменьшился у гомозиготных самцов uba-1 (it129) , выращенных при 25 ° C, что также приводит к укорочению кончика хвоста и сенсорных лучей (рис. 2А, третья панель).На количество лучей это не влияет, и другие мужские репродуктивные структуры внешне кажутся нормальными при световой микроскопии. Фенотип укороченного веера является полудоминантным: у гетерозиготных самцов + / uba-1 (it129) размер веерообразной формы меньше, чем у дикого типа, но больше, чем у гомозиготных животных (данные не показаны). Следовательно, правильное формирование мужских копулятивных структур оказывается весьма чувствительным к дозировке белка UBA-1.

Строения хвоста самца имеют решающее значение для брачного поведения и передачи сперматозоидов, поэтому аберрации в веере или функции спикул могут отрицательно повлиять на репродуктивный успех самцов.Сперма от самцов дикого типа имеет приоритет над сперматозоидами гермафродитов, так что вырабатывается только ауткроссное потомство до тех пор, пока мужская сперма не истощится, и в это время производство самопроизвольного потомства продолжается [38]. Мужская сперма производит потомство мужского пола и гермафродита в равных количествах, в то время как сперма гермафродита дает потомство исключительно гермафродита. Следовательно, количество потомков ауткроссинга, показатель репродуктивного успеха самцов, можно легко подсчитать, определив количество произведенных самцов.

Репродуктивная успешность установлена ​​у гомозиготных самцов uba-1 (it129) , выращенных при разрешенной температуре. У некоторых из этих животных есть выступающие спикулы, которые, как можно предположить, нарушают передачу сперматозоидов. Фертильность гермафродитов uba-1 (it129) при 15 ° C демонстрирует, что функция сперматозоидов нормальна при этой температуре, поэтому получение потомства ауткроссирования использовалось как индикатор успешного спаривания. В результате спаривания с самцами дикого типа были получены самцы и гермафродиты в ожидаемом соотношении 1: 1, что указывает на то, что все потомство в измеренном временном интервале произошло в результате оплодотворения мужской спермой (рис. 2B, WT).Напротив, спаривание с uba-1 (it129) самцов дало в среднем только 56 самцов по сравнению с 236 потомками гермафродитов (Рисунок 2B, uba-1 ), что позволяет предположить, что количество ауткроссных потомков снижается. Те же данные можно было бы объяснить, если бы сперматозоиды nullo-X, производящие мужское потомство, менее пригодны для оплодотворения, чем X-несущие сперматозоиды, производящие гермафродитов. Это объяснение кажется маловероятным, потому что процент потомства самцов увеличивается, если увеличивается плотность самцов для спаривания (Рисунок 2B, uba-1 , высокий #).Чтобы окончательно исключить эту возможность, uba-1 (it129) самцов были скрещены с fem-1 (hc17) взрослых гермафродитов, у которых отсутствует сперма. В этом эксперименте получают только ауткроссное потомство, и, хотя численность была низкой, самцы и гермафродиты наблюдались в соотношении 1–1 (данные не показаны). Следовательно, фенотип выступающих спикул, наблюдаемый у самцов uba-1 (it129) при разрешающей температуре, снижает успешный перенос сперматозоидов для оплодотворения.

Репродуктивный успех был таким же образом охарактеризован для uba-1 (it129) самцов, перешедших на ограничительную температуру на L3. От скрещивания потомства с гермафродитами дикого типа или fem-1 (hc17) не наблюдалось потомства. Этот сбой может возникнуть из-за неспособности сперматозоидов оплодотворять ооциты (как это верно для спермы гермафродитов при 25 ° C) или может быть следствием серьезных морфологических дефектов копулятивного аппарата мужчины, которые возникают при ограничительной температуре.Была проведена прямая оценка передачи спермы, чтобы различить две возможности. Самцов из штаммов him-5 (e1490) , которые являются диким типом или мутантными по uba-1 (it129) , выращивали как при 15 ° C, так и при 25 ° C, окрашивали флуоресцентным красителем, затем скрещивали с fem. -1 (hc17) гермафродитов, лишенных спермы. Самцы дикого типа, выращенные при любой температуре, и мутантные самцы, выращенные при 15 ° C, успешно спаривались в 50–70% случаев, о чем свидетельствует присутствие меченых сперматозоидов у гермафродитов fem-1 (hc17) (рис. 2C). , первые две панели).Напротив, uba-1 (it129) самцов, выращенных при 25 ° C, успешно перенесли сперму только в двух из 10 случаев. Хотя эффективность спаривания снижается при 25 ° C, дефекты копулятивных структур самцов, возникающие из-за мутации uba-1 (it129) , не отменяют полностью передачу сперматозоидов (рис. 2C, третья панель). Однако даже эти относительно редкие успешные спаривания не приводят к появлению потомства ауткроссинга, что указывает на то, что uba-1 (it129) сперматозоидов от самцов неспособны к оплодотворению при ограничительной температуре.

Дополнительный, специфичный для пола фенотип наблюдался у uba-1 (it129) самцов: поздний прогрессирующий паралич у двух третей животных (Рисунок 2, D – F). Паралич начинается в задней части самца и продолжается спереди по мере старения червя, достигая кульминации в полностью парализованном животном со значительно сокращенной продолжительностью жизни. Прогрессирующий паралич наблюдается только у мужчин, так как uba-1 (it129) гермафродитов демонстрируют нормальную подвижность и продолжительность жизни (рис. 2F).Фенотип не является следствием аберрантного соматического развития, а возникает после развития, поскольку отсрочка температурного сдвига до взрослого возраста все еще приводит к параличу. Следовательно, продукт гена uba-1 необходим для поддержания нервно-мышечной функции у взрослого мужчины.

Специфический для сперматозоидов дефект

Развитие сперматозоидов C. elegans было подробно описано [39], [40], что позволяет идентифицировать специфические цитологические и функциональные дефекты в программе развития, которые возникают как следствие мутации.Нормальный сперматогенез инициируется митотически делящейся популяцией стволовых клеток зародышевой линии. Первичные сперматоциты отделяются от синцитиального ядра цитоплазмы и подвергаются скоординированной программе мейоза и дифференцировки. Два мейотических деления дают начало четырем гаплоидным сперматидам с сильно конденсированными ядрами. Эти маленькие круглые клетки отделяются от более крупного остаточного тела, которое содержит компоненты, не необходимые для последующих этапов развития. Активация внеклеточным сигналом превращает неподвижные сперматиды в зрелые ползающие сперматозоиды, способные к оплодотворению, и было идентифицировано несколько соединений, которые способствуют активации in vitro [41] — [43].Активация у гермафродитов происходит в сперматеке, где хранятся зрелые сперматозоиды. Активация мужских сперматид происходит во время осеменения, и мужские сперматозоиды выползают из матки в сперматеку. Оплодотворение происходит в сперматеке, когда ооцит проталкивается в эту камеру репродуктивного тракта гермафродита, а вновь образованная зигота затем переходит в матку. Большая часть сперматозоидов вытесняется и должна вернуться обратно в сперматеку, чтобы дождаться следующего ооцита.

Спермоспецифическая стерильность, вызванная мутацией uba-1 (it129) , была охарактеризована более подробно, начиная с ранних событий, ведущих к образованию сперматид. Окрашивание DAPI L4 и молодых взрослых гермафродитов и самцов не выявило различий в мейотической прогрессии, количестве продуцируемых сперматозоидов или (для гермафродитов) их исходной локализации в сперматеках (Рисунок 3, A – B и данные не показаны). Активация сперматид была нормальной in vivo и in vitro и приводила к ползущим сперматозоидам без заметных дефектов движения псевдопод или подвижности клеток (рис. 3С).Поскольку подвижность и локализация кажутся нормальными, но зиготы не образуются, мутация uba-1 (it129) дает зрелые сперматозоиды, которые, тем не менее, неспособны к оплодотворению.

Рисунок 3. Дефекты спермы.

А) Локализация сперматозоидов в репродуктивном тракте гермафродита. Взрослые особи дикого типа и uba-1 (it129) при 25 ° C фиксировали и окрашивали DAPI для подсчета ядер сперматозоидов. Кончики стрел, расположение сперматеек; маленькие стрелки, сперма вытеснена в матку.Б) Сводка данных о локализации сперматозоидов. Показаны средние значения и стандартные отклонения на гермафродит (N = 6). T0, до начала яйцекладки; Т1 — после 1-2 овуляций; T2, 8 ч после T1; T3, через 8 часов после T2. C) Активация in vitro . Сперматиды дикого типа и uba-1 (it129) самцов при 25 ° C были активированы монензином. Стрелка указывает псевдоножку ползающего сперматозоида.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g003

Вторичный дефект функции сперматозоидов был позже обнаружен у взрослых гермафродитов.Сперматозоиды перемещаются из сперматеки в матку каждым проходящим ооцитом и должны вернуться в сперматеку и дождаться следующей яйцеклетки. Эффективность оплодотворения составляет практически 100% у животных дикого типа, при этом почти каждый сперматозоид используется для воспроизводства [38]. Таким образом, количество сперматозоидов в сперматеке уменьшается в соответствии с увеличением количества произведенного потомства. Поскольку сперматозоиды uba-1 (it129) подвижны, но неспособны к оплодотворению, можно предсказать, что их количество в сперматеке останется высоким на протяжении всего производства ооцитов.Вместо этого наблюдалось противоположное явление, поскольку количество сперматозоидов уменьшалось у uba-1 (it129) гермафродитов быстрее, чем у дикого типа (рис. 3В). Кроме того, значительное количество сперматозоидов было обнаружено в матке, а не в сперматеке (рис. 3A, uba-1 ). Эти клетки уносятся из сперматеки неоплодотворенным ооцитом, но не могут вернуться и вместо этого выбрасываются через вульву, когда ооциты откладываются. Таким образом, хотя подвижность и локализация сперматозоидов изначально кажутся нормальными, у старых животных эти процессы явно нарушены.Это наблюдение может указывать на дефект в поддержании качества спермы с течением времени, что отрицательно влияет либо на подвижность, либо на взаимодействие сперматозоидов и сперматеков.

Обозначение

Идентичность аллеля it129 была определена с помощью комбинации генетических и физических стратегий картирования (рис. 4A). Трехфакторные скрещивания поместили этот аллель на хромосому IV между elt-1 и dpy-20 (F.Фелл и С. Уорд, чел. комм., и наши собственные результаты; картографические данные доступны на сайте www.wormbase.org). Однонуклеотидные полиморфизмы, которые перекрывают сайты рестрикции (snip-SNP), были проанализированы в рекомбинантных линиях [44]. Штаммы, содержащие дефицит eDf19 или mDf7 , не смогли дополнить it129 , дополнительно ограничивая свое положение перекрывающимся интервалом 310 т.п.н. Всего 80 генов-кандидатов в пределах интервала были доступны из крупномасштабной библиотеки питания РНКи [35].Все они были протестированы на способность воспроизводить два из фенотипов it129 : эмбриональная летальность F1 у обработанных взрослых гермафродитов и деформация хвоста у взрослых самцов, которых лечили как личинки. Только одна из протестированных плазмид воспроизводила оба фенотипа. Эта плазмида содержит фрагмент гена, кодирующего убиквитин-активирующий фермент E1, который в C. elegans известен как uba-1 .

Рисунок 4. Клонирование и дополнение.

A) Схема стратегии клонирования.Вверху показан интервал хромосомы IV от elt-1 до dpy-20 . Вторая линия указывает положение snip-SNP, идентифицированных в рекомбинантных линиях из N2 uba-1 (it129) dpy-20 (e1282) , скрещенных с гавайским штаммом CB4856. Следующие две строки указывают на конечные точки и перекрывающиеся области хромосомных дефицитов eDf19 и mDf7 , которые не смогли дополнить uba-1 (it129) . Восемьдесят генов в пределах 0,31 Мб наложения были проверены с помощью РНКи-кормления на два фенотипа uba-1 (it129) : эмбриональная летальность и дефекты мужского хвоста.Б) Прогнозируемая структура гена uba-1 . Показаны положение миссенс-мутации Pro1024Ser, идентифицированной в аллеле it129 , и протяженность удаленной области аллеля ok1374 . C) Данные о комплементации для гетерозигот it129 / ok1374 . Условия анализа эмбриональной летальности F1 (N = 6 гермафродитов), личиночной летальности (минимум 500 эмбрионов) и спермоспецифической стерильности (N = 10 гермафродитов) были идентичны тем, которые использовались для характеристики гомозигот it129 ; см. рисунок 1 и сопроводительный текст.Г) Дефекты зародышевой линии у гетерозигот it129 / ok1374 . Ядра зародышевой линии визуализировали окрашиванием DAPI фиксированных взрослых животных. Для ориентации показан дистальный конец гонады. В верхнем ряду показана одна рука гонады (слева направо) у it129 гомозиготного гермафродита, it129 / ok1374 гетерозиготного гермафродита, it129 гомозиготного самца и it129 / ok1374 гетерозиготного самца. В нижнем ряду показано изображение области проксимального отдела гонады с большим увеличением.Стрелки — ядра ооцитов при диакинезе.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g004

Тесты комплементации подтвердили, что it129 является аллелем uba-1 . Консорциум Gene Knockout (http://celeganskoconsortium.omrf.org) сгенерировал делеционный аллель uba-1 (ok1374) , который удаляет большую часть третьего и четвертого экзонов и, по прогнозам, является нулевой мутацией (рис. 4B). ). Мутанты, гомозиготные по uba-1 (ok1374) , проявляют эмбриональную летальность или раннюю задержку личинок, поэтому ok1374 / it129 животных были получены от скрещиваний при разрешающей температуре, чтобы обеспечить восстановление жизнеспособных линий.Комплементацию между двумя аллелями проверяли по температурному сдвигу на различных стадиях развития, как описано выше. Идентичные фенотипы, описанные для it129 гомозигот, наблюдались для ok1374 / it129 гетерозигот: эмбриональная летальность, личиночная летальность, сперматоспецифическая стерильность, дефекты в формировании мужского хвоста и мужской прогрессирующий паралич (Рисунок 4C, и данные не показаны. ). Таким образом, ok1374 и it129 не могут дополнять друг друга и оба являются аллелями uba-1 .

Делеция ok1374 является предполагаемым нулевым аллелем, в то время как мутация it129 , вероятно, гипоморфна (то есть снижение функции; см. Обсуждение). Таким образом, мы стремились установить, были ли гетерозиготы it129 / ok1374 более неблагоприятными, чем гомозиготы it129 . Большинство фенотипов, наблюдаемых у гомозиготных животных it129 , обладают высокой проникающей способностью, что затрудняет обнаружение усиления. Однако данные анализа комплементации на стерильность сперматозоидов убедительно указывают на более серьезный дефект у животных it129 / ok1374 .Перекрестное оплодотворение стерильных it129 гомозиготных гермафродитов самцами дикого типа дает потомство с высокой жизнеспособностью (96%; см. Рисунок 1C). Напротив, перекрестное оплодотворение стерильных гермафродитов it129 / ok1374 дает эмбрионы с очень низкой жизнеспособностью (6%; рис. 4C). Кроме того, те же данные демонстрируют, что количество оплодотворенных эмбрионов значительно ниже у it129 / ok1374 гетерозигот, чем у it129 гомозигот (10 против 48, соответственно).Сперма обычно является ограниченной гаметой для оплодотворения у C. elegans , но эти результаты предполагают, что продукция ооцитов может быть дефектной у гермафродитов it129 / ok1374 . Поэтому мы исследовали гонады этих штаммов непосредственно с помощью окрашивания DAPI.

Развитие зародышевых клеток C. elegans происходит от дистального к проксимальному отделу внутри гонады и наиболее легко различимо по изменениям в морфологии ядра [45]. У гермафродитов проксимальное плечо взрослых гонад дикого типа содержит ряд отдельных ооцитов, ядра которых блокируются при диакинезе мейоза I.Наш анализ показывает, что зародышевые линии гомозигот it129 подобны гермафродитам дикого типа, а проксимальная половая железа содержит морфологически нормальные ооциты, шесть диакинетических бивалентов которых легко видны (рис. 4D, верхняя и нижняя левая панели). Напротив, зародышевые линии животных it129 / ok1374 демонстрируют увеличенную популяцию половых клеток и сопутствующее снижение количества ооцитов в проксимальном плече гонады. Этот дефект оогенеза изменчив; некоторые зародышевые линии выглядят в основном нормальными, в то время как в других примерах ооциты отсутствуют и были полностью вытеснены избыточным количеством половых клеток (как на рис. 4D, верхняя и нижняя вторая панели).Сходный фенотип описан для мутаций в ряде генов, которые управляют выбором пролиферация против мейоза, таких как glp-1 [46].

Кроме того, мы также наблюдали дефект сперматогенеза в зародышевой линии самцов. Взрослые самцы дикого типа накапливают большое количество сильно конденсированных ядер сперматид внутри семенного пузырька. Гомозиготные самцы it129 также содержат большое количество компактных ядер сперматид (рис. 4D, верхняя и нижняя третьи панели).Однако семенные пузырьки самцов it129 / ok1374 содержат относительно мало ядер, которые также кажутся более крупными или менее конденсированными, чем ядра сперматид (рис. 4D, крайние правые верхняя и нижняя панели). И у гермафродитов, и у мужчин митотические и пахитенные области зародышевой линии в дистальных отделах гонады кажутся нормальными (хотя иногда и уменьшаются в размерах). Эти результаты предполагают, что дифференцировка гамет у обоих полов нарушена у гетерозиготных мутантов it129 / ok1374 , но с противоположными эффектами в зависимости от типа гамет: самцы обладают меньшим количеством сперматид, чем обычно, в то время как гермафродиты содержат избыток ядер зародышевых клеток. а не ооциты.О гамет-специфических различиях в пролиферации и дифференцировке сообщалось ранее. Например, потеря gld-1 вызывает избыточную пролиферацию зародышевой линии только у гермафродитов, подвергающихся оогенезу [47], тогда как потеря puf-8 вызывает избыточную пролиферацию только в продуцирующих сперму зародышевых линиях [48].

Спасение трансгена it129 с геном uba-1 дикого типа дополнительно подтвердило его идентификацию. Первоначальные попытки спасения с помощью микроинъекции зародышевой линии показали, что черви могут быть чрезвычайно чувствительны к дозе этого гена.Контрольные инъекции маркера rol-6 [49] дали многочисленные прокатные потомства F1 со стабильной передачей в последующих поколениях. Напротив, совместная инъекция uba-1 с rol-6 в типичных концентрациях привела к низким размерам расплода с очень небольшим количеством валиков F1 и отсутствием стабильно передающих линий, что свидетельствует о токсичности трансгена. Чтобы уменьшить дозировку гена, концентрация ДНК uba-1 была снижена по сравнению с rol-6 , и геномная ДНК N2 также была включена в инъекции.При самой низкой протестированной концентрации четыре из шестнадцати стабильно передающих линий продемонстрировали частичное восстановление как сперматоспецифической стерильности, так и эмбриональной летальности при ограничительной температуре. Следовательно, трансген uba-1 дикого типа способен дополнять мутацию it129 .

Об экспрессии репортерного трансгена uba-1 :: GFP сообщалось в различных соматических тканях, но не в зародышевой линии [50], хотя функциональная роль UBA-1 в этой ткани указывается мутантным фенотипом.Трансгены часто заглушаются внутри зародышевой линии, поэтому гибридизация in situ была использована для обнаружения транскрипции эндогенного гена uba-1 в гонаде. Обильная экспрессия была обнаружена в половых клетках, которые инициировали мейоз у гермафродитов дикого типа (во время образования сперматозоидов и ооцитов) и у мужчин (рис. 5). Интенсивность сигнала оказалась выше во время продукции ооцитов; это наблюдение было подтверждено сравнением гермафродитов fem-1 (hc17) , которые образуют только ооциты, с гермафродитами fem-3 (q23) , которые производят только сперму.Пик экспрессии происходит в пахитене первого деления мейоза, отсутствует сразу после этого и снова обнаруживается в позднем оогенезе. Эта закономерность более очевидна в гонаде fem-1 (hc17) , которая принадлежит взрослому человеку более старшего возраста, чем гермафродит дикого типа.

Рисунок 5. Гибридизация гонад in situ .

Панели слева показывают паттерн экспрессии uba-1 в рассеченных гонадах. Панели справа показывают морфологию ядра по окрашиванию DAPI.Сверху вниз гонады происходят от взрослых гермафродитов во время оогенеза, взрослых мужчин во время сперматогенеза, fem-1 (hc17) взрослых гермафродитов, которые производят только ооциты, и fem-3 (q23) взрослых гермафродитов, которые производят только сперму. Было исследовано не менее 20 гонад на каждый генотип или пол. DT, дистальный конец гонады; П, пахитенная область.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g005

Определение последовательности кодирующей области uba-1 из штамма, несущего it129 , выявило молекулярное поражение.Была обнаружена простая нуклеотидная замена, которая превращает пролин в положении 1024 в серин (Pro1024Ser, фигура 4B). Полная структура E1-убиквитин-активирующего фермента еще не определена, но доступны рентгеновские кристаллические структуры активирующих ферментов для убиквитин-подобных белков SUMO и NEDD8 [51], [52]. Остаток пролина, который мутирован в uba-1 (it129) , отображается рядом с активным сайтом, где, как предполагается, фрагмент убиквитина ковалентно присоединен к белку E1.На основании структурных данных можно ожидать, что мутация Pro1024Ser изменит каталитическую активность фермента.

Ген uba-1 кодирует единственный известный фермент, активирующий убиквитин E1 в C. elegans , поэтому предполагается, что дефект его активности нарушит последующие этапы ферментативного каскада и вызовет общее снижение уровня убиквитинирования. на субстратных белках.Мы проверили эту гипотезу напрямую, используя убиквитин-специфические антитела для оценки степени убиквитинирования в лизатах белков червей. Чтобы контролировать вариации в активности убиквитинирования на разных стадиях развития, мы экстрагировали белок из синхронизированных по возрасту молодых взрослых гермафродитов, сдвинутых как личинки L3. Поскольку эти животные uba-1 (it129) бесплодны из-за стерильности сперматозоидов, мы включили в качестве дополнительного контроля штамм, содержащий spe-26 (it112) (чувствительная к температуре, специфическая для сперматозоидов стерильная мутация).Вестерн-блоттинг показывает значительное снижение количества убиквитинового сигнала в экстрактах белка uba-1 (it129) по сравнению с контролями дикого типа и spe-26 (it112) (Фиг.6). Обратите внимание, что уровень убиквитина в высокомолекулярной области блоттинга особенно снижен, предположительно отражая существенное уменьшение количества полиубиквитинированных субстратов. Следовательно, мутация uba-1 (it129) демонстрирует in vivo снижение убиквитинирования белка.

Рисунок 6. Вестерн-блоттинг для определения убиквитина.

Панель слева (анти-Ub) показывает общий уровень конъюгатов убиквитина от дикого типа, spe-26 (it112) или uba-1 (it129) молодых взрослых гермафродитов. Равные количества экстрактов растворимых белков были обнаружены с помощью убиквитин-специфичных моноклональных антител. На панели справа (Кумасси) показаны те же экстракты, окрашенные на общий белок. Стандарты размеров (MW) указаны справа.

https: // doi.org / 10.1371 / journal.pgen.1000131.g006

Согласно прогнозам, пониженное убиквитинирование отрицательно влияет на протеасомную деградацию целевых белков. Хорошо изученные роли ubiquitin-обеспечиваемого протеолиза у C. elegans происходят во время ранних событий эмбриогенеза. Комплекс, стимулирующий анафазу (APC), представляет собой лигазу E3, которая необходима для деградации мейотического ингибитора секурина [53]. Полная потеря активности APC приводит к остановке метафазы у одноклеточного эмбриона [19].

Мутация uba-1 (it129) не вызывает одноклеточного ареста, вызванного потерей активности APC, а вместо этого имитирует летальность многоклеточного эмбриона в результате снижения функции APC.Этот фенотип вызывается гипоморфными мутациями в компонентах APC или синтетическими взаимодействиями между некоторыми парами термочувствительных аллелей (т. Е. Каждая отдельная мутация не влияет на допустимую температуру, тогда как комбинация обеих мутаций вызывает гибель материнского эмбриона) [29] . Поскольку UBA-1 и APC функционируют в одном и том же ферментативном каскаде, мутации в обоих аналогично могут проявлять синтетическое взаимодействие. Поэтому мы протестировали аллель uba-1 (it129) в сочетании с компонентами APC.Двойные мутанты uba-1 (it129) либо с субъединицей APC mat-3 (или 180) [19], либо с активатором APC fzy-1 (h2983) [53], приводили к гибели материнского эмбриона на разрешающем уровне. температура (таблица 3).

Ранний эмбриогенез был исследован у uba-1 (it129) взрослых гермафродитов, сдвинутых на 25 ° на дефекты мейотической прогрессии или полярности A-P в первом делении клетки. Трансген oma-1 :: GFP был использован для визуализации эмбриональной полярности [54].У гермафродитов дикого типа белок OMA-1 :: GFP равномерно распределен по цитозолю и исключен из интактных пронуклеусов одноклеточного эмбриона. Наши наблюдения при 25 ° C показывают, что белок также концентрируется на центриолях сперматозоидов и митотическом веретене. Убиквитин-опосредованный протеолиз при первом делении клетки разрушает основную часть OMA-1 :: GFP. Белок отсутствует в передней (A) клетке двухклеточного эмбриона, а оставшийся OMA-1 :: GFP становится связанным с гранулами P в задней (P) клетке.У uba-1 (it129) животных паттерн OMA-1 :: GFP в одноклеточных эмбрионах неотличим от дикого типа. Распад OMA-1 :: GFP во время первого деления клетки также идентичен, и белок сохраняется только в P-клетке. Однако прогрессирование зиготы через первое деление происходит медленнее, чем обычно для эмбрионов uba-1 (it129) . Отсроченное прогрессирование приводит к увеличению количества одноклеточных эмбрионов в матке, что легко визуализируется по присутствию OMA-1 :: GFP (рис. 7A).Гермафродиты дикого типа обычно содержат по одному одноклеточному эмбриону в каждом плече гонады; Напротив, мутанты uba-1 (it129) имеют в среднем по три одноклеточных эмбриона на одну руку гонад (фиг. 7B). Кроме того, 35% гермафродитов uba-1 (it129) содержали раздробленную зиготу в матке. Формирование жесткой яичной скорлупы завершается в конце мейоза, поэтому эти раздробленные зиготы могут быть либо косвенным следствием наблюдаемой задержки мейоза, либо указывать на структурную потребность в убиквитинировании у эмбриона сразу после оплодотворения.

Рисунок 7. Выражение OMA-1 :: GFP.

A) Взрослые гермафродиты, экспрессирующие интегрированный трансген oma-1 :: GFP . Показаны примеры животных дикого типа uba-1 (it129) и животных, которые содержат один и четыре одноклеточных эмбриона, соответственно. Б) Частота появления одноклеточных эмбрионов в матке. Подсчитывали количество одноклеточных эмбрионов на одну гонадную руку для гермафродитов дикого типа (N = 40) и uba-1 (it129), (N = 34). C) Распределение одноклеточных эмбрионов в мейотической, пронуклеарной и митотической стадиях развития, как это визуализировано с помощью OMA-1 :: GFP.

https://doi.org/10.1371/journal.pgen.1000131.g007

Задержка в прогрессировании через первое эмбриональное деление было исследовано более подробно. После оплодотворения ядро ​​ооцита завершает первое и второе деления мейоза. Пронуклеусы ооцитов и сперматозоидов встречаются и сливаются, а затем претерпевают первое митотическое деление. Процент эмбрионов, наблюдаемых на каждой из этих стадий (мейоз, миграция и слияние пронуклеусов и митоз), был определен для животных дикого типа и uba-1 (it129) животных.Доля одноклеточных эмбрионов на мейотической и пронуклеарной стадиях была эквивалентна для эмбрионов дикого типа, но примерно в два раза выше на мейотической стадии для эмбрионов uba-1 (it129) (рис. 7C), что свидетельствует об острой чувствительности мейоза. в UBA-1. Несмотря на это значительно искаженное распределение (p <0,001 по критерию хи-квадрат Пирсона), не было никаких грубых дефектов ядерной или клеточной морфологии или распределения OMA-1 :: GFP по мере развития эмбриона.

Обсуждение

Здесь мы сообщаем о выделении и характеристике чувствительной к температуре мутации гена uba-1 , который кодирует фермент, активирующий убиквитин E1 C.elegans . Активация E1 является первым этапом ферментативного пути, который приводит к конъюгации убиквитина с белками-мишенями. Манипулирование активностью E1 с помощью сдвига температуры обеспечивает механизм для идентификации многих ролей убиквитинирования на протяжении всего развития. Эффекты мутации uba-1 (it129) проявляются как на организменном (т. Е. Эмбриональная и личиночная летальность, уменьшение размеров тела), так и на клеточном (сперматоспецифическая стерильность) уровнях, а также приводят к половозависимым различиям онтогенетические (формирование мужского копулятивного аппарата) и пост-онтогенетические (поздний мужской паралич) процессы.Мутация uba-1 (it129) вызывает существенное снижение in vivo уровней убиквитин-конъюгированных субстратов, демонстрирует синтетическую эмбриональную летальность с компонентами комплекса, стимулирующего анафазу (убиквитин-лигаза E3), и вызывает задержки в раннем эмбриональном развитии. события, которые, как известно, регулируются убиквитин-опосредованным протеолизом.

В совокупности данные показывают, что мутация uba-1 (it129) приводит к чувствительному к температуре снижению его ферментативной активности, активирующей убиквитин.Поскольку продукт гена uba-1 является единственным ферментом E1 в C. elegans , прогнозируется, что снижение его активности отрицательно повлияет на функцию ферментов E2 и E3 во всем мире. Это уменьшение могло бы продлить период полужизни белков, обычно нацеленных на протеасому, а также изменить локализацию и / или активность других субстратов, конъюгированных с убиквитином. Некоторые из этих нисходящих путей будут более или менее чувствительны к снижению активности E1, но результатом будет снижение скорости убиквитинирования для широкого ряда белков-субстратов.В подтверждение этой модели вестерн-блоттинг с антителами против убиквитина продемонстрировал общее снижение мечения убиквитином экстрактов из мутантного штамма uba-1 (it129) (рис. 6). Кроме того, структурные данные родственных ферментов E1 предсказывают, что мутация Pro1024Ser в uba-1 (it129) может изменять его каталитическую активность. Наконец, модель согласуется с нашими результатами в скрининге генов-кандидатов (в котором сниженные уровни UBA-1 с помощью РНКи воспроизводили как эмбриональную летальность, так и дефекты мужского хвоста), а также фенокопию гипоморфных аллелей APC, а не сильную потерю -функции мутации (т.е., многоклеточный или одноклеточный эмбриональный арест).

Альтернативная гипотеза о том, что мутация uba-1 (it129) блокирует только один или несколько путей E2 / E3, менее вероятна. Наблюдаемое снижение убиквитинирования in vivo у мутанта потребовало бы, чтобы основная часть конъюгации убиквитина опосредовалась одной или несколькими лигазами E3; однако сотни E3, присутствующие в C. elegans , выступают против этой модели. Более того, диапазон фенотипов, продуцируемых мутацией uba-1 , намного шире, чем те, о которых сообщается для инактивации любого отдельного фермента E2 или E3 [55], что согласуется с его участием во множестве путей E2 / E3.Мы четко демонстрируем генетические взаимодействия между uba-1 (it129) и одним путем E3, APC, посредством синтетической эмбриональной летальности с аллелями mat-3 или fzy-1 . Однако дефект оплодотворения, специфичный для сперматозоидов, по-видимому, связан с другим путем E3. Этот фенотип не наблюдается у мутантов APC, но сообщается о мутациях в spe-16 , который, как недавно было определено, кодирует гомолог убиквитинлигазы E3 (Стив Л’Эрно, личное сообщение).

Некоторые эффекты мутации uba-1 можно интерпретировать в свете разнообразия фенотипов, возникающих в результате потери отдельных активностей E2 или E3. Напр., Эмбриональная и личиночная летальность была описана для ряда гомологов E2 и E3 в крупномасштабных скринингах РНКи [34] — [36]. Однако большинство этих генов не были дополнительно охарактеризованы, и в отсутствие дополнительных сведений о том, какие белки являются субстратами для определенных ферментов E2 и E3, трудно строить предположения о молекулярных механизмах, ответственных за наблюдаемую летальность.

В других случаях фенотип мутанта uba-1 предполагает ранее не идентифицированную роль убиквитинирования. Размер тела у C. elegans регулируется каноническим путем передачи сигнала TGF-ß, который инициируется лигандом DBL-1 [56], [57]. Компоненты пути TGF-ß у других организмов, как известно, регулируются конъюгацией убиквитина [58]. Различные модификации убиквитина оказывают антагонистическое действие на передачу сигнала: моноубиквитинирование Co-Smad стабилизирует белок и способствует передаче сигналов, в то время как полиубиквитинирование R-Smad приводит к его протеасомной деградации и подавлению передачи сигналов.Учитывая эффекты мутации uba-1 на размер тела C. elegans , кажется вероятным, что компоненты пути DBL-1 / TFG-ß аналогичным образом регулируются убиквитином.

Спермоспецифическая стерильность uba-1 (it129) в сочетании с недавней идентификацией spe-16 как гомолога убиквитин-лигазы E3 (Стив Л’Эрно, личное сообщение), указывает на ранее не охарактеризованную роль убиквитина. в C. elegans сперматогенез.Известно, что убиквитинирование имеет важное значение для функции сперматозоидов у самых разных организмов, и роли в сперматогенезе млекопитающих включают регуляцию мейотического клеточного цикла, модификацию гистонов и ремоделирование хроматина, сортировку белков во время дифференциации сперматозоидов и контроль качества дефектных сперматозоидов [59] — [62]. У C. elegans на ранние события, такие как мейоз, по-видимому, не влияет мутация uba-1 (it129) , предполагая, что бесплодие этих морфологически нормальных сперматозоидов происходит из-за более позднего дефекта в развитии сперматозоидов.Аналогично сперматозоидам млекопитающих, убиквитинирование в C. elegans может функционировать в сортировке белков, когда сперматиды отделяются от остаточного тела. Известно, что ошибки в этом процессе отрицательно влияют на функцию сперматозоидов: мутация spe-15 , кодирующая гомолог миозина, нарушает асимметричную сегрегацию белков во время почкования сперматид и вызывает специфическую стерильность сперматозоидов [63]. С другой стороны, убиквитинирование может способствовать протеасомной деградации белка, который ингибирует оплодотворение, а снижение активности UBA-1 может привести к несоответствующей персистенции предлагаемого ингибитора.Активация сперматид и последующие события происходят в отсутствие синтеза нового белка, поэтому деградация уже существующих компонентов является вероятным механизмом регуляции. Другая возможность заключается в том, что бесплодие uba-1 (it129) может отражать роль убиквитин-опосредованного протеолиза во взаимодействии сперматозоидов и ооцитов. Оплодотворение у асцидий опосредуется внеклеточным ферментом из сперматозоидов, который конъюгирует убиквитин с рецептором сперматозоидов на поверхности яйца, что приводит к его деградации через протеасомы [64].Постоянный анализ предназначен для определения правильности одной (или нескольких) из этих гипотез.

Множественные лигазы E3 участвуют в формировании репродуктивных структур мужского хвоста, поэтому дефекты, наблюдаемые у мутантных самцов uba-1 , могут возникать из-за нарушения одного или нескольких известных путей убиквитинирования. Мутация mat-1 , которая кодирует CDC27 субъединицу APC, вызывает уменьшение размера веерных и сенсорных лучей, аналогично дефекту, производимому uba-1 (it129) [29].Гетерохронный ген lin-41 , который кодирует гомолог подкласса RING finger лигаз E3, также необходим для правильного формирования мужского хвоста. Снижение функции LIN-41 вызывает преждевременное втягивание мужского хвоста, так что веер и лучи уменьшаются или отсутствуют [65], [66]. Путь DBL-1 / TGF-ß (упомянутый выше), который определяет размер тела, также играет роль в формировании спикул [67] и может быть вовлечен в фенотип выступающих спикул у мужчин uba-1 (it129) .

Поздний паралич и связанная с ним летальность, вызванная мутацией uba-1 (it129) , необычны в двух отношениях: он специфичен для пола, затрагивает только мужчин и может быть вызван после завершения всего соматического развития. Имеется немного сообщений о таких пост-онтогенетических фенотипах для C. elegans , и это свойство указывает на дефект в поддержании нейрональной и / или мышечной функции, а не на ее установление. Роль убиквитинирования в нервно-мышечной активности C. elegans сообщалась ранее.Множественные ферменты, конъюгирующие с E2, участвуют в агрегации полиглутаминового белка в мышцах [68]. Комплексы лигазы E3, которые, как было продемонстрировано, влияют на мышечную или нейрональную функцию, включают CHN-1 / UDF-2, APC, KEL-8 / CUL-3, SCF / FSN-1 / RPM-1, SCF / LIN-23 и SCF / SEL-10 [15], [16], [69] — [72]. Однако паралич uba-1 (it129) мужчин отличается от более тонких нервно-мышечных дефектов, о которых сообщалось для других компонентов пути убиквитина, таких как APC (уменьшение продолжительности движения вперед) или KEL-8 / CUL-3 (изменения носа. сенсорная реакция и частота спонтанного разворота) [15], [16].Более того, функциональная роль всех этих ферментов была продемонстрирована у гермафродитов, поэтому специфичное для пола убиквитинирование, которое отвечает за мужской паралич, еще предстоит выяснить.

Почему специфические для мужчин процессы, включая дефект фертильности мужской гаметы (то есть сперматозоидов), так остро чувствительны к уровню активности UBA-1? Одна интригующая возможность связана с недавно обнаруженной ролью убиквитин-опосредованного протеолиза в пути определения пола. Фактор транскрипции TRA-1 является критическим регулятором определения пола соматической и зародышевой линии и действует в первую очередь как ингибитор мужской половой судьбы [73].Три белка FEM негативно регулируют активность TRA-1 и тем самым способствуют судьбе мужских клеток, включая развитие сперматозоидов у гермафродитов [74]. Старостина и др. [12] демонстрируют, что белки FEM образуют комплекс убиквитин-лигазы E3 с CUL-2, который связывается с протеасомозависимой деградацией TRA-1 и способствует ее разрушению. Предполагается, что нарушение функции UBA-1 в результате мутации приведет к снижению активности комплекса FEM / CUL-2 E3, что приведет к увеличению уровней TRA-1, что будет ингибировать процессы развития мужчин.Этот слабо феминизирующий эффект может действовать синергетически с одним или несколькими путями E3, описанными выше. Если эта гипотеза верна, то некоторые из половых дефектов мутации uba-1 могут быть подавлены снижением активности TRA-1.

Наблюдение за синтетической эмбриональной летальностью между uba-1 (it129) и мутациями в компонентах APC предлагает мощный подход для идентификации новых функций нижестоящих компонентов пути убиквитина.Ряд гомологов E2 и E3 обнаруживают фенотипы, обнаруживаемые при скрининге РНКи в масштабе генома, но большинство из них неотличимы от дикого типа [34], [35]. Одно из возможных объяснений состоит в том, что многие из этих ферментов функционально избыточны, и что определение их роли потребует инактивации нескольких E2 или E3. Альтернативно, в некоторых случаях снижение уровней E2 или E3 с помощью RNAi может быть недостаточным для нарушения функции. Однако мутация uba-1 обеспечивает сенсибилизированный генетический фон для обнаружения пониженной активности нижестоящих ферментов.Повторный анализ с помощью РНКи-скрининга гомологов E2 и E3 в мутантном штамме uba-1 , вероятно, выявит новые функции для ряда тех генов, роль которых в настоящее время неизвестна.

Материалы и методы

Генетика

Штаммы C. elegans были получены из изолята дикого типа N2 (Bristol) и содержали одну или несколько из следующих мутаций: uba-1 (it129) IV , uba-1 (ok1374) IV , dpy-20 (e1282) IV , fem-1 (hc17) IV , fem-3 (q20) IV , him-5 (e1490) V , mat-3 (or180) III , fzy-1 (h2983) II , spe-26 (it112) или дефицит хромосомы IV eDf19 или mDf7 .Связанный двойной мутантный штамм uba-1 (it129) dpy-20 (e1282) был создан для облегчения различения гомозиготных и гетерозиготных линий в некоторых экспериментах. Интегрированная трансгенная линия oma-1 :: GFP была сконструирована Рейлингом Лином [54]. Штаммы поддерживали на чашках NGM, засеянных штаммом OP50 E. coli . Синхронизированные по возрасту популяции эмбрионов были получены обработкой беременных гермафродитов гипохлоритом натрия. Штаммы поддерживали при 15 ° C и сдвигали до 25 ° C, как указано для фенотипического анализа.Генетические манипуляции проводили по Бреннеру [75].

Микроскопия

Микроскопию выполняли с помощью Olympus BX51TF или Zeiss Axio Imager, оснащенного объективами Nomarski DIC и соответствующими наборами фильтров для флуоресцентной визуализации и охлаждаемой камерой CCD для захвата изображения. Изображения были обработаны с помощью пакета AxioVision (выпуск 4.6) и подготовлены к публикации с помощью Adobe Photoshop CS v. 9.0.2. Интактных животных обычно помещали на подушечки из 2% агарозы для визуализации.Длина тела измерялась по полученным изображениям с использованием программного обеспечения ImageJ v. 1.38.

Анализы спермы

Морфологию сперматозоидов оценивали путем отделения гонад от взрослых гермафродитов или самцов в среде SM [43]. Морфологию ядерной ДНК визуализировали окрашиванием DAPI сперматозоидов из рассеченных гонад. In vitro активация мужских сперматид проводилась обработкой монензином на предметных стеклах, покрытых полилизином [43]. Подвижность и локализацию сперматозоидов-гермафродитов определяли у интактных животных путем фиксации и окрашивания DAPI с последующим подсчетом числа ядер сперматозоидов в сперматеке и матке.Перенос сперматозоидов был подтвержден при витальном окрашивании самцов [76] митохондриальным красителем MitoTracker Red CMXRos (Molecular Probes), затем скрещивании с неокрашенными гермафродитами, анестезированными трикаином и тетрамизолом. Через 12 или 24 ч флуоресцентно меченную мужскую сперму в репродуктивном тракте гермафродита визуализировали под микроскопом с использованием родаминовых фильтров. Самостоятельную фертильность гермафродитов оценивали, перемещая отдельных животных L3 на температуру 25 ° C и подсчитывая весь размер выводка. Перекрестную фертильность самцов определяли путем спаривания с отдельными гермафродитами дикого типа или самками fem-1 (hc17) , затем подсчитывая количество потомков самцов и гермафродитов, произведенных каждым животным после спаривания.

Клонирование и молекулярный анализ

Мутация uba-1 (it129) была локализована на хромосоме IV между elt-1 и dpy-20 путем трехфакторного скрещивания. Однонуклеотидные полиморфизмы, которые влияют на сайты рестрикции (snip-SNP), использовали в качестве маркеров физического картирования индивидуальных рекомбинантов uba-1 (it129) dpy-20 (e1282) с гавайским штаммом CB4856 [44]. Картирование дефицита проводили путем тестирования комплементации в гетерозиготных штаммах uba-1 (it129) / Df .РНКи генов-кандидатов выполняли путем кормления [77] и оценивали по фенокопии эмбриональной летальности F1 для обработанных взрослых гермафродитов и по дефектам морфологии взрослого хвоста для обработанных самцов L3. Комплементация аллеля с делецией uba-1 (ok1374) была определена путем создания гетерозиготных животных it129 / ok1374 и проведения анализов температурного сдвига, как описано для фенотипической характеристики. Спасение трансформации [49] было получено с помощью микроинъекции в зародышевую линию 6.Геномный фрагмент 0 kb гена uba-1 дикого типа, смешанный с плазмидой pRF4, которая содержит доминантный роликовый маркер rol-6 (su1006) , и линеаризованную геномную ДНК N2 в концентрациях 1, 50 и 100 мкг / мл соответственно. Стабильные роликовые трансгенные линии получали из uba-1 (it129) гермафродитов, поддерживаемых при 15 ° C, затем оценивали спасение спермоспецифической стерильности и эмбриональную летальность после перехода на 25 ° C.

Молекулярное поражение аллеля uba-1 (it129) было идентифицировано с помощью ПЦР-амплификации аллеля 6.0 Kb uba-1 геномный интервал мутантных червей с последующим определением последовательности. Гибридизацию in situ для экспрессии зародышевой линии uba-1 проводили на рассеченных гонадах после фиксации [78]. Меченые дигоксигенином одноцепочечные смысловые и антисмысловые зонды были получены из фрагмента кДНК размером 1 т.п.н. линейной амплификацией в соответствии с протоколом производителя (Roche, Indianapolis, IN). После гибридизации обнаружение зонда проводили с помощью колориметрического анализа с использованием конъюгированных с щелочной фосфатазой антител к дигоксигенину и субстрата NBT / BCIP.

Вестерн-блот анализ проводили на растворимых лизатах червей синхронизированных по возрасту молодых взрослых гермафродитов, сдвинутых на 25 ° в виде личинок L2. Лизаты получали с помощью одного цикла замораживания-оттаивания, гомогенизации и центрифугирования в течение 10 минут при 10000 RCF. Концентрацию белка в растворимой фракции определяли количественно с помощью анализа Брэдфорда. Образцы по 10 мкг фракционировали с помощью SDS-PAGE и переносили на мембраны из ПВДФ. Конъюгированные с убиквитином белки детектировали с помощью мышиных моноклональных антител против убиквитина (1 °), а затем с помощью конъюгированных с HRP поликлональных антител козы против IgG мыши (2 °; оба Stressgen, Ann Arbor, MI).Двойные гели окрашивали Gelcode Blue (Pierce, Rockford, IL) для визуализации общего белка.

Благодарности

Мы хотим поблагодарить Дайан Шейкс за выделение и Сэма Уорда за предоставление аллеля uba-1 (it129) , Майкла Ститцеля из лаборатории Джеральдин Сейду за предоставление штамма oma-1 :: GFP , Генетический центр Caenorhabditis и C.elegans Gene Knockout Consortium за предоставление штаммов, Энди Голден за предоставление штаммов и предложение синтетического летального эксперимента, Юджина Меламуда за помощь в структурном прогнозировании, Сару Хапип за помощь в скрининге кандидатов на РНКи, а также членов лаборатории и Балтимора / Вашингтонскому червячному сообществу за плодотворные обсуждения.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: MK HES. Проведены опыты: МК ГЭС. Проанализированы данные: МК ГЭС. Написал бумагу: МК ГЭС.

Ссылки

1. 1. Хершко А., Цехановер А. (1998) Система убиквитина. Анну Рев Биохим 67: 425–479.
2. 2. Накаяма К.И., Накаяма К. (2006) Убиквитин-лигазы: контроль клеточного цикла и рак. Нат Рев Рак 6: 369–381.
3. 3. Ardley HC, Robinson PA (2004) Роль убиквитин-протеиновых лигаз в нейродегенеративных заболеваниях.Neurodegener Dis 1: 71–87.
4. 4. Schnell JD, Hicke L (2003) Нетрадиционные функции убиквитина и убиквитин-связывающих белков. J Biol Chem 278: 35857–35860.
5. 5. Haglund K, Dikic I (2005) Убиквитилирование и передача сигналов клеток. EMBO J 24: 3353–3359.
6. 6. Mukhopadhyay D, Riezman H (2007) Независимые от протеасомы функции убиквитина в эндоцитозе и передаче сигналов. Наука 315: 201–205.
7. 7. Geetha T, Kenchappa RS, Wooten MW, Carter BD (2005) TRAF6-опосредованное убиквитинирование регулирует ядерную транслокацию NRIF, взаимодействующего с рецептором p75.EMBO J 24: 3859–68.
8. 8. Чиу Р.К., Брун Дж., Рамаекерс К., Тейс Дж., Вен Л и др. (2006) Lysine 63-polyubiquitination gurads против мутаций, индуцированных трансфузионным синтезом. PLoS Genet 2: e116.
9. 9. Lim KL, Chew KC, Tan JM, Wang C, Chung KK и др. (2005) Паркин опосредует неклассическое, протеасомно-независимое убиквитинирование синфилина-1: последствия для образования телец Леви. J Neurosci 25: 2002–2009.
10. 10. Hershko A, Heller H, Elias S, Ciechanover A (1983) Компоненты системы убиквитин-протеин-лигаза Разрешение, аффинная очистка и роль в распаде белка.J Biol Chem 258: 8206–8214.
11. 11. Джексон П.К., Элдридж А.Г., Фрид Э., Фурстенталь Л., Хсу Дж.Й. и др. (2000) История колец: распознавание субстрата и катализ убиквитинлигазами. Тенденции Cell Biol 10: 429–439.
12. 12. Старостина Н.Г., Лим Дж. М., Шварцштейн М., Уэллс Л., Спенс А. М. и др. (2007) Убиквитинлигаза CUL-2, содержащая три белка FEM, разрушает TRA-1, регулируя определение пола C. elegans . Dev Cell 13: 127–129.
13. 13.Feng H, Zhong W, Punkosdy G, Gu S, Zhou L и др. (1999) CUL-2 необходим для фазового перехода G1-to-S и конденсации митотических хромосом у Caenorhabditis elegans . Nat Cell Biol. 1: 486–492.
14. 14. Burbea M, Dreier L, Dittman JS, Grunwald ME, Kaplan JM (2002) Убиквитин и AP180 регулируют количество рецепторов глутамата GLR-1 в постсинаптических элементах в C. elegans . Нейрон 35: 107–120.
15. 15. Juo P, Kaplan JM (2004) Комплекс, стимулирующий анафазу, регулирует количество рецепторов глутамата GLR-1 в вентральном нервном канатике C.elegans. Curr Biol 14: 2057–2062.
16. 16. Schaefer H, Rongo C (2006) KEL-8 является субстратным рецептором для CUL-3-зависимой убиквитинлигазы, которая регулирует оборот синаптического рецептора глутамата. Mol Cell Biol 17: 1250–1260.
17. 17. Frazier T, Shakes D, Hota U, Boyd L (2004) Caenorhabditis elegans UBC-2 функционирует с комплексом, способствующим анафазе, но также имеет другие активности. J Cell Sci 117: 5427–5435.
18. 18. Bowerman B, Kurz T (2006) Degrade to create: требования развития для убиквитин-опосредованного протеолиза во время ранней стадии C.elegans эмбриогенез. Развитие 133: 773–784.
19. 19. Golden A, Sadler PL, Wallenfang MR, Schumacher JM, Hamill DR и др. (2000) Переходно-дефектные мутанты от метафазы к анафазе ( mat ) у Caenorhabditis elegans . J Cell Biol 151: 1469–1482.
20. 20. Дэвис Э.С., Вилле Л., Честнат Б.А., Сэдлер П.Л., Шейкс Д.К. и др. (2002) Множественные субъединицы комплекса Caenorhabditis elegans анафазы необходимы для сегрегации хромосом во время мейоза I.Генетика 160: 805–813.
21. 21. Bosu DR, Kipreos ET (2008) Убиквитин-лигазы Cullin-RING: глобальные циклы регуляции и активации. Ячейка Div 3: 7.
22. 22. Пинтар Л., Уиллис Дж. Х., Виллемс А., Джонсон Дж. Л., Срайко М. и др. (2003) Белок BTB MEL-26 является субстрат-специфическим адаптером убиквитин-лигазы CUL-3. Природа 425: 311–316.
23. 23. Xu L, Wei Y, Reboul J, Vaglio P, Shin TH и др. (2003) Белки BTB являются субстрат-специфическими адаптерами в SCF-подобной модульной убиквитинлигазе, содержащей CUL-3.Природа 425: 316–321.
24. 24. Kemphues KJ, Wolf N, Wood WB, Hirsh D (1986) Два локуса, необходимые для цитоплазматической организации у ранних эмбрионов Caenorhabditis elegans . Дев Биол 113: 449–460.
25. 25. Sonneville R, Gonczy P (2004) Zyg-11 и cul-2 регулируют прогрессию через мейоз II и установление полярности у C. elegans . Развитие 131: 3527–3543.
26. 26. Liu J, Vasudevan S, Kipreos ET (2004) CUL-2 и ZYG-11 способствуют мейотической анафазе II и правильному размещению передне-задней оси в C.elegans . Разработка 131: 3513–3525.
27. 27. DeRenzo C, Reese KJ, Seydoux (2003) Исключение белков зародышевой плазмы из соматических клонов путем cullin-зависимой деградации. Природа 424: 685–689.
28. 28. Rappleye CA, Tagawa A, Lyczak R, Bowerman B, Aroian RV (2002) Комплекс, стимулирующий анафазу, и сепарин необходимы для формирования передне-задней оси эмбриона. Dev Cell 2: 195–206.
29. 29. Shakes DC, Sadler PL, Schumacher JM, Abdolrasulnia M, Golden A (2003) Дефекты развития, наблюдаемые у гипоморфных мутантов, способствующих анафазе, связаны с аномалиями клеточного цикла.Развитие 130: 1605–1620.
30. 30. Finley D, Ciechanover A, Varshavsky A (1984) Термолабильность убиквитин-активирующего фермента из мутанта клеточного цикла млекопитающих ts85. Ячейка 37: 43–55.
31. 31. Ciechanover A, Finley D, Varshavsky A (1984) Убиквитиновая зависимость селективной деградации белка, продемонстрированная в мутанте ts85 клеточного цикла млекопитающих. Cell 37: 57–66.
32. 32. Ghaboosi N, Deshaies RJ (2007) Условный мутант дрожжей E1 блокирует путь убиквитин-протеасома и обнаруживает роль конъюгатов убиквитина в нацеливании Rad23 на протеасому.Mol Biol Cell 18: 1953–1963.
33. 33. Ли ТВ, Дин Т., Чен З., Раджендран В., Шерр Х. и др. (2008) E1-убиквитин-активирующий фермент Uba1 у Drosophila автономно контролирует апоптоз и неавтономно рост тканей. Развитие 135: 43–52.
34. 34. Jones D, Crowe E, Stevens TA, Candido EP (2002) Функциональный и филогенетический анализ системы убиквитилирования в Caenorhabditis elegans : убиквитин-конъюгирующие ферменты, убиквитин-активирующие ферменты и убиквитин-подобные белки.Genome Biol 3: RESEARCH00021-15.
35. 35. Камат Р.С., Фрейзер А.Г., Донг Й., Пулин Г., Дурбин Р. и др. (2003) Систематический функциональный анализ генома Caenorhabditis elegans с использованием РНКи. Природа 421: 231–237.
36. 36. Сонничсен Б., Коски Л. Б., Уолш А., Маршал П., Нойман Б. и др. (2005) Полногеномное профилирование РНКи раннего эмбриогенеза у Caenorhabditis elegans. Природа 434: 462–469.
37. 37. Hodgkin JA, Horvitz HR, Brenner S (1979) Неразрывные мутанты нематоды Caenorhabditis elegans .Генетика 91: 67–94.
38. 38. Ward S, Carrel JS (1979) Оплодотворение и конкуренция сперматозоидов у нематоды Caenorhabditis elegans . Дев Биол 73: 304–321.
39. 39. Wolf N, Hirsh D, McIntosh JR (1978) Сперматогенез у самцов свободноживущей нематоды, Caenorhabditis elegans . J Ultrastruct Res 63: 155–169.
40. 40. Ward S, Argon Y, Nelson GA (1981) Морфогенез сперматозоидов у мутантов Caenorhabditis elegans дикого типа и мутантов с дефектом оплодотворения.J Cell Biol 91: 26–44.
41. 41. Нельсон Г.А., Уорд С. (1980) Слияние везикул, расширение псевдоподов и подвижность амебов индуцируются в сперматидах нематод ионофором монензином. Cell 19: 457–464.
42. 42. Уорд С., Хоган Э., Нельсон Г. А. (1983) Инициирование спермиогенеза у нематоды Caenorhabditis elegans. Дев Биол 98: 70–79.
43. 43. Shakes DC, Ward S (1989) Инициирование спермиогенеза у C. elegans : фармакологический и генетический анализ.Дев Биол 134: 189–200.
44. 44. Wicks SR, Yeh RT, Gish WR, Waterston RH, Plasterk RH (2001) Быстрое картирование генов в Caenorhabditis elegans с использованием карты полиморфизма высокой плотности. Нат Генет 28: 160–164.
45. 45. Hirsh D, Oppenheim D, Klass M (1976) Развитие репродуктивной системы Caenorhabditis elegans . Дев Биол 49: 200–219.
46. 46. Berry LW, Westlund B, Schedl T (1997) Образование опухоли зародышевой линии, вызванное активацией glp-1 , члена Caenorhabditis elegans семейства рецепторов Notch.Разработка 124: 925–936.
47. 47. Francis R, Barton MK, Kimble J, Schedl T (1995) gld-1 , ген-супрессор опухоли, необходимый для развития ооцитов у Caenorhabditis elegans . Генетика 139: 579–606.
48. 48. Subramanian K, Seydoux G (2003) Дедифференцировка первичных сперматоцитов в опухоли зародышевых клеток у C. elegans , лишенных пумилиоподобного белка PUF-8. Curr Biol 13: 134–139.
49. 49. Mello CC, Kramer JM, Stinchcomb D, Ambros V (1991) Эффективный перенос генов в C.elegans : внехромосомное поддержание и интеграция трансформирующих последовательностей. EMBO J 10: 3959–3970.
50. 50. Маккей С.Дж., Джонсен Р., Хаттра Дж., Асано Дж., Бэйли Д.Л. и др. (2004) Профили экспрессии генов клеток, тканей и стадий развития нематоды C. elegans . Колд-Спринг-Харб Symp Quant Biol 68: 159–169.
51. 51. Lois LM, Lima CD (2005) Структуры SUMO E1 обеспечивают механистическое понимание активации SUMO и рекрутирования E2 в E1.EMBO J 24: 439–451.
52. 52. Walden H, Podgorski MS, Schulman BA (2003) Понимание каскада переноса убиквитина из структуры активирующего фермента для NEDD8. Природа 422: 330–334.
53. 53. Kitagawa R, Law E, Tang L, Rose AM (2002) Гомолог Cdc20, FZY-1, и его взаимодействующий белок, IFY-1, необходимы для правильной сегрегации хромосом у Caenorhabditis elegans . Curr Biol 12: 2118–2123.
54. 54. Lin R (2003) Мутация увеличения функции в oma-1 , C.elegans , необходимый для созревания ооцитов, приводит к замедленной деградации материнских белков и гибели эмбрионов. Дев Биол 258: 226–239.
55. 55. Kipreos ET, C. elegans Research Community, редакторы (2005) Пути, опосредованные убиквитином. WormBook. Доступно: http://www.wormbook.org.
56. 56. Savage C, Das P, Finelli AL, Townsend SR, Sun CY и др. (1996) Caenorhabditis elegans гены sma-2 , sma-3 и sma-4 определяют консервативное семейство компонентов пути трансформирующего фактора роста бета.Proc Natl Acad Sci U S A 93: 790–794.
57. 57. Сузуки Ю., Янделл, доктор медицины, Рой П.Дж., Кришна С., Сэвидж-Данн С. и др. (1999) Гомолог BMP действует как дозозависимый регулятор размера тела и паттерна мужского хвоста у Caenorhabditis elegans . Развитие 126: 241–250.
58. 58. Itoh S, ten Dijke P (2007) Отрицательная регуляция передачи сигнала рецептора TGF-бета / Smad. Curr Opin Cell Biol 19: 176–184.
59. 59. Baarends WM, Hoogerbrugge JW, Roest HP, Ooms M, Vreeburg J, et al.(1999) Убиквитинирование гистонов и ремоделирование хроматина в сперматогенезе мышей. Дев Биол 207: 322–333.
60. 60. Сутовский П., Морено Р., Рамальо-Сантос Дж., Доминко Т., Томпсон В.Е. и др. (2001) Предполагаемый убиквитин-зависимый механизм распознавания и устранения дефектных сперматозоидов в придатке яичка млекопитающих. J Cell Sci 114: 1665–1675.
61. 61. Guardavaccaro D, Kudo Y, Boulaire J, Barchi M, Busino L и др. (2003) Контроль мейотической и митотической прогрессии с помощью белка F-бокса бета-Trcp1 in vivo.Dev Cell 4: 799–812.
62. 62. Морокума Ю., Накамура Н., Като А., Нотоя М., Ямамото Ю. и др. (2007) MARCH-XI, новая трансмембранная убиквитинлигаза, участвующая в убиквитин-зависимом сортировке белков в развивающихся сперматидах. J Biol Chem 282: 24806–24815.
63. 63. Kelleher JF, Mandell MA, Moulder G, Hill KL, L’Hernault SW и др. (2000) Myosin VI необходим для асимметричной сегрегации клеточных компонентов во время сперматогенеза C. elegans .Curr Biol 10: 1489–1496.
64. 64. Sawada H, Sakai N, Abe Y, Tanaka E, Takahashi Y и др. (2002) Внеклеточное убиквитинирование и опосредованная протеасомами деградация рецептора асцидиевой спермы. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 1223–1228.
65. 65. Slack FJ, Basson M, Liu Z, Ambros V, Horvitz HR и др. (2000) Ген lin-41 RBCC действует в гетерохронном пути C. elegans между регуляторной РНК let-7 и фактором транскрипции LIN-29.Mol Cell 5: 659–669.
66. 66. del Rio-Albrechtsen T, Kiontke K, Chiou SY, Fitch DH (2006) Новые аллели усиления функции демонстрируют роль гетерохронного гена lin-41 в морфогенезе кончика мужского кончика хвоста C. elegans . Дев Биол 297: 74–86.
67. 67. Baird SE, Ellazar SA (1999) TGFbeta-подобная передача сигналов и развитие спикул у Caenorhabditis elegans . Дев Биол 212: 93–100.
68. 68. Говард Р.А., Шарма П., Хаджар С., Колдуэлл К.А., Колдуэлл Г.А. и др.(2007) Ферменты, конъюгирующие с убиквитином, участвуют в агрегации полиглутаминового белка. BMC Cell Biol 8: 32.
69. 69. Хоппе Т., Кассата Дж., Баррал Дж. М., Спрингер В., Хутагалунг А. Х. и др. (2004) Регулирование миозин-направленного шаперона UNC-45 с помощью нового комплекса мультиубиквитилирования E3 / E4 у C. elegans . Cell 118: 337–349.
70. 70. Liao EH, Hung W, Abrams B, Zhen M (2004) SCF-подобный комплекс убиквитин-лигазы, который контролирует пресинаптическую дифференцировку.Природа 430: 345–350.
71. 71. Mehta N, Loria PM, Hobert O (2004). Генетический скрининг мутантов роста нейритов у Caenorhabditis elegans обнаруживает новую функцию F-box ubiquitin ligase component LIN-23. Генетика 166: 1253–1267.
72. 72. Ding M, Chao D, Wang G, Shen K (2007) Пространственная регуляция убиквитинлигазы E3 направляет селективное устранение синапсов. Наука 317: 947–951.
73. 73. Hodgkin J (1987) Генетический анализ гена, определяющего пол, tra-1 , у нематоды Caenorhabditis elegans .Genes Dev 1: 731–745.
74. 74. Хансен Д., Пилигрим Д. (1999) Пол и один червь: определение пола у нематоды C. elegans . Механический Дев 83: 3–15.
75. 75. Бреннер С. (1974) Генетика Caenorhabditis elegans . Генетика 77: 71–94.
76. 76. Hill KL, L’Hernault SW (2001) Анализ репродуктивных взаимодействий, которые происходят после гетероспецифических спариваний в пределах рода Caenorhabditis . Дев Биол 232: 105–114.
77. 77. Timmons L, Fire A (1998) Специфическое вмешательство проглоченной дцРНК. Nature 395: 854.
78. 78. Lee MH, Schedl T, The C. elegans Research Community, editors (2006) RNA in situ гибридизация рассеченных гонад. WormBook. Доступно: http://www.wormbook.org.

VPAT — Oracle Server E1-2c 1.0

Американский журнал акушерства и гинекологии