ZZ12678 ЛИАЗ Форсунка омывателя ЛиАЗ
Грузовой автотранспорт испытывает постоянные нагрузки, часто работает на предельных мощностях и в различных дорожных условиях, что способствует более быстрому износу деталей. Поддержать высокий эксплуатационный ресурс и бесперебойность работы ТС поможет наш каталог.Купить ZZ12678 Форсунка омывателя ЛиАЗ — 52922,621321 ЛИАЗ по выгодной цене в Москве предлагает компания SPARTS.RU. Наша специализация – доставка высококачественных комплектующих авторитетных производителей для грузовых машин.
При выходе из строя узла, в порядке планового обслуживания или при текущем ремонте важно оперативно обеспечить наличие необходимой детали. Мы поддерживаем на складе запас ходовых позиций, поэтому приобрести оригинальные и неоригинальные запчасти, вроде ZZ12678 Форсунка омывателя ЛиАЗ — 52922,621321 ЛИАЗ,возможно быстро и недорого.
Для ознакомления с ассортиментом изделий мы разместили на сайте большой каталог грузовых запчастей.
Почему покупают ZZ12678 Форсунка омывателя ЛиАЗ — 52922,621321 ЛИАЗ у нас?
Обратившись в нашу компанию, вы сможете лично оценить ее достоинства:
- сертифицированное качество деталей;
- система поиска позволяет быстро подобрать нужную деталь;
- возможность оставить VIN-запрос на конкретную модификацию;
- конкурентная стоимость;
- отсутствие брака;
- понятный интерфейс сайта;
- помощь менеджера при подборе продукции;
- онлайн-покупка с доставкой экономит ваше время;
- гарантии от производителя.
Цена на ZZ12678 Форсунка омывателя ЛиАЗ — 52922,621321 ЛИАЗ
SPARTS.RU сотрудничает напрямую с производителями, что позволяет нам пользоваться выгодными дилерскими привилегиями и поддерживать доступные цены для конечных покупателей. Кроме того, мы разрабатываем гибкие ценовые условия для наших постоянных клиентов.
СертифицированныеZZ12678 Форсунка омывателя ЛиАЗ — 52922,621321 ЛИАЗ в наличии и под заказ можно купить в интернет-магазине грузовых запчастей SPARTS.RU. Обратитесь сегодня, чтобы в ближайшее время вернуть свое ТС в рабочее состояние.
Наименование опции |
Северное исполнение |
Инвалидный: откидная аппарель, 2 места для крепления колясок с людьми с огранич. физич. возможностями, система «клининг» |
Система пожаротушения |
Система пожаротушения |
Пассажирские сиденья с наклоном спинки и ремнями безопасности |
Подготовка к установке АСКП (эл. Жгуты, поручни 2 шт.) |
Электронный рейсоуказатель ( комплект 3 шт. |
Электронный рейсоуказатель с бегущей строкой в салоне( комплект 4 шт.) с автоинформатором («Селена» или аналог) |
Указатель с бегущей строкой в салоне |
Тахограф |
Водительское сиденье «Пилот» с пневмоподвеской |
Автоинформатор |
Автомагнитола (6 динамиков в салоне) |
Лампы освещения салона люминесцентные |
Лампы освещения салона люминесцентные |
Кнопки остановки по требованию на поручнях |
Кнопки остановки по требованию на поручнях |
багажные полки |
Шины Matador (CORMORAN) |
Шины Matador (CORMORAN) |
Запасное колесо |
Новый интерьер перегородки и панели приборов кабины водителя (ЛиАЗ-5256 с дв. |
Автоматическая централизованная система смазки |
Кондиционер в кабине водителя «WABCO» |
Перегородка кабины водителя, отделяющая от салона рабочее место водителя и разделяющая дверной проем на две части, без выхода в салон (только на городские модели) |
Комплект ГЛОНАСС «Гранит-Навигатор -2.02» |
Комплект ГЛОНАСС «Гранит-Навигатор -2.07» |
Три потолочных вентилятора в салоне автобуса |
Шторки окон салона |
Звуковая сигнализация при движении задним ходом |
Герметичный отсек запасного колеса |
Наклейки из аракала одноцветные (380р. |
Наклейки из аракала многоцветные (каждый последующий 200р. /м2) |
Наклейки из аракала (золото или серебро + 10%) |
ЯМЗ)
/м2)| Цена | Количество | Единица измерения | Сумма | |
|---|---|---|---|---|
| Болт крепления суппорта профилированный для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 529265-79 | 476,85 ₽ | 717 | шт | 341 901,45 ₽ |
| Болт с шестигранной головкой для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 529265-79 | 220,92 ₽ | 1 294 | шт | 285 870,48 ₽ |
| Диск тормозной задний для ЛиАЗ-4292, шт | 31 292,84 ₽ | 235 | шт | 7 353 817,40 ₽ |
| Болт крепления колеса для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222,621320, 621321, 529265-77, 529265-79, шт | 430,29 ₽ | 5 876 | шт | 2 528 384,04 ₽ |
| Редуктор газовый для автобуса ЛиАЗ, шт | 65 580,80 ₽ | 2 | шт | 131 161,60 ₽ |
| Фильтр гидравлической системы рулевого управления для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 529265-79,621320, 621321, шт | 1 000 | шт | 121 020,00 ₽ | |
| Стекло смотровое кондиционера для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 529265-79, 621320, 621321, шт | 5 509,75 ₽ | 375 | шт | 2 066 156,25 ₽ |
| Обмотка электромагнитного клапана для кондиционера автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 529265-79, 621320, 621321, шт | 1 293,29 ₽ | 737 | шт | 953 154,73 ₽ |
| Трубопровод алюминиевый для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 529265-79 | 2 198,83 ₽ | 17 | шт | 37 380,11 ₽ |
| Трубопровод алюминиевый для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 529265-79 | 3 559,51 ₽ | 20 | шт | 71 190,20 ₽ |
| Электромагнитный клапан для автоматической коробки переключения передач автобуса ЛиАЗ 4292, 5292, 6213, шт | 8 756,29 ₽ | 96 | шт | 840 603,84 ₽ |
| Гильза для обжима хладонопровода для кондиционера автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 529265-79, 621320, 621321, шт | 123,85 ₽ | 1 000 | шт | 123 850,00 ₽ |
| Шланг соединительный для автобуса ЛиАЗ, шт | 678,77 ₽ | 347 | шт | 235 533,19 ₽ |
| Ремкомплект суппорта заднего моста (упор) для ЛиАЗ, шт | 1 155,08 ₽ | 2 000 | шт | 2 310 160,00 ₽ |
| Ремкомплект суппорта (направляющие) для ЛиАЗ, шт | 1 226,21 ₽ | 3 500 | шт | 4 291 735,00 ₽ |
| Ремкомплект суппорта (рычаг изогнутый) для ЛиАЗ, шт | 3 075,14 ₽ | 2 500 | шт | 7 687 850,00 ₽ |
| Ремкомплект суппорта (натяжной механизм) для ЛиАЗ, шт | 314,53 ₽ | 2 000 | шт | 629 060,00 ₽ |
| Ремкомплект суппорта заднего моста (бинокль, толкатели) для ЛиАЗ, шт | 2 088,02 ₽ | 2 500 | шт | 5 220 050,00 ₽ |
| Ремкомплект шкворня для ЛиАЗ 529222 | 8 322,77 ₽ | 200 | шт | 1 664 554,00 ₽ |
| Ремкомплект шкворня для ЛиАЗ 529222 | 6 827,60 ₽ | 1 000 | шт | 6 827 600,00 ₽ |
| Крестовина карданного вала для автобуса марки ЛиАЗ, шт | 1 982,61 ₽ | 872 | шт | 1 728 835,92 ₽ |
| Болт крепления колеса для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222,621320, 621321, 529265-77, 529265-79, шт | 1 042,66 ₽ | 1 234 | шт | 1 286 642,44 ₽ |
| Болт крепления колеса для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222,621320, 621321, 529265-77, 529265-79, шт | 455,86 ₽ | 14 976 | шт | 6 826 959,36 ₽ |
| Вал карданный для автобусов марки ЛиАЗ модификации 529220, 529221, 529222, шт | 33 761,82 ₽ | 20 | шт | 675 236,40 ₽ |
| Вал карданный для автобусов марки ЛиАЗ модификации 529220, 529221, 529222, шт | 50 345,01 ₽ | 50 | шт | 2 517 250,50 ₽ |
| Вал карданный для автобусов марки ЛиАЗ модификации 529220, 529221, 529222, шт | 32 090,98 ₽ | 35 | шт | 1 123 184,30 ₽ |
| Вал карданный для автобусов марки ЛиАЗ модификации 529220, 529221, 529222, шт | 8 419,90 ₽ | 20 | шт | 168 398,00 ₽ |
| Вал карданный для автобусов марки ЛиАЗ модификации 529220, 529221, 529222, шт | 7 363,29 ₽ | 5 | шт | 36 816,45 ₽ |
| Вал карданный для автобусов марки ЛиАЗ модификации 529220, 529221, 529222, шт | 7 219,81 ₽ | 200 | шт | 1 443 962,00 ₽ |
| Скоба подвижная для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 529265-79, шт | 67 698,22 ₽ | 60 | шт | 4 061 893,20 ₽ |
| Скоба подвижная для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 529265-79, шт | 65 464,29 ₽ | 60 | шт | 3 927 857,40 ₽ |
| Амортизатор передний для автобуса ЛиАЗ 5292, 6213, Волжанин 6270, шт | 5 507,97 ₽ | 600 | шт | 3 304 782,00 ₽ |
| Винт для автобуса ЛиАЗ 529220, 529221, 529222, 526213, шт | 348,87 ₽ | 600 | шт | 209 322,00 ₽ |
Зеленоград — Новости — Автобусы-«гармошки» уберут из Зеленограда
Все оставшиеся на зеленоградских автобусных маршрутах ЛиАЗы, в том числе большие сочленённые, заменят автобусами НефАЗ.
Хотя в «гармошки» влезает на сорок с лишним пассажиров больше, но их отдадут в другие московские округа.
О замене зеленоградских автобусов на НефАЗы впервые объявили во время праздничного шествия по Центральному проспекту в День города — новые автобусы тоже прокатились в колонне. «Так что, „гармошки“ уберут с маршрутов?» — спросил Андрей К. префектуру. Да, ответили ему. Автобусы ЛиАЗ 621321 и 621365 (это и есть модификации «гармошек»), как и все остальные этой марки, будут переданы в другие филиалы ГУП «Мосгортранс».
Новые автобусы марки НефАЗ начали ездить по Зеленограду в начале ноября. В таком автобусе 29 сидячих мест (в укороченном ЛиАЗ 4292 и ЛиАЗ 5292.65, используемых зеленоградским автокомбинатом, — 18 и 23 соответственно), всего может вместиться 111 пассажиров. Забавно, что в своем ответе префектура сравнивает вместимость НефАЗов с укороченным ЛиАЗом, хотя вопрос был о длинных автобусах-«гармошках».
В начале осени на зеленоградских маршрутах — в основном 15-м и 19-м — работали двадцать вместительных сочлененных автобусов, в которых больше стоячих мест, чем во всех остальных имеющихся автобусах.
На 400-е маршруты, где такие автобусы удобны, их выпускают только как дополнительные в часы пик. В зависимости от модели, в сочлененных автобусах 150-154 пассажирских мест, из них 30-34 посадочных. В ГолАЗах и ЛиАЗах междугородного класса, работающих на маршруте 400 «экспресс», больше сидячих мест (47-53), зато намного меньше стоячих — 10-13 в соответствии с техническими характеристиками.
Ранее зеленоградцы предлагали запустить автобусы-«гармошки» именно на этот маршрут: «экспресс» идёт до метро быстро, можно и постоять, а пассажиров в такой автобус поместится в два раза больше, чем в ГолАЗ. И в полтора раза больше, чем в НефАЗ, который сейчас начали выпускать и на 400-е маршруты.
Обоснование решения о ликвидации автобусов особо большой вместимости не приводится. «Зеленоград.ру» отправит запрос об этом в «Мосгортранс».
границ | Вызванное Plasmodiophora brassicae увеличение клеток и потеря целостности клеток в корневых системах опосредованы деметилированием пектина
Введение
Болезнь косолапости, вызываемая возбудителем простейших Plasmodiophora brassicae , вызывает обширное повреждение посевов масличного рапса и овощных культур капусты.
Облигатный биотроф, P. brassicae , растет внутриклеточно в корневой системе хозяина и манипулирует развитием подземных частей растения, образуя характерные галлы.Перепрограммирование клеток в подземных частях растений позволяет патогену приобретать питательные вещества хозяина и обеспечивать пространство для образования спор (Malinowski et al., 2019). В конце концов, корневая система зараженных растений распадается, и оставшиеся споры попадают в почву, где они сохраняют свой потенциал заражения до 20 лет. Обильный рост колонизированных патогенами клеток и локальное разложение клеточной стенки, которое сопровождает появление вторичных плазмодиев с последующим образованием и созреванием спор в состоянии покоя, является характерным симптомом болезни кайлы (Gustafsson et al., 1986). Было показано, что это увеличение клеток опосредуется брассиностероидами (Schuller et al., 2014) и включает как ремоделирование клеточной стенки (Devos et al., 2006), так и эндоредупликацию (Olszak et al.
, 2019). Schuller et al. (2014) предположили, что этот ответ может быть опосредован перекрестными помехами ауксин-брассиностероид, нарушение которых приводит к изменениям в распределении и развитии патогенов. Индукция гипертрофии органов растения-хозяина — это обычная стратегия вредителей и патогенов, используемая для установления благоприятных трофических отношений и облегчения размножения паразита.В природе мы можем наблюдать множество примеров, например, скатывание листьев, вызванное насекомыми-насекомыми или галлами, вызванными Agrobacterium tumefaciens , а также галлами на корнях, созданными нематодами или P. brassicae (Gätjens-Boniche, 2019). Гипертрофия органа-хозяина обеспечивает пространство для патогена и повышает клеточный метаболизм, перенаправляя распределение питательных веществ и отношения между источниками и стоками внутри растения (Chandran et al., 2010; Bragança et al., 2016; Walerowski et al., 2018).Изменения клеточной стенки не только важны для роста и увеличения, но также способствуют ограничению распространения патогенов внутри хозяина (Bohlmann and Sobczak, 2014).
Способность патогенов ферментативно разрушать клеточные стенки хозяина также влияет на их инфекционность и высвобождение обратно в окружающую среду (Walton, 1994).
Рост растительных клеток, управляемый тургором, требует постоянной корректировки состава клеточной стенки — ее синтеза, разрыхления и последующего усиления (Wei and Lintilhac, 2007).Эти события имеют огромное влияние на напряженность на уровне органов; следовательно, регуляция динамики клеточной стенки включает соответствующий контроль баланса клеточной адгезии / разделения клеток, который сильно зависит от статуса пектина и вторичных модификаций клеточной стенки (Jarvis et al., 2003). Транскриптомные и протеомные исследования болезни калы выявили обширные изменения в генах и белках хозяина, участвующих в синтезе и обновлении клеточной стенки (Devos et al., 2006; Badstöber et al., 2020). Кроме того, деградация или утолщение стенки клетки-хозяина документально подтверждена на микроскопическом уровне (Donald et al., 2008).
Однако до сих пор функционально охарактеризовано только действие белков ксилоглюкан-эндотрансглюкозилазы / гидролазы (XTH) на первичную клеточную стенку во время роста галла (Devos et al., 2005). В этом исследовании мы исследовали изменения белков, связанных с клеточной стенкой, в двух временных точках: через 20 дней после заражения (DAI), когда происходит экспансия клеток, вызванная патогенами, и 26 DAI, когда происходит как увеличение клеток, так и деградация клеток, связанная со спорами патогенов. выпуск происходит. Среди дифференциально накапливающихся белков мы обнаружили пектинметилэстеразу 18 (PME18) и провели дальнейшее исследование, функционально охарактеризовав ее потенциальную роль в обеспечении P.brassicae — гипертрофия органов, вызванная действием. Кроме того, мы использовали рамановскую спектроскопию для определения пектинового статуса клеточных стенок, содержащих увеличенные клетки, колонизированные патогенами. Мы обсуждаем важность деметилирования пектина для протекания более поздних стадий развития галла, вызванного P.
brassicae .
Материалы и методы
Растительный материал
Во всех экспериментах Arabidopsis thaliana образца Columbia-0 (Col-0) использовали в качестве контроля. Мутантная линия одиночной вставки Т-ДНК pme18-2 (SALK_076975; Alonso et al., 2003) на фоне Col-0 был получен из Ноттингемского фондового центра арабидопсиса (ID N576975) как единое, сегрегированное поколение Т3 с фланг-меткой. Гомозиготные мутантные растения отбирали на 0,6% (мас. / Об.) Агаровой среде (BioShop), содержащей соли Мурашиге и Скуга (MS; Duchefa) и 75 мг L -1 канамицина в соответствии с протоколом Harrison et al. (2006) и были протестированы на включение Т-ДНК и гомозиготность с помощью ПЦР с использованием праймеров, разработанных с помощью инструмента разработки праймеров Т-ДНК (дополнительная таблица S1).В процессе отбора мы наблюдали фенотипическую сегрегацию, при которой только растения, гомозиготные по вставке Т-ДНК, имели измененный размер розетки.
Отобранные гомозиготные мутантные растения также тестировали на наличие транскрипта гена PME18 , и определяли только остаточные уровни (дополнительная фигура S1). Для этого была рассчитана и нормализована относительная экспрессия генов с помощью программного обеспечения REST-MCS с использованием трех эталонных генов ( PP2A-At1g13320, TIP41-At4g34270 и UBC9-At4g27960 ; дополнительная таблица S1) согласно Pfaffl et al.(2002).
Условия выращивания и инокуляция
Все эксперименты проводились в контролируемых условиях роста при освещенности 100 мкмоль · м -2 с -1 , с фотопериодом 9 часов света / 15 часов темноты и температур 22 ° C днем / 20 ° C ночью. и 65% влажности. Поверхность семян стерилизовали погружением на 2 мин в 70% этанол, затем на 10 мин в 5% гипохлорите натрия (коммерческий отбеливатель), промывали стерильной водой, выдерживали 5 дней при 4 ° C и проращивали in vitro наполовину. чашки с агаром MS, содержащие 0.
6% (мас. / Об.) Агара и 1% (мас. / Об.) Сахарозы, pH 5,7. Через 10 дней после прорастания отобранные проростки (с размером розетки от 1,2 до 1,5 см) переносили в почвенный субстрат (Kronen-Klasmann Potgrond LT 011 и перлит, 7: 1). Через 17 дней после прорастания растения заражали 2 мл суспензии спор P. brassicae P1 (Some et al., 1996) в концентрации 1 × 10 6 спор на мл -1 . Инокулят готовили, как описано Malinowski et al. (2012). Контрольные растения ложно обрабатывали 2 мл воды.Для экстракции белков клеточной стенки ткань гипокотиля собирали через 20 и 26 дней после инокуляции (DAI) в двух независимых биологических повторностях, в каждой по 90 растений на комбинацию. Для экстракции РНК ткань гипокотиля собирали 7, 10, 16, 20 и 26 DAI в трех независимых биологических повторах, каждая с 30 растениями на комбинацию. Собранные образцы гипокотилей немедленно замораживали в жидком азоте и хранили при -70 ° C до дальнейшей обработки. Для микроскопии ткань гипокотиля собирали 20 и 26 DAI и обрабатывали, как описано далее.
Изоляция клеточной стенки и экстракция белка
Очистку клеточных стенок от ткани гипокотиля и экстракцию белков клеточной стенки проводили в соответствии с методом, описанным Feiz et al. (2006) с некоторыми модификациями. Для каждого образца равные количества замороженной ткани гипокотиля гомогенизировали в ступке с использованием 5 мМ ацетатного буфера с низкой ионной силой (pH 4,6), содержащего 0,4 М сахарозу и коктейль ингибиторов протеазы (cOmplete Mini EDTA-free, Sigma-Aldrich). После добавления поливинилпирролидона (ПВП; 1 г на 10 г сырой массы гипокотилей) гомогенат инкубировали 30 мин на льду при перемешивании на роторной платформе.Стенки клеток отделяли от цитоплазматического содержимого центрифугированием при 1000 × g в течение 15 мин при 4 ° C. Затем осадок очищали двумя последовательными центрифугированием при 1000 × g в течение 15 мин при 4 ° C в 5 мМ ацетатном буфере (pH 4,6), содержащем 0,6 М и 1 М сахарозу, соответственно. Оставшийся осадок промывали 5 мм ацетатным буфером (pH 4,6) на сетчатом фильтре для клеток 40 мкм (Corning).
Полученную фракцию клеточной стенки измельчали до тонкого порошка в жидком азоте с использованием ступки. Белки экстрагировали встряхиванием порошка клеточной стенки в течение 10 мин при комнатной температуре в 0 ° С.2 M раствор CaCl 2 в 5 мМ ацетатном буфере (pH 4,6), содержащий коктейль ингибиторов протеаз, с последующим центрифугированием при 4000 × g в течение 15 минут при 4 ° C. Супернатант собирали, и процедуру экстракции повторяли с оставшимся осадком. Два супернатанта объединяли, полученный экстракт белка клеточной стенки обессоливали и концентрировали на центробежных фильтрах Amicon Ultra-0,5 мл с отсечкой 3 кДа мВт (Millipore).
Двумерный гель-электрофорез (2D GE) и идентификация белков
Концентрацию белка в экстрактах белков клеточной стенки оценивали с помощью набора 2D Quant (GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания).Протеомный анализ полных экстрактов белка клеточной стенки из 3 г ткани гипокотиля (200–250 мкг белка на образец), включая 2D GE и масс-спектрометрию (MS), выполняли, как описано Perlikowski et al.
(2016) с некоторыми изменениями. В первом измерении, изоэлектрическое фокусирование (IEF), для фокусировки экстрагированных белков использовались 24-сантиметровые полоски высушенного геля (IPG Blue Strips, Serva) с иммобилизованным линейным диапазоном pH 6–10. Регидратация и фокусировка выполнялись в Ettan IPGphor II (GE Healthcare) при 20 ° C и 50 мкА на полоску со следующей программой: 12 часов регидратации при 0 В и 9 часов фокусировки (1 час при 500 В, 2 часа при 1000 В и 6 ч при 8000 В).Во втором измерении белки разделяли с помощью SDS-PAGE с использованием 13% полиакриламидных гелей (1,5 × 255 × 196 мм). Гели окрашивали коллоидным кумасси бриллиантовым синим (BioShop) G-250 с использованием модифицированного метода Neuhoff et al. (1988), сканированные с помощью ImageScanner III (GE Healthcare) и обработанные с помощью программы LabScan 6.0 (GE Healthcare). Обнаружение пятен и анализ изображений (сопоставление пятен) выполнялись с использованием программного обеспечения Image Master 2-D Platinum 6.0 (GE Healthcare). Анализ 2D GE был выполнен для двух независимых биологических повторов.Дифференциальные пятна, которые присутствовали только для инфицированных образцов, вырезали из гелей и анализировали с помощью жидкостной хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией в лаборатории масс-спектрометрии Института биохимии и биофизики Польской академии наук (Варшава, Польша). Необработанные данные анализировали с помощью программного обеспечения Mascot Distiller (версия 2.3, MatrixScience). Полученные пептидные массы и спектры фрагментации были сопоставлены с неизбыточной базой данных Национального центра биотехнологической информации (NCBI) с фильтром Arabidopsis с использованием поисковой машины Mascot (Mascot Daemon v2.3, Mascot Server v2.3.02; MatrixScience). Для дальнейшего анализа были выбраны кандидаты с наивысшим баллом технологии многомерной идентификации белков Mascot. Для унификации выбранных идентичностей белков было выполнено дополнительное сравнение BLAST-P. Данные масс-спектрометрической протеомики были депонированы в ProteomeXchange Consortium через партнерский репозиторий PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019) с идентификаторами набора данных PXD026660 и 10.6019 / PXD026660.
SDS-PAGE и вестерн-блот-анализ
Концентрацию белка в экстрактах белков клеточной стенки из 1 г ткани гипокотиля оценивали с помощью набора Qubit Protein Assay Kit с использованием флуорометра Qubit 3 (Thermo Fisher Scientific).Внеклеточные образцы, содержащие 10 мкг белка, инкубировали с 5-кратным буфером для образцов SDS в течение 10 мин при 95 ° C, разделяли с помощью SDS-PAGE в восстанавливающих условиях и подвергали электроблоттингу на 0,2 мкм мембранах PVDF (Immun-Blot PVDF, Bio-Rad). Блоты блокировали 5% (мас. / Об.) Сухим обезжиренным молоком в трис-буферном солевом растворе (TBS; 150 мМ NaCl, 10 мМ Трис, 0,1% (об. / Об.) Тритон X-100, pH 7,6) и инкубировали в течение 2 часов. с разведенным 1: 1000 поликлональным кроличьим антителом против PME18, конъюгированным с пероксидазой хрена (Bioss Antibodies, США).Обнаружение проводили с использованием колориметрического анализа с использованием тетрагидрохлорида 3,3′-диаминобензидина (Roth) в качестве субстрата. Вестерн-блоттинг проводили для двух независимых биологических повторов с 90 растениями на комбинацию, каждый с тремя техническими повторами. Блоты сканировали с помощью планшетного сканера (Hewlett-Packard Color LaserJet Pro M177), и количество белка оценивали с помощью программного обеспечения ImageJ (Schneider et al., 2012) путем измерения интенсивности пикселей (среднего значения серого) обнаруженного сигнала.Загрузку белка визуализировали путем окрашивания мембраны 0,5% (мас. / Об.) Ponceau S в 1% уксусной кислоте.
КПЦР в реальном времени
РНКиз гипокотилей выделяли с помощью набора Total RNA Mini Plus (A&A) в соответствии с протоколом производителя, обрабатывали ДНКазой I (Thermo Fisher Scientific) и количественно оценивали с помощью оборудования Nano-Drop (Thermo Fisher Scientific). Синтез первой цепи кДНК выполняли на 2 мкг РНК с помощью набора RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher Scientific) в соответствии с инструкциями производителя.Реакции RT-qPCR выполняли с использованием прибора LightCycler 480 (Roche) и набора SensiMix SYBR No-ROX (Bioline). Каждую амплификацию выполняли с использованием ген-специфических олигонуклеотидных праймеров, разработанных с использованием инструмента Primer3Plus для кПЦР (дополнительная таблица S1), и конечная концентрация матрицы кДНК в реакции составляла 2 нг мкл -1 . Программа была следующей: 10 мин 95 ° C — 40 × (20 с 95 ° C — 20 с 60 ° C — 20 с 72 ° C), заканчивая построением кривой плавления. Три технических повтора были объединены, чтобы получить среднее значение для каждого биологического повтора, и три независимых биологических повтора были проанализированы для каждого условия.Относительные уровни экспрессии генов были рассчитаны и нормализованы с помощью программного обеспечения REST-MCS с использованием среднего геометрического двух эталонных генов ( TIP41-At4g34270 и UBC9-At4g27960 ; дополнительная таблица S1) в соответствии с методом, описанным Pfaffl et al. (2002).
Секвенирование транскриптов
Анализируемые здесь данные RNA-seq были ранее опубликованы Malinowski et al. (2016), а необработанные данные этого эксперимента доступны в Европейском нуклеотидном архиве под идентификатором PRJEB12261.Существенно дифференциально экспрессируемые гены были идентифицированы с использованием пакета DESeq2 в статистической среде R, при этом частота ложных открытий была рассчитана с использованием пакета q -value (Love et al., 2014). Тепловые карты были созданы с использованием пакета pheatmap в R.
Световая микроскопия
Для анатомического наблюдения и измерений собранные гипокотили инкубировали в течение ночи при 4 ° C в фиксирующем растворе PFA-GA (2% параформальдегид, 2% глутаральдегид, 1% кофеин, 1 × фосфатно-солевой буфер и pH 7.4), обезвоженные в серии растворов этанола возрастающей концентрации (от 30 до 100%), залитые в смолу Technovit 7100 (Kulzer) и разрезанные на ротационном микротоме (Leica). Полученные срезы размером 5 мкм окрашивали 0,05% раствором толуидинового синего (Roth) (в лимонно-фосфатном буфере, pH 4,0) или 0,3% раствором альцианового синего (Roth) (в 3% уксусной кислоте), где сафранин O (Acros Organics) использовался как контрастное пятно. Срезы, дважды окрашенные альциановым синим / сафранином О, использовали для количественной оценки деэтерифицированного пектина с помощью программного обеспечения ImageJ, где площадь окрашивания альциановым синим измеряли с использованием регулировки порогового цвета в цветовом пространстве RGB и рассчитывали относительно общей площади среза гипокотиля. .Срезы, окрашенные толуидиновым синим, использовали для измерения ширины гипокотиля, увеличенного размера и количества клеток, а также увеличения гипокотиля с использованием программного обеспечения ImageJ. Все срезы помещали в 50% раствор глицерина и фотографировали с помощью системы микроскопа Carl Zeiss AXIO Imager.M2.
Рамановская спектроскопия
Для рамановской микроскопии собранные гипокотили заключали в смолу Shandon Cryomatrix (Thermo Scientific), замораживали в жидком азоте и хранили при -70 ° C. Встроенные замороженные тканевые блоки были обрезаны и разрезаны (толщиной 30 мкм) с помощью криомикротома CM1520 (Leica).Срезы прикрепляли к предметному стеклу микроскопа, покрытому алюминиевой фольгой, чтобы избежать влияния полос стекла на спектры комбинационного рассеяния (Chylińska et al., 2014), и сушили при 60 ° C на нагревательной пластине. Для рамановской визуализации была выбрана область паренхиматозной ткани. Для инфицированных образцов отдельно контролировали области увеличенных, колонизированных патогенами клеток (больших) и нормальных (малых) клеток. Рамановские карты получали с помощью рамановского микроскопа DXR (Thermo Scientific Inc., США), оснащенного твердотельным зеленым лазером с диодной накачкой λ = 532 нм с максимальной мощностью 10.0 мВт. Спектральное разрешение микроскопа составляло 4 см -1 с дифракционной решеткой 900 штрихов на мм и апертурой точечного отверстия 50 мкм. В системе используется ПЗС-детектор с воздушным охлаждением и линза объектива 20 × / 0,40. Карты были записаны с пространственным разрешением 2 мкм в направлениях x и y; направление z было зафиксировано во время записи карты. Время интегрирования составляло 2 с и фиксировалось для каждого сканирования. Для каждого образца и региона (нормальные и колонизированные клетки) было получено не менее трех карт.Один спектр в каждой точке регистрировался в диапазоне 3500–150 см –1 рамановского сдвига в среднем для 20 сканирований. Обработка изображений производилась в Omnic (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), спектры не нормализовались. Рамановские химические изображения для выбранных полос были проанализированы путем интегрирования рамановских полос. Полоса с максимумом при 2936 см -1 , представляющая растяжение C-H в полисахаридах клеточной стенки, была интегрирована для визуализации клеточной стенки целого растения.Степень метилирования пектиновых полисахаридов в клеточных стенках оценивалась на основании положения и интенсивности пиков в диапазоне от 840 до 857 см -1 , которые представляют собой валентные колебания (1,4) -α-гликозидной связи в молекулах пектина ( Сыница и др., 2003). Вся спектральная обработка проводилась с помощью Origin Pro 8.5 (OriginLab Corporation, США).
Результаты
Протеомика клеточной стенки выявляет повышенное накопление белков, потенциально участвующих в увеличении клеток или деградации тканей в развитии галлов косы
Накопление внеклеточных белков при интенсивном росте галлов у P.brassicae -инфицированные гипокотили Arabidopsis исследовали методом двумерного гель-электрофореза (2D GE). Образцы белка, выделенные из клеточных стенок неинфицированных и инфицированных (20 DAI и 26 DAI) образцов, подвергали изоэлектрической фокусировке в градиенте pH 6–10 с последующим разделением с помощью SDS-PAGE. Первая временная точка, 20 DAI, представляет собой переходную фазу между стадией пролиферации инфекции, когда клетки внутри инфицированных гипокотилей делятся, и стадией экспансии инфекции, когда клетки гипокотиля подвергаются тяжелой гипертрофии.Вторая временная точка, 26 DAI, представляет собой продвинутую стадию расширения галла, когда можно наблюдать образование спор в состоянии покоя (рис. 1A). Анализ 2D-гелей выявил присутствие различных дифференциальных белковых пятен, специфичных для образцов, выделенных из инфицированных растений при 20 DAI и 26 DAI (дополнительная фигура S2). Белковые пятна дополнительно подвергали идентификации MS. Все идентифицированные белки (рисунок 1B и дополнительный рисунок S3) кодируются геномом Arabidopsis, и никаких белков P. brassicae обнаружено не было.Большинство белков, обнаруженных при 20 DAI, имели внеклеточную локализацию, и только некоторые из них были внутриклеточными (например, белок семейства серинкарбоксипептидазы S28 и белок семейства лактат / малатдегидрогеназы в пятне № 3, гистидинолдегидрогеназа в пятне № 5 или глицеральдегид -3-фосфатдегидрогеназа 1 и 2 в пятнах № 6 и 7). Напротив, идентификация белка при 26 DAI выявила в первую очередь убиквитин-родственные белки, которые характеризуются ядерной и / или цитоплазматической локализацией и как таковые должны рассматриваться как внутриклеточное загрязнение.На этой стадии галлы содержат множество заполненных спорами увеличенных клеток, а некоторые хозяйские клетки на продвинутой стадии колонизации начали распадаться.
Рисунок 1 . Протеомный анализ образцов клеточной стенки гипокотилей Col-0 после заражения Plasmodiophora brassicae . (A) Окрашенные толуидиновым синим поперечные 5 мкм срезы гипокотилей растений Col-0 до (имитация) и после заражения P. brassicae , демонстрируя образование гигантских клеток 20 DAI и 26 DAI.Масштабные линейки представляют 50 мкм. Звездочки указывают на увеличенные клетки, заполненные покоящимися спорами (желтые) или вторичные плазмодии (пурпурный). (B) Список идентифицированных белков (сопоставление P-BLAST) вместе с изображениями пятен дифференциальных белков (присутствующих только в образцах, выделенных из инфицированных растений) 20 DAI (точки, отмеченные 1–8) и 26 DAI (точки, отмеченные 9–11) ). Полные необработанные двухмерные карты белков показаны на дополнительном рисунке S1. Выявленные белки, потенциально участвующие в ремоделировании клеточной стенки, выделены жирным шрифтом. a Нумерация точек такая же, как на панели (B) . b Запись в базу данных (согласно NCBInr) гомологичного белка. c Гомологичный белок Arabidopsis. d Arabidopsis AGI № e Оценка технологии многомерной идентификации белка талисмана. f Покрытие аминокислотной последовательности идентифицированных белков. Положение идентифицированных пептидов, сопоставленных с полными последовательностями, показано на дополнительном рисунке S3.
Семь из идентифицированных белков потенциально участвуют в ремоделировании клеточной стенки, и они выделены жирным шрифтом на рисунке 1B.В основном эти белки принадлежат к семейству пероксидаз, а именно PRX32, PRX33, PRX34, PRX37 и PRX38. Эти факторы обычно участвуют в защитных реакциях; однако они также играют роль в экспансии клеток посредством опосредованной ROS деградации полисахаридов клеточной стенки (Liszkay et al., 2003; Müller et al., 2009). Другие пятна, содержащие белки, потенциально участвующие в ремоделировании клеточной стенки, а именно β-гликозидазы BXL7 и BXL4, как известно, участвуют в метаболизме арабинанов, ксиланов и арабиноксиланов и влияют на гибкость клеточной стенки (Minic et al., 2004; Gaudet et al., 2011). Мы также обнаружили повышенное накопление PME18 в ответ на инфекцию. Пектинметилэстеразы (PME) потенциально модифицируют клеточные стенки посредством деметилэстерификации пектина (Jolie et al., 2010). PME регулируют механическую прочность клеточной стенки и отвечают за клеточную адгезию (Daher and Braybrook, 2015). Ранее было показано, что PME18 способствует формированию иммунитета против бактериального патогена Pseudomonas syringae (Bethke et al., 2014), и до сих пор роль этого конкретного члена PME в клеточном росте не изучалась. В пятне № 4 мы также идентифицировали пептиды, соответствующие гепараназоподобному белку 1. Этот белок, содержащий активность β-глюкуронидазы, предположительно изменяет углеводный состав сложных полисахаридных цепей арабиногалактановых белков на поверхности клетки и тем самым влияет на процесс клеточной удлинение (Eudes et al., 2008). Один пептид, идентифицированный в пятне № 11, соответствует пектин ацетилэстеразе 11, которая потенциально изменяет физические свойства клеточной стенки посредством деацетилирования пектина (de Souza et al., 2014).
Паттерн накопления белка и транскриптов пектинметилэстеразы 18 после заражения
В этом исследовании мы решили подробно рассмотреть потенциальную роль накопления PME18 в влиянии изменений пектинового статуса, происходящих на поздних стадиях инфекции P. brassicae . Чтобы проверить протеомные данные, мы провели количественный анализ накопления белка PME18 в растениях Col-0 до и после заражения с помощью метода вестерн-блоттинга (WB). Это исследование лишь частично подтвердило достоверность протеомных результатов, поскольку мы наблюдали повышенное накопление PME18 в развивающихся галлах только 20 DAI и отсутствие статистической разницы при 26 DAI (рисунки 2A, B).Поскольку расположение идентифицированных пятен, содержащих PME 18 на 2-D гелях, различается между 20 DAI и 26DAI (дополнительный рисунок S2), мы приписываем наблюдаемое различие между протеомными и WB-исследованиями процессами деградации, которые происходят на поздних стадиях болезни кайлы. Мы не обнаружили полосу предварительно обработанного PME 62 кДа в исследуемой внеклеточной фракции. Мы проследили наши исследования с анализом RT-qPCR и обнаружили, что накопление белка PME18 не отражается на уровне транскрипции PME18 (локус At1g11580 ), поскольку не наблюдалось статистически значимых изменений в сопоставимых временных точках по сравнению с неинфицированным контролем. (Рисунок 2C).Чтобы получить более широкое представление о контексте транскрипционных ответов хозяина, потенциально связанных с ремоделированием и обновлением клеточной стенки, происходящим в галлах, мы проанализировали транскрипционные данные, полученные для корней и гипокотилей на 16 и 26 DAI из нашей предыдущей работы (Malinowski et al., 2016 ). Мы обнаружили, что, несмотря на интенсивный рост клеток в галлах, члены семейств генов, связанных с ремоделированием или ослаблением клеточной стенки, не всегда отвечают активацией транскрипции (дополнительный рисунок S4).При развитии галлов на 26 DAI (область гипокотиля — основное место образования галла у Arabidopsis) значительно увеличилась экспрессия только двух целлюлаз, двух пектатлиаз и четырех генов PME (дополнительный рисунок S4). В случае расширений, семь членов были активированы, а 11 — подавлены (дополнительный рисунок S4). Эта ситуация подчеркивает важность биохимических исследований и протеомных исследований для понимания статуса клеточной стенки.
Рисунок 2 . Белок пектинметилэстеразы (PME18) дифференциально накапливается после заражения P.brassicae . (A) Анализ вестерн-блоттингом , показывающий уровни белка PME18 во фракции клеточной стенки гипокотилей псевдообработанных и растений, инфицированных P. brassicae , 20 DAI и 26 DAI. Общая нагрузка белка (10 мкг) изображена при окрашивании мембраны Ponceau S PVDF. (B) Количество белка PME18, измеренное как интенсивность пикселей (среднее значение серого) полос Вестерн-блоттинга. Для каждой комбинации два независимых биологических эксперимента (90 растений на образец) нанесены на график в виде двух отдельных точек данных, представляющих среднее значение трех технических повторов ± стандартное отклонение. (C) qRT-PCR анализ экспрессии гена PME18 в корнях ложно инокулированных и P. brassicae -инфицированных растений Col-0 Arabidopsis в указанные моменты времени (DAI). Уровни транскрипта были нормализованы к двум референсным генам ( TIP41 и UBC9 ), рассчитаны относительно экспрессии в искусственно обработанных растениях при 20 DAI и нанесены на график как средние значения трех независимых биологических экспериментов (каждый с 30 растениями на обработку) ± SE. Различные буквы указывают на значительную разницу между средними значениями (тест Тьюки, p <0.05).
Plasmodiophora brassicae — Управляемая гипертрофия органов снижена у pme18-2 МутантПоскольку мы не наблюдали дифференциального накопления белков PME, отличных от PME18, в протеомных исследованиях, мы предположили, что нарушение этого гена может значительно повлиять на анатомию желчного пузыря. Ранее было обнаружено, что нокаут-линия pme18-1 (At1g11580, SALK_067447) более восприимчива к инфекции Pseudomonas syringae (Bethke et al., 2014). Поскольку в центре внимания этой работы был иммунитет растений, описание морфологии мутантов не было включено. Линия Т-ДНК SALK_067447 имеет вставку в интронную область PME18 и фактически вставки в трех дополнительных локусах. Мы решили использовать другой, единственный образец Т-ДНК, несущий вставку в кодирующую область PME18 (SALK_076975; дополнительный рисунок S1), и назвали его pme18-2 . Мы обнаружили, что мутант pme18-2 проявлял существенно измененный фенотип даже без инфекции.Растения были меньше, чем соответствующие Col-0 дикого типа, и их корневая система была более хрупкой (склонной к разрушению во время уборки материала). Зараженные мутантные растения pme18-2 имели замедленное старение листьев по сравнению с диким типом (рис. 3А). Однако мутация не предотвратила образование галлов, индукцию образования гигантских клеток и развитие покоящихся спор (рисунки 3B, D и дополнительный рисунок S5). С другой стороны, снижение потенциала экспансивного роста у мутанта pme18-2 привело к развитию галлов значительно меньшего размера (в среднем на 59.8 и 61,6% при 20 DAI и 26 DAI соответственно; Рисунок 3E), а увеличение клеток, наблюдаемое во время гипертрофии органа, уменьшилось (на 50,6 и 61,2%; Рисунок 3F) по сравнению с соответствующими контролями Col-0. Интересно, что количество гипертрофированных клеток в развивающихся галлах также было меньше у растений pme18-2 по сравнению с растениями Col-0 (в среднем 71,9 и 49,4%; рисунок 3G). У растений дикого типа наблюдалось значительное относительное увеличение размера галла на 37,7% с 20 DAI до 26 DAI, сопровождаемое усилением роста гигантских клеток на 76% (рисунки 3E, F), тогда как у мутантных растений pme18-2 не наблюдалось значительного относительного увеличения размер галла или гигантский размер клетки от 20 до 26 DAI, что указывает на плато в развитии галла.Кроме того, увеличение гипокотилей было значительно снижено у pme18-2 по сравнению с Col-0 дикого типа при 20 и 26 DAI (дополнительный рисунок S5B), тогда как гипокотили pme18-2 увеличились в среднем на 0,93 мм при 20 DAI и На 1,08 мм при 26 DAI, в Col-0 ширина гипокотиля увеличилась на 2,14 мм и 2,96 мм соответственно. Оценка поперечных срезов гипокотилей (изображенных на фиг. 3C, D) также продемонстрировала различия в распределении гипертрофированных клеток. В Col-0 гигантские клетки равномерно распределены по гипокотилю.Напротив, мутант pme18-2 характеризуется отчетливой картиной с гипертрофированными клетками, преимущественно локализованными в периферической зоне гипокотиля. Более того, 26 гигантских клеток DAI в Col-0 в основном заполнены покоящимися спорами, тогда как в pme18-2 центральная часть галла все еще содержит значительное количество гигантских клеток, содержащих плазмодии, наряду с некоторыми клетками, несущими споры (Рисунки 3C). , D и дополнительный рисунок S5A).
Рисунок 3 .Развитие болезни косолапости у Col-0 дикого типа и pme18-2 . Влияние прогрессирования заболевания на морфологию надземных частей (розеток) 7, 10, 16, 20 и 26 DAI (A) и корней 20 и 26 DAI (B) . Шкала представляет собой 5 см для розеток и 1 см для корней. (C, D) Репрезентативные поперечные 5 мкм срезы гипокотилей Col-0 (C) и pme18-2 (D) растений 26 DAI. Типичные клетки, заполненные покоящимися спорами, обозначены желтыми звездочками.Срезы окрашивали толуидиновым синим. Масштабные линейки представляют 200 мкм. (E) Ширина гипокотиля у ложных и P. brassicae -инокулированных растений Col-0 и pme18-2 растений 20 DAI и 26 DAI. Диаграммы разброса представляют измерения ширины отдельных гипокотилей (от семи до 17 повторов для каждой комбинации), рассчитанные средние и SE. Различные буквы указывают на существенные различия между средними значениями (критерий Тамхана, p <0,05). (F) Влияние мутации pme18-2 на размер увеличенных клеток 20 DAI и 26 DAI.На диаграммах разброса представлены отдельные измерения, выполненные на радиальных срезах от 7 до 17 независимых гипокотилей для каждой комбинации, рассчитанные средние и SE. Различные буквы указывают на существенные различия между средними значениями (критерий Тамхана, p <0,05). (G) Влияние мутации pme18-2 на количество гигантских клеток 20 DAI и 26 DAI. Диаграммы разброса представляют индивидуальные расчеты увеличенных клеток для 7-17 радиальных сечений, взятых из независимых гипокотилей для каждой комбинации, рассчитанные средние и SE.Различные буквы указывают на существенные различия между средними значениями (критерий Тамхана, p <0,05).
Снижение метилирования пектина в галлах косы
Чтобы получить больше информации о потенциальной роли PME18 в клеточной экспансии P. brassicae , мы изучили пектиновый статус галлов. Степень метилирования пектина можно определить как процент карбоксильных групп, этерифицированных метанолом. Деэтерифицированные пектины можно визуализировать гистохимически с помощью раствора альцианового синего.Мы обнаружили, что интенсивность окрашивания альциановым синим была немного ниже в галлах Col-0 и pme18-2 по сравнению с репрезентативными областями гипокотиля в неинфицированном контроле (рисунки 4A, B и E). Мы проследили это наблюдение и проверили криосрезы гипокотилей с помощью спектроскопии комбинационного рассеяния света (рис. 4C, D). Этот метод позволил нам собрать информацию о состоянии полисахаридов клеточной стенки растений. Комбинированный анализ позволяет оценить потенциал разрыхления клеточной стенки, а также состояние целостности клеток в анализируемых тканях.В связи с тем, что галлы состоят из гипертрофированных и негипертрофированных областей, мы решили провести отдельное сканирование для увеличенных клеток (L — большие) и для неколонизированных клеток, которые не подверглись этому процессу (S — маленькие). Наш анализ был основан на предыдущих измерениях, которые привели к отнесению определенных спектров к физико-химическим характеристикам углеводных полимеров клеточной стенки (Таблица 1). Полученные спектральные картины представлены на рисунках 4C, D, а их характеристики — в таблице 1.Мы наблюдали пики при 1121 см -1 и 1091 см -1 , которые ранее были отнесены к симметричной и асимметричной моде растяжения гликозидных связей C – O – C в целлюлозе и гемицеллюлозах соответственно (Gierlinger et al., 2013) . В диапазоне от 1500 до 1000 см -1 мы обнаружили другие полосы целлюлозы и гемицеллюлозы, характерные в основном для изгибных и растягивающих колебаний групп CH, CH 2 и OH (Himmelsbach, Akin, 1998; Chylińska et al., 2016). ).
Рисунок 4 . Распределение пектина и статус метилирования пектина в клеточных стенках гипокотиля P. brassicae -инфицированных и ложно инокулированных растений Col-0 и pme18-2 . (A, B) Фрагменты репрезентативных поперечных 5 мкм срезов гипокотилей растений Col-0 и pme18-2 20 DAI и 26 DAI, дважды окрашенных альциановым синим (для деэтерифицированного пектина) и сафранином O ( используется как контрастное пятно). Масштабные линейки представляют 100 мкм. (C, D) Результаты спектроскопии комбинационного рассеяния света со спектральным диапазоном от 1800 до 250 см. -1 , полученные для клеточных стенок ложно обработанных и инфицированных гипокотилей Col-0 и pme18-2 растений 20 DAI и 26 DAI. Представлены отдельные измерения для увеличенных клеток (INF L) и тех, которые не подверглись экспансии, вызванной патогенами (INF S) в галлах. Интенсивности рамановских спектров представлены в виде относительных величин. Чтобы избежать перекрытия и облегчить наблюдение дискретных различий, спектры были разделены. (E) Область окрашивания альциановым синим у растений с ложным и инокулированным P. brassicae Col-0 и pme18-2 растений 20 DAI и 26 DAI. На диаграммах разброса представлены отдельные измерения площади окрашивания альциановым синим по отношению (в%) к общей площади среза гипокотиля (от четырех до семи повторов для каждой комбинации) и рассчитанные средние значения. Различные буквы указывают на значительные различия между средними значениями (критерий Тьюки, p <0,05).
Таблица 1 .Отнесение полос в спектрах комбинационного рассеяния полисахаридов клеточной стенки.
Количество пектина и степень метилирования определяли на основании пиков в диапазоне от 1800 до 250 см -1 . Мы наблюдали характерные пики для валентных колебаний метилэтерифицированных карбоксильных групп (~ 1745 см -1 ) и для карбоксилата (COO —) асимметричного (~ 1607 см -1 ) и симметричного (1405 см -1 ) валентные колебания (Сыница и др., 2003). Эти полосы в значительной степени связаны со степенью этерификации пектиновых полисахаридов. Кроме того, была обнаружена полоса при 1455 см -1 , ранее обнаруженная в спектрах комбинационного рассеяния метил-D-полигалактуроната и рамногалактуронана I (Himmelsbach and Akin, 1998). Наиболее характерной полосой для пектина является полоса с пиком между 840 и 857 см -1 , которая может быть отнесена к антисимметричному отрезку C – O – C α-гликозидных связей в кислом пектине (Sene et al., 1994 ).Сыница и др. (2003) обнаружили, что эта вибрация особенно чувствительна к изменениям степени метилирования пектиновых полисахаридов; для сильно метилированного пектина его максимум составляет около 842 см -1 и после деметилирования смещается в сторону более высоких волновых чисел, достигая 857 см -1 для гипометилированного пектина.
Наиболее выраженные различия в спектрах комбинационного рассеяния наблюдались между незараженными и инфицированными тканями. У здорового Col-0 пики 1745 см -1 и 849 см -1 были обнаружены в обоих временных точках (20 и 26 DAI), что указывает на метилирование пектина.У неинфицированных мутантов pme18-2 мы также могли видеть пик 1745 см -1 ; однако его интенсивность была ниже, чем пик на 1610 см -1 , что могло указывать на то, что степень метилирования пектина несколько ниже, чем в образцах Col-0. Для увеличенных клеток, присутствующих в галлах растений Col-0 дикого типа, полоса, характерная для гликозидной связи, была сдвинута с 849 на 853 см -1 , а полоса на 1745 см -1 исчезла. Пики 849/851 см -1 также наблюдались для областей галла Col-0, где располагались небольшие клетки, не колонизированные патогеном, что предполагает системные эффекты на клеточные стенки.Стоит отметить, что наблюдался не только сдвиг, но и снижение интенсивности полосы гликозидных связей, указывающее на деградацию пектина, наблюдаемую в галлах инфицированных растений Col-0 (фиг. 4C). Эти эффекты были особенно выражены 26 DAI и сопровождались уменьшением интенсивности пиков 1121 см −1 и 1091 см −1 , отнесенных соответственно к симметричной и асимметричной модам растяжения C – O – C в гликозидная связь в целлюлозе и гемицеллюлозах.Степень метилирования пектина, наблюдаемая у неинфицированного мутанта pme18-2 , ниже, чем у Col-0 (более низкая интенсивность пика 1745 см -1 и увеличение при 1610 см -1 ). Интересно, что у мутанта мы наблюдали разные паттерны метилирования в малых и больших клетках после заражения. Для крупных клеток полоса, характерная для валентного колебания гликозидной связи, находится на 852 см -1 (20 DAI) и 853 см -1 (26 DAI) для незараженных образцов и смещена до 857 см . −1 после заражения.Вокруг мелких клеток в галлах присутствуют пики 853 см -1 (20 DAI) и 850 см -1 (26 DAI), что позволяет предположить, что пектин не подвергается деметилированию в клетках, которые еще предстоит колонизировать, и системные эффекты, наблюдаемые в Col-0, отсутствуют (рис. 4D).
В полученных спектрах мы наблюдали полосы, характерные для амидов I и III, только в инфицированных образцах, что, вероятно, связано с наличием возбудителя (Chisanga et al., 2018). В дополнение к измерениям спектральных пиков, мы подробно изучили состояние клеточной стенки на стыках клеток (рис. 5).На основе полученных рамановских изображений можно оценить не только степень метилирования пектина, но и его непосредственные последствия, такие как деградация клеточной стенки и потеря целостности клетки. При 20 DAI как маленькие, так и увеличенные клетки в галлах растений Col-0 сохраняли относительно хорошо сохранившуюся структуру клеточной стенки. При 26 DAI в Col-0 мы наблюдали размытые края клеток и снижение интенсивности сигнала вибрации гликозидной связи, указывающее на снижение целостности клеточной стенки (рис. 5А). Карты распределения для образцов, не инфицированных Col-0 (20 и 26 DAI), ясно показывают, что пектины были сконцентрированы в углах клеток.Картина распределения пектина, наблюдаемая на изображениях, полученных для галлов pme18-2 (фиг. 5B), показывает, что, несмотря на деметилирование пектина, клеточные стенки сохраняются лучше, чем в Col-0 дикого типа.
Рисунок 5 . Рамановские изображения соединений клеточной стенки в области гипокотиля растений Col-0 и мутанта pme18-2 до и после заражения P. brassicae . Карты комбинационного рассеяния для областей соединения инфицированных (INF) и неинфицированных (MOCK) клеток внутри гипокотилей были получены путем интегрирования полос от 2760 до 3100 см -1 (колебание C – H растяжения, отражающее распределение материала клеточной стенки) и от 840 до 885 см -1 (соответствует полосе для (C – O – C) скелетной моды α-аномеров в пектине).Справа представлены светлопольные изображения криосрезов сканируемых областей. Панель (A) показывает репрезентативные изображения клеточных соединений для генотипа Col-0, тогда как панель (B) изображения для мутанта pme18-2 . Отдельные изображения были сделаны для соединений увеличенных клеток (INF L) и тех, которые не подверглись экспансии, вызванной патогенами (INF S). Масштабные линейки представляют 10 мкм. Цветовая шкала представляет собой подсчет интенсивности комбинационного рассеяния в секунду полосы, визуализированной на конкретном изображении.
Обсуждение и заключение
Протеомный отпечаток пальца отражает расширение и деградацию стенки клетки-хозяина
Применение протеомных методов помогает понять посттрансляционные аспекты регуляции ответа хозяина. В этом исследовании мы искали присутствие относительно обильных белков клеточной стенки, которые накапливаются в клеточных стенках расширяющихся, колонизированных патогенами клеток, присутствующих в гипертрофированных гипокотилях. Предыдущие протеомные подходы были сосредоточены на ранних стадиях инфекции (4 DAI), и был проанализирован очень широкий спектр изменений (Devos et al., 2006). В этом конкретном случае был проанализирован общий белковый экстракт и было идентифицировано 46 дифференциально регулируемых пятен. Основная цель нашей работы состояла в том, чтобы идентифицировать белки, активность которых во время клеточной экспансии, вызванной патогенами, может способствовать разрыхлению клеточной стенки и способствовать гипертрофии органов или высвобождению спор, покоящихся на патогенах, в окружающую среду. Мы решили провести протеомные исследования фракции клеточной стенки, выделенной из здоровых гипокотилей и соответствующих областей из инфицированных растений, во время фазы развития болезни, которая связана с аномальным увеличением клеток (20 DAI и 26 DAI).Ранее выбранный момент времени представлял состояние, когда самая высокая популяция клеток активно увеличивалась, тогда как вторая (26 DAI) — это время, когда образование спор патогена в состоянии покоя происходило внутри большинства колонизированных клеток. По сравнению с предыдущими исследованиями полного протеома Devos et al. (2006), мы идентифицировали ограниченное количество пятен, присутствующих исключительно в экстрактах белков клеточной стенки из инфицированных тканей. В инфицированных гипокотилях при 20 DAI мы наблюдали накопление внеклеточных белков, активность которых может быть напрямую связана с ремоделированием клеточной стенки (пероксидазы, PME и β-ксилозидаза).Единственным белком, активность которого влияет на рост клеток и демонстрирует высокое накопление 26 DAI в инфицированных растениях, был PME18. Другие пептиды, накапливающиеся на этой стадии, были белками, родственными убиквитину. Это изменение белковых отпечатков пальцев может отражать тот факт, что при 26 DAI образуются покоящиеся споры и происходят многочисленные процессы деградации белка внутри клетки (Donald et al., 2008), поэтому факторы, участвующие в деградации, совместно экстрагируются с внеклеточной фракцией.
Мы решили сосредоточиться на находке, связанной с накоплением PME18.Вестерн-блоттинг показал значительное увеличение количества этого белка при 20 DAI, но не наблюдалось значительных изменений при 26 DAI. Расхождение между результатами протеомики и вестерн-блоттинга может быть связано с тем фактом, что при 26 DAI деградация белка происходит в галлах, и некоторые из обнаруженных пептидов могут происходить из частично разрушенного PME18. Увеличение белка PME18 не отражалось на уровне транскрипции. Несоответствие между экспрессией генов, связанных с клеточной стенкой, и их численностью или активностью обсуждалось ранее и подчеркивалась важность посттрансляционной регуляции и деградации (Vogel and Marcotte, 2012).Протеомный подход, особенно тот, который ограничен фракциями клеточной стенки, менее чувствителен, чем транскриптомный подход; однако, если следовать за функциональными исследованиями, это может быть очень полезным инструментом, помогающим понять ремоделирование внеклеточного матрикса, которое в значительной степени регулируется доступностью субстрата или стабильностью белка (Seifert and Seifert and Blaukopf, 2010). Кажется вероятным, что увеличение белка PME18 запускает реакции обратной связи, направленные на подавление экспрессии генов. Это может быть частью компромисса между поддержанием целостности клетки-хозяина и деградацией клеточной стенки под действием патогенов.Общий обзор экспрессии генов, продукты которых участвуют в разрыхлении или деградации клеточной стенки на поздних стадиях развития галла у Arabidopsis, показывает, что индуцируется только ограниченное количество генов, а большая часть из них фактически подавляется (дополнительный рисунок S4). ). Недавняя работа Badstöber et al. (2020) показали, что большое количество транскриптов гена PME увеличивалось в зрелых галлах у кольраби, инфицированного P. brassicae ( Brassica oleracea ).Они также обнаружили повышенную экспрессию других генов, продукты которых могут участвовать в процессах размножения клеток ( XTH или EXP ) или деградации ( GH9 целлюлаз ). В целом, в обеих экспериментальных системах ( B. oleracea и Arabidopsis) транскриптомные изменения отражают деградацию или рост клеток; однако возникающие модели могут отличаться из-за реакции хозяина и скорости прогрессирования заболевания.
Важность изменений пектина для развития желчного пузыря
Поражение корневых систем P.brassicae сопровождается значительными изменениями клеточной стенки, включая локальное расщепление, которое делает возможным движение патогенов, утолщение и деформацию клеточной стенки в клетках, колонизированных плазмодиями, или огромное увеличение клеток, включая разрыхление клеточной стенки (Donald et al., 2008). Поддержание клеточной целостности является важной проблемой в такой динамично изменяющейся клеточной среде, как та, которая возникает в галлах косы (Malinowski et al., 2019). Можно ожидать, что изменения фракции пектина будут иметь жизненно важное значение для влияния на все эти процессы.На характер деметилэстерификации пектина может влиять клеточная среда; поэтому иногда могут наблюдаться положительные эффекты на усиление или ослабление клеточной стенки (Bidhendi and Geitmann, 2015). Было показано, что неблочный способ деметилирования уменьшает количество мостиков Ca 2+ , подвергая таким образом деметилированные цепи пектина разложению полигалактуроназами (Willats et al., 2001). При окрашивании альциановым синим мы наблюдали, что количество пектина немного снижается на поздних стадиях развития галла.Дальнейшее исследование с помощью рамановской микроскопии показало, что это сопровождается деметилированием пектина. Уже при 20 DAI у растений Col-0 дикого типа образование галла сопровождалось характерным сдвигом в спектрах комбинационного рассеяния, связанным с антисимметричным колебанием C – O – C растяжений α-гликозидных связей в кислом пектине (от 849 см — 1 в сторону 853 см −1 ). Сыница и др. (2003) указали, что эта вибрация чувствительна к изменениям метилирования пектиновых полисахаридов; для сильно метилированного пектина его максимум составляет около 842 см -1 , а после деметилирования он смещается в сторону более высоких волновых чисел, достигая 857 см -1 .Другой пик, коррелирующий со степенью этерификации пектина (1745 см -1 ), исчезает через 26 DAI при инфицировании, что дополнительно указывает на деметилирование пектина. Интенсивность пиков, характерных для гликозидной связи в полимерах целлюлозы (1121 см, –1 ) и гемицеллюлозы (1091 см, –1 ) (Gierlinger et al., 2013), снижалась в стенках клеток внутри галлов. Это говорит о том, что процессы клеточной деградации сопровождают деметилирование пектина на поздних стадиях развития галла.Это также было видно на изображениях комбинационного рассеяния, полученных для пика 2936 см -1 , характерного для растяжения СН для полисахаридов клеточной стенки (Gierlinger et al., 2012). Углы клеточной стенки на стыках клеток, изображенные на этой длине волны, оказались менее сфокусированными, что предполагает деградацию полимера (рис. 5В).
Снижение потенциала хозяина для деметилирования пектина ( pme18-2 ) привело к уменьшению размеров галлов и менее выраженной гипертрофии органов. Мутация pme18-2 также повлияла на распространение патогена, ограничивающего образование спор в состоянии покоя, главным образом во внешних слоях коры головного мозга (рис. 3В).В настоящее время мы не знаем, продиктовано ли это ограничением движения патогенов или изменением метаболизма корневой системы. Было показано, что PME могут участвовать в защитных реакциях растений в основном благодаря тому факту, что степень метилэстерификации определяет восприимчивость стенки клетки-хозяина к ферментам, происходящим от патогенов (Lionetti et al., 2012). В частности, интересно то, что элиситоры на основе пектина могут быть получены в ответ на модификацию лигнина в растении (Gallego-Giraldo et al., 2020). Это показывает, что онтогенетический / физиологический ответ на уровне клеточной стенки может быть функционально связан с защитой или передачей сигналов толерантности. Повышенное накопление белка PME18 было обнаружено уже 4 DAI в растениях, восприимчивых к киле (Devos et al., 2006), что указывает на возможность участия этого белка в защитных реакциях. Однако, поскольку мы не наблюдали никаких признаков устойчивости у pme18-2 , мы можем предположить, что на поздних стадиях он играет в основном структурную роль во время прогрессирования заболевания и образования желчного пузыря.Роль PME18 в ограничении движения патогенов не была основной темой нашей работы, но полученные фенотипы галлов стимулируют дальнейшее наблюдение с использованием в методиках отслеживания планта .
Деметилэстерификация пектина и увеличение клеток под действием патогенов
На основании транскриптомных исследований клеток, рассеченных лазером, Schuller et al. (2014) предположили, что увеличение клеток, наблюдаемое у хозяина на поздних стадиях прогрессирования заболевания, опосредуется перекрестными помехами между ауксином и брассиностероидом.Точная роль ауксина в активации PMEs, по-видимому, зависит от контекста, поскольку эффекты разрыхления и уплотнения клеточной стенки наблюдались в областях накопления ауксина. В максимумах ауксина, образующихся во время органогенеза зачатков листа на верхушке побега, активность PME приводит к локальному увеличению растяжимости клеточной стенки (Peaucelle et al., 2011), тогда как во время развития апикального крючка ауксин локализован совместно с областью ограничения клеточного роста (Jonsson и др., 2021). Это показывает, что другие факторы могут влиять на фактический эффект деметилирования пектина.В наших руках обработка растений NPA (блокатором транспорта ауксина) не привела к какому-либо резкому уменьшению увеличения клеток, происходящего во время гипокотиля, вызванного P. brassicae (дополнительный рисунок S6). Это говорит о том, что огромный рост клеток, колонизированных патогеном, запускается локально. В настоящее время мы не можем исключить сценарий, при котором факторы патогенного происхождения опосредуют эти реакции; однако, основываясь на работе Schuller et al. (2014), мы можем сказать, что также высока вероятность того, что брассиностероиды участвуют в регуляции клеточного гомеостаза во время увеличения желчного пузыря, а некоторые аспекты, такие как рост клеток и поддержание клеточной целостности, опосредуются этими фитогормонами.Wolf et al. (2012) показали, что процесс деметилэстерификации пектина может координироваться сигнальным путем брассиностероида, и такой ответ является важным компонентом для поддержания целостности клетки во время роста. Мы показываем, что снижение потенциала деметилэстерификации пектина в мутантных растениях pme18-2 приводит к уменьшению роста клеток, вызванного патогенами. Однако мы не можем исключить, что в некоторых регионах инфицированных гипокотилей основная роль деметилэстерификации заключается в поддержании целостности клеток во время массивного разрастания тканей.Модификация пектина, а также сопутствующее накопление пероксидаз, наблюдаемое на более поздних стадиях прогрессирования заболевания, также может быть связано с разрыхлением клеточной стенки, предшествующим распаду органа и выбросу спор в окружающую среду (рис. 6). Было показано, что деметилэстерификация пектина может способствовать ремоделированию клеточной стенки, опосредованной пероксидазами (Francoz et al., 2015, 2019). Интересно также, что мутация pme18-2 влияет не только на увеличение клеток, но и на пролиферацию клеток в развивающихся галлах, что подчеркивает важность механической координации морфогенеза в органах растений.Наше открытие показывает, что наряду с ранее описанными факторами, такими как XTH (Devos et al., 2005) или пероксидазы (Ludwig-Müller et al., 1994), PMEs являются важными компонентами, регулирующими клеточную динамику во время образования галла. В будущем мы планируем проанализировать возможные обратные связи, запускаемые патогенами деметилирования пектина в клеточных стенках гипертрофированных гипокотилей. Чтобы полностью понять влияние изменений пектинового статуса на вызванное P. brassicae увеличение клеток, необходимо провести больше экспериментов, направленных на визуализацию изменений в ассоциациях между конкретными полимерами клеточной стенки и измерения биофизических свойств их сетей.Недавно Haas et al. Предложили новые направления для изучения роли пектина в увеличении клеток. (2021 г.). Чтобы исключить возможность того, что pme18-2 имеет дополнительную мутацию в другом гене, которая может хотя бы частично способствовать некоторым фенотипическим / клеточным эффектам, наблюдаемым в этом исследовании, мы также планируем включить больше мутантов Т-ДНК. Это особенно важно, поскольку столь поразительный эффект одной вставки Т-ДНК наблюдался в многогенном семействе.
Рисунок 6 .Предполагаемая роль деметилирования пектина в созревании галла и высвобождении спор в состоянии покоя. На поздних стадиях болезни кайлы клеточные стенки галлов подвергаются деметилированию пектином. Это приводит к увеличению воздействия на компоненты клеточной стенки ферментов, участвующих в деградации пектина, целлюлозы и гемицеллюлозы. Это, в свою очередь, способствует аномальной гипертрофии гипокотиля и потере клеточной целостности, предшествующей высвобождению спор патогенов в окружающую среду.
Уменьшение численности PME18 и, как следствие, более низкий потенциал деметилэстерификации пектина не препятствует развитию патогена; вместо этого он изменяет распределение покоящихся спор.По-видимому, нехватка места внутри галла может только уменьшить количество частиц патогена, но не продвигать его жизненный цикл. Это согласуется с предыдущими экспериментами, в которых количество клеток в желчном пузыре было снижено за счет сверхэкспрессии отрицательного ингибитора клеточного цикла KRP1 (Malinowski et al., 2012), но P. brassicae смог завершить свой жизненный цикл. В отличие от этого, снижение доступности питательных веществ для патогена за счет снижения на биосинтеза цитокининов (Malinowski et al., 2016) или нарушение доставки углеводов (Walerowski et al., 2018) замедляют прогрессирование заболевания.
Заявление о доступности данных
Оригинальные материалы, представленные в исследовании, включены в статью / дополнительные материалы, дальнейшие запросы можно направлять соответствующим авторам. Наборы данных, представленные в этом исследовании, можно найти в онлайн-репозиториях. Имена репозитория / репозиториев и номера доступа можно найти в репозитории PRIDE Консорциума ProteomeXchange с номером доступа 537PXD026660 и 10.6019 / PXD026660.
Авторские взносы
KS и RM разработали эксперименты и проанализировали данные. KS, PW, MO и AA выполнили практическую экспериментальную работу. MS-C выполнил анализ спектроскопии комбинационного рассеяния. АК провел анализ результатов 2D GE. WT выполнил биоинформатический анализ. РМ написал рукопись при участии KS и MS-C. AK, WT и AZ отредактировали рукопись. Все авторы внесли свой вклад в статью и одобрили представленную версию.
Финансирование
Это исследование финансировалось Национальным научным центром Польши, грант SONATA 9 2015/17 / D / NZ9 / 01977 «Важность изменений клеточной стенки, происходящих в растении-хозяине, для прогрессирования инфекции Plasmodiophora brassicae ».Работа RM, KS и WT также была поддержана Седьмой рамочной программой Европейского Союза по исследованиям, технологическим разработкам и демонстрациям в соответствии с соглашением о гранте 621321. Оборудование, используемое для процедуры идентификации белков, частично спонсировалось Центром доклинических исследований и технологий. (CePT), проект, софинансируемый Европейским фондом регионального развития и инновационной экономикой, Национальной стратегией сплочения Польши.
Конфликт интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Примечание издателя
Все утверждения, выраженные в этой статье, принадлежат исключительно авторам и не обязательно отражают претензии их дочерних организаций или издателей, редакторов и рецензентов. Любой продукт, который может быть оценен в этой статье, или заявление, которое может быть сделано его производителем, не подлежат гарантии или одобрению со стороны издателя.
Дополнительные материалы
Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fpls.2021.711838/full#supplementary-material
Сноски
Список литературы
Алонсо, Дж. М., Степанова, А. Н., Лейсс, Т. Дж., Ким, К. Дж., Чен, Х., Шинн, П. и др. (2003). Полногеномный инсерционный мутагенез Arabidopsis thaliana . Наука 301, 653–657. DOI: 10.1126 / science.1086391
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Badstöber, J., Ciaghi, S., and Neuhauser, S.(2020). Динамические модификации клеточной стенки капустных при болезни кайлы. bioRxiv [Препринт]. DOI: 10.1101 / 2020.03.02.972901
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бетке, Г., Грундман, Р. Э., Сриканта, С., Трумэн, В., Катагири, Ф., и Глейзбрук, Дж. (2014). Пектинметилэстеразы арабидопсиса способствуют формированию иммунитета против Pseudomonas syringae . Plant Physiol. 164, 1093–1107. DOI: 10.1104 / стр.113.227637
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Браганса, Г.П., Оливейра Д. К. и Исайяс Р. М. С. (2016). Компартментализация метаболитов и ферментативное посредничество в питательных клетках галлов cecidomyiidae на Piper arboreum Aubl. (Piperaceae). J. Plant Stud. 6, 11–19. DOI: 10.5539 / jps.v6n1p11
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чандран, Д., Инада, Н., Хазер, Г., Кляйндт, К. К., и Вильдермут, М. С. (2010). Лазерная микродиссекция клеток арабидопсиса в очаге инфекции мучнистой росы выявляет сайт-специфические процессы и регуляторы. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 107, 460–465. DOI: 10.1073 / pnas.02107
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чисанга М., Мухамадали Х., Эллис Д. И. и Гудакр Р. (2018). Рамановское рассеяние с усилением поверхности (SERS) в микробиологии: освещение и улучшение микробного мира. заявл. Spectrosc. 72, 987–1000. DOI: 10.1177 / 0003702818764672
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хилинская, М., Шиманьска-Чаргот, М., Здунек, А. (2014). Визуализация полисахаридов в клеточной стенке томата с помощью рамановской микроскопии. Заводские методы 10:14. DOI: 10.1186 / 1746-4811-10-14
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хилинска М., Шиманьска-Чаргот М. и Здунек А. (2016). FT-IR и FT-Raman характеристика фракций нецеллюлозных полисахаридов, выделенных из клеточной стенки растений. Carbohydr. Polym. 154, 48–54. DOI: 10.1016 / j.carbpol.2016.07.121
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
де Соуза А., Халл П. А., Гилле С. и Паули М. (2014). Идентификация и функциональная характеристика отдельных растительных пектиновых эстераз PAE8 и PAE9 и их делеционных мутантов. Planta 240, 1123–1138. DOI: 10.1007 / s00425-014-2139-6
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Девос, С., Лаукенс, К., Декерс, П., Ван дер Straeten, Д., Beeckman, T., Inzé, D., et al. (2006). Гормональный и протеомный подход к изображению начальных метаболических событий во время инфекции Plasmodiophora brassicae на Arabidopsis. Мол. Взаимодействие растений и микробов. 19, 1431–1443. DOI: 10.1094 / MPMI-19-1431
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Девос, С., Виссенберг, К., Вербелен, Ж.-П., и Принсен, Э. (2005). Заражение китайской капусты Plasmodiophora brassicae приводит к стимуляции роста растений: влияет на метаболизм клеточной стенки и гормональный баланс. New Phytol. 166, 241–250. DOI: 10.1111 / j.1469-8137.2004.01304.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дональд Э. К., Джаудземс Г. и Портер И. Дж. (2008). Патология корковой инвазии Plasmodiophora brassicae у устойчивых к киле и восприимчивых хозяев Brassica oleracea . Plant Pathol. 57, 201–209. DOI: 10.1111 / j.1365-3059.2007.01765.x
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Евдес, А., Муй, Г., Тевенин, Дж., Гояллон, А., Миник, З., и Жуанин, Л. (2008). Очистка, клонирование и функциональная характеристика эндогенной бета-глюкуронидазы в Arabidopsis thaliana . Physiol растительных клеток. 49, 1331–1341. DOI: 10,1093 / pcp / pcn108
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фейс, Л., Иршад, М., Понт-Лезика, Р. Ф., Канут, Х. и Жамет, Э. (2006). Оценка препаратов клеточных стенок для протеомики: новая процедура очистки клеточных стенок от гипокотилей Arabidopsis. Заводские методы 2:10. DOI: 10.1186 / 1746-4811-2-10
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Francoz, E., Ranocha, P., Le Ru, A., Martinez, Y., Fourquaux, I., Jauneau, A., et al. (2019). Деметилэстерификация пектина создает платформы, которые закрепляют пероксидазы для ремоделирования доменов клеточной стенки растений. Dev. Cell 48, 261–276. DOI: 10.1016 / j.devcel.2018.11.016
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Франко, Э., Раноча, П., Нгуен-Ким, Х., Джамет, Э., Бурлат, В., и Дунанд, К. (2015). Роль пероксидаз клеточной стенки в развитии растений. Фитохимия 112, 15–21. DOI: 10.1016 / j.phytochem.2014.07.020
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Gallego-Giraldo, L., Liu, C., Pose-Albacete, S., Pattathil, S., Peralta, A.G., Young, J., et al. (2020). ПОЛИГАЛАКТУРОНАЗА 1 (ADPG1) в зоне арабидопсиса высвобождает скрытые защитные сигналы в стеблях с пониженным содержанием лигнина. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 117, 3281–3290. DOI: 10.1073 / pnas.1
2117
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гатьенс-Бониче, О. (2019). Механизм индукции желчи у растений насекомыми: обнаружение ключей, фактов и последствий в комплексном взаимодействии между разными царствами. Ред. Биол. Троп. 67, 1359–1382. DOI: 10.15517 / rbt.v67i6.33984
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Годе П., Ливстон М.С., Льюис, С. Э., и Томас, П. Д. (2011). Филогенетическое распространение функциональных аннотаций в рамках консорциума генных онтологий. Бриф. Биоинформ. 12, 449–462. DOI: 10.1093 / bib / bbr042
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гирлингер, Н., Кеплингер, Т., Харрингтон, М., и Шваннингер, М. (2013). «Рамановское изображение лигноцеллюлозного сырья» в Целлюлоза — Конверсия биомассы. ред. Т. Ван де Вен и Дж. Кадла (Риека: INTECH), 159–192.
Google Scholar
Густафссон, М., Лильерот, Э., Гуннарссон, М., и Лундборг, Т. (1986). Влияние инфекции Plasmodiophora brassicae на анатомию корней рапса. J. Phytopathol. 117, 144–151. DOI: 10.1111 / j.1439-0434.1986.tb00638.x
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хаас, К. Т., Вайтман, Р., Поселль, А., и Хёфте, Х. (2021 г.). Роль разделения фаз пектина в сборке и росте клеточной стенки растений. Cell Surf. 7: 100054. DOI: 10.1016 / j.tcsw.2021.100054
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Харрисон, С. Дж., Мотт, Э. К., Петрушка, К., Аспиналл, С., Грей, Дж. К. и Коттедж, А. (2006). Быстрый и надежный метод идентификации трансформированных проростков Arabidopsis thaliana после трансформации цветочным окунанием. Методы растений 2:19. DOI: 10.1186 / 1746-4811-2-19
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Химмельсбах, Д.С., Акин Д. Э. (1998). Рамановская спектроскопия с преобразованием Фурье в ближней инфракрасной области стеблей льна ( Linum usitatissimum L.). J. Agric. Food Chem. 46, 991–998. DOI: 10.1021 / jf970656k
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Джарвис, М. К., Бриггс, С. П. Х., Нокс, Дж. П. (2003). Межклеточная адгезия и разделение клеток у растений. Среда растительных клеток. 26, 977–989. DOI: 10.1046 / j.1365-3040.2003.01034.x
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Джоли, Р.П., Дуветтер Т., Ван Лой А.М. и Хендрикс М.Э. (2010). Пектинметилэстераза и ее белковый ингибитор: обзор. Carbohydr. Res. 345, 2583–2595. DOI: 10.1016 / j.carres.2010.10.002
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Йонссон, К., Токар, Р. С., Кежковски, Д., Ротье-Кежковска, А.-Л., Хамант, О., и Бхалерао, Р. П. (2021). Механохимическая обратная связь опосредует изгиб тканей, необходимый для появления всходов. Curr. Биол. 31, 1154.e3–1164.e3. DOI: 10.1016 / j.cub.2020.12.016
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лионетти, В., Червоне, Ф., Беллинкампи, Д. (2012). Метилэтерификация пектина играет роль во взаимодействии растений с патогенами и влияет на устойчивость растений к болезням. J. Plant Physiol. 169, 1623–1630. DOI: 10.1016 / j.jplph.2012.05.006
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лишкай, А., Кенк, Б.и Шопфер П. (2003). Доказательства участия пероксидазы клеточной стенки в генерации гидроксильных радикалов, опосредующих рост удлинения. Planta 217, 658–667. DOI: 10.1007 / s00425-003-1028-1
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Людвиг-Мюллер, Дж., Терманн, П., Пипер, К., и Хильгенберг, В. (1994). Активность изоферментов пероксидазы и хитиназы при заражении корней китайской капусты Plasmodiophora brassicae . Physiol. Растение. 90, 661–670. DOI: 10.1111 / j.1399-3054.1994.tb02521.x
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Малиновски, Р., Новак, О., Борхан, М. Х., Спичал, Л., Стрнад, М., и Рольфе, С. А. (2016). Роль цитокининов при болезни калы. евро. J. Plant Pathol. 145, 543–557. DOI: 10.1007 / s10658-015-0845-y
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Малиновски, Р., Смит, Дж. А., Флеминг, А. Дж., Скоулз, Дж. Д., и Рольф, С.А. (2012). Образование галлов у арабидопсиса, инфицированного кайлой, является результатом увеличения существующей меристематической активности хозяина, но не является существенным для завершения жизненного цикла патогена. Plant J. 71, 226–238. DOI: 10.1111 / j.1365-313X.2012.04983.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Малиновский, Р., Трумэн, В., и Бличарц, С. (2019). Гениальный архитектор или умный вор Plasmodiophora brassicae перепрограммирует развитие хозяина, чтобы установить физиологический приемник, ориентированный на патогены. Мол. Взаимодействие растений и микробов. 32, 1259–1266. DOI: 10.1094 / MPMI-03-19-0069-CR
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Minic, Z., Rihouey, C., Do, C. T., Lerouge, P., and Jouanin, L. (2004). Очистка и характеристика ферментов, проявляющих активность β-d-ксилозидазы в стволовых тканях Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 867–878. DOI: 10.1104 / стр. 104.041269
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мюллер, К., Linkies, A., Vreeburg, R.A., Fry, S.C., Krieger-Liszkay, A., and Leubner-Metzger, G. (2009). In vivo Разрыхление клеточной стенки гидроксильными радикалами во время прорастания семян кресс-салата и удлиненного роста. Plant Physiol. 150, 1855–1865. DOI: 10.1104 / стр.109.139204
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Нойхофф В., Арольд Н., Таубе Д. и Эрхардт В. (1988). Улучшенное окрашивание белков в полиакриламидных гелях, включая изоэлектрические фокусирующие гели с чистым фоном при чувствительности в нанограммах, с использованием кумасси бриллиантового синего G-250 и R-250. Электрофорез 9, 255–262. [Epub перед печатью]
Google Scholar
Ольшак М., Трумэн В., Стефанович К., Сливинска Э., Ито М., Валеровски П. и др. (2019). Профилирование транскрипции позволяет идентифицировать критические этапы репрограммирования клеточного цикла, необходимые для обусловленного Plasmodiophora brassicae образования галла у Arabidopsis. Plant J. 97, 715–729. DOI: 10.1111 / tpj.14156
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Посель, А., Брейбрук, С.А., Ле Гийу, Л., Брон, Э., Кухлемайер, К., и Хёфте, Х. (2011). Пектиновые изменения в механике клеточной стенки лежат в основе инициирования органов у Arabidopsis. Curr. Биол. 21, 1720–1726. DOI: 10.1016 / j.cub.2011.08.057
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Perez-Riverol, Y., Csordas, A., Bai, J., Bernal-Llinares, M., Hewapathirana, S., Kundu, D. J., et al. (2019). База данных PRIDE и связанные с ней инструменты и ресурсы в 2019 году: улучшение поддержки количественных данных. Nucleic Acids Res. 47, D442 – D450. DOI: 10.1093 / nar / gky1106
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Perlikowski, D., Wiśniewska, H., Kaczmarek, J., Góral, T., Ochodzki, P., Kwiatek, M., et al. (2016). Изменения протеома ядра после заражения Fusarium culmorum у двух сортов тритикале с контрастирующей устойчивостью к фитофторозу Fusarium . Фронт. Plant Sci. 7: 1217. DOI: 10.3389 / fpls.2016.01217
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пфаффл, М.В., Хорган, Г. В., и Демпфл, Л. (2002). Программный инструмент относительной экспрессии (REST © ) для группового сравнения и статистического анализа результатов относительной экспрессии в ПЦР в реальном времени. Nucleic Acids Res. 30: e36. DOI: 10.1093 / nar / 30.9.e36
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шуллер А., Кер Дж. И Людвиг-Мюллер Дж. (2014). Лазерная микродиссекция в сочетании с транскрипционным профилем корней Arabidopsis, инокулированных Plasmodiophora brassicae , указывает на роль брассиностероидов в формировании кайлы. Physiol растительных клеток. 55, 392–411. DOI: 10.1093 / pcp / pct174
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сене К., Макканн М. К., Уилсон Р. Х. и Гринтер Р. (1994). Рамановская спектроскопия с преобразованием Фурье и инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (исследование пяти клеточных стенок высших растений и их компонентов). Plant Physiol. 106, 1623–1631. DOI: 10.1104 / стр.106.4.1623
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Некоторые, А., Manzanares, M. J., Laurens, F., Baron, F., Thomas, G., and Rouxel, F. (1996). Вариация вирулентности Brassica napus L среди коллекций Plasmodiophora brassicae из Франции и производных однопоровых изолятов. Plant Pathol. 45, 432–439. DOI: 10.1046 / j.1365-3059.1996.d01-155.x
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сыница А., Чопикова Ю., Матейка П. и Махович В. Я. С. П. (2003). Рамановская и инфракрасная спектроскопия пектинов с преобразованием Фурье. Carbohydr. Polym. 54, 97–106. DOI: 10.1016 / S0144-8617 (03) 00158-9
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Фогель, К., Маркотт, Э. М. (2012). Понимание регуляции обилия белка на основе протеомного и транскриптомного анализов. Нац. Преподобный Жене. 13, 227–232. DOI: 10.1038 / nrg3185
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Валеровски П., Гюндел А., Яхая Н., Трумэн В., Собчак М., Ольшак М., и другие. (2018). Болезнь косы стимулирует ранние этапы дифференцировки флоэмы и задействует переносчиков сладкой сахарозы в развивающихся галлах. Растительная клетка 30, 3058–3073. DOI: 10.1105 / TPC.18.00283
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Wei, C., и Lintilhac, P. M. (2007). Потеря стабильности: новый взгляд на физику поведения клеточной стенки во время роста растительных клеток. Plant Physiol. 145, 763–772. DOI: 10.1104 / стр.107.101964
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Willats, W.Г. Т., Орфила, К., Лимберг, Г., Буххольт, Х. К., ван Алебек, Г. Дж., Вораген, А. Г. и др. (2001). Модуляция степени и характера метилэтерификации пектинового гомогалактуронана в стенках растительных клеток. Влияние на действие пектинметилэстеразы, свойства матрикса и клеточную адгезию. J. Biol. Chem. 276, 19404–19413. DOI: 10.1074 / jbc.M011242200
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Wolf, S., Mravec, J., Greiner, S., Mouille, G., и Хофте, Х. (2012). Гомеостаз клеточной стенки растений опосредуется обратной связью брассиностероидами. Curr. Биол. 22, 1732–1737. DOI: 10.1016 / j.cub.2012.07.036
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
границ | Перспектива генетической трансформации Hypericum perforatum
Введение
Hypericum perforatum — один из наиболее важных и известных видов рода Hypericum , который ценился греческими травниками за его лечебную ценность с первого века нашей эры.D. Несколько исследований и клинических испытаний показали, что экстракты H. perforatum обладают поразительным набором фармакологических свойств. Клиническая эффективность экстрактов H. perforatum в терапии депрессии легкой и умеренной степени подтверждена во многих исследованиях (Lecrubier et al., 2002; Butterweck, 2003). Многие другие важные фармацевтические свойства H. perforatum , включая противовирусные (Schinazi et al., 1990), противораковые (Agostinis et al., 2002), нейропротекторные (Silva et al., 2004), антиоксидантной (Silva et al., 2005) и ранозаживляющей деятельности (Yadollah-Damavandi et al., 2015) также сообщалось. Поскольку лечение людей и животных экстрактами H. perforatum не приводит к серьезным побочным эффектам (Trautmann-Sponsel and Dienel, 2004), использование этой лекарственной травы резко возросло за последнее десятилетие. Благодаря своей прочной позиции на рынке, популярности и эффективности, H. perforatum сегодня считается одним из самых продаваемых трав. Продукты H. perforatum в настоящее время продаются во многих странах в качестве пищевых добавок, антидепрессивных средств, релаксантов и средств повышения настроения.
Были предприняты попытки культивирования клеток и тканей H. perforatum с основным упором на получение фармацевтически важных соединений в контролируемых условиях. Однако крупномасштабное производство вторичных метаболитов до сих пор не могло быть достигнуто с использованием культур in vitro из-за низкой производительности и ненадежного выхода продуктов.Хотя значительные улучшения в выходе продукта были достигнуты с помощью традиционных биохимических подходов в сочетании с манипуляциями с процессом культивирования, результаты не воспроизводятся. Инженерия метаболических путей растений позволит нам улучшить продукцию основных соединений в H. perforatum за счет сверхэкспрессии определенных генов. Однако метаболическая инженерия этого рода до сих пор не предпринималась из-за отсутствия эффективного метода трансформации.
Трансформация растений — незаменимый инструмент для улучшения сельскохозяйственных культур, функциональной геномики растений, редактирования генома, синтетической биологии и т. Д.(Sainsbury, Lomonossoff, 2014; Xu et al., 2014; Hwang et al., 2015; Nester, 2015). Успех трансформации немодельных растений обычно основан на двух важных принципах: (1) чужеродные гены могут быть введены в растительную клетку с помощью различных методов, и ее генетический состав может быть изменен, и (2) растительные клетки являются тотипотентными, что означает: принцип, согласно которому каждая клетка содержит всю генетическую информацию, необходимую для регенерации в полноценное растение в оптимальных условиях. Следовательно, эффективность доставки генов в клетки-мишени и способность восстанавливать растения из этих трансформированных клеток являются двумя основными факторами, критически влияющими на восстановление трансгенных растений.Несмотря на доступность превосходных методов регенерации через органогенез и соматический эмбриогенез в H. perforatum , восстановление трансгенных растений остается сложной задачей. Хотя сообщалось о Agrobacterium rhizogenes и биолистической трансформации H. perforatum , эти протоколы не могли удовлетворить огромные потребности функциональных геномных исследований. Опосредованная Agrobacterium tumefaciens трансформация является наиболее предпочтительным методом переноса генов из-за частой интеграции трансгена с одной копией в геном растения и низкой частоты подавления трансгена.Преимущества простоты, доступной стоимости, более низкой трансгенной перестройки, возможности переноса длинных сегментов ДНК и преимущественной интеграции чужеродных генов в транскрипционно активные области делают трансформацию, опосредованную A. tumefaciens , привлекательным методом (Kumar et al., 2013). Хотя этот метод может быть полезен для метаболической инженерии и функциональных геномных исследований в H. perforatum , устойчивость растений к трансформации, опосредованной A. tumefaciens , является серьезной проблемой.В этой статье мы обсуждаем текущее состояние и будущие перспективы генетической трансформации H. perforatum .
Клеточная тотипотентность
H. perforatumКлеточная тотипотентность H. perforatum была продемонстрирована в нескольких отчетах. Первоначально регенерация in vitro H. perforatum была исследована как вариант для размножения элитных растений и производства ценных фитофармацевтических препаратов.В частности, влияние комбинаций регуляторов роста растений (PGR) на концентрацию вторичных метаболитов интенсивно изучается в культуре клеток и тканей. В результате сегодня доступно несколько методов регенерации и микроразмножения растений.
В основном, in vitro Регенерация растений H. perforatum происходит относительно просто и быстро. In vitro регенерация H. perforatum была достигнута из нескольких типов эксплантов (таблица 1), включая целые проростки (Cellarova et al., 1992), листья (Pretto, Santarem, 2000; Pasqua et al., 2003; Franklin, Dias, 2006), узловые сегменты (Santarém, Astarita, 2003), корневые сегменты (Zobayed, Saxena, 2003; Franklin and Dias, 2006). ), гипокотили (Murch et al., 2000; Franklin and Dias, 2006), стебли (Zobayed and Saxena, 2003), кончики побегов (Zobayed and Saxena, 2003), органогенные клубеньки, полученные из культуры суспензии клеток (Franklin et al., 2007) и тонких клеточных слоях (Franklin, Dias, 2011). Эксплантаты корня реагировали лучше, чем эксплантаты кончика побега, листа, гипокотиля или стебля, с точки зрения индуцированного тидиазуроном органогенеза побега, тогда как наименьшее количество регенерантов было обнаружено в эксплантатах кончика побега (Zobayed and Saxena, 2003).Растения можно было выращивать на среде, дополненной различными комбинациями PGR. Хотя общим требованием для регенерации побегов является высокое соотношение цитокинин / ауксин у большинства видов, H. perforatum продемонстрировал эффективную прямую регенерацию побегов при низком соотношении цитокинин / ауксин (Pasqua et al., 2003; Franklin and Dias, 2006). С другой стороны, для опосредованной каллусом непрямой регенерации побегов H. perforatum необходимо высокое соотношение цитокинин / ауксин. Интересно, что растения можно эффективно регенерировать из корневых эксплантатов на базальной среде (Franklin and Dias, 2006) и на среде с добавлением ИУК (Goel et al., 2008).
Таблица 1. In vitro Регенерация растений H. perforatum .
Большинство исследований регенерации ограничиваются одним генотипом (Murch et al., 2000; Pretto and Santarem, 2000; Zobayed and Saxena, 2003; Zobayed et al., 2004). Мы установили генотип-независимый протокол регенерации растений и выяснили специфический путь регенерации растений у H. perforatum (Franklin and Dias, 2006).Не было значительной разницы в проценте регенерации и количестве побегов / эксплантатов между тестируемыми генотипами, что указывает на то, что регенерация у H. perforatum не зависит от генотипа. С другой стороны, тип эксплантата (гипокотиль, лист или корень) оказывал значительное влияние на регенерацию побегов (Franklin and Dias, 2006). Подобное изменение частоты регенерации побегов, основанное на типах эксплантов при одинаковой концентрации тидиазурона, также ранее сообщалось у H.perforatum (Зобайед, Саксена, 2003). Следовательно, из результатов, представленных в литературе, реакция регенерации H. perforatum явно является зависимым от эксплантата феноменом, управляемым PGR.
Возраст источника эксплантата также влияет на регенерационный потенциал эксплантов листа, гипокотиля и лепестка (Franklin and Dias, 2006; Goel et al., 2008). Напротив, возраст не влияет на морфогенетический потенциал эксплантов корневых сегментов (Franklin and Dias, 2006). Независимая от возраста регенерация сегментов корня может быть связана с высокой метаболической активностью и более быстрым делением клеток корней из-за непрерывной меристематической активности ближе к кончику корня.Ориентация листовых эксплантатов на среде также оказывала заметное влияние на регенерацию. В то время как листья с адаксиальной стороной, соприкасающейся со средой, демонстрировали высокие частоты регенерации, листья с противоположной поверхностью, контактирующей со средой, не проявляли никакой реакции.
Как правило, существует два важных пути, ведущих к регенерации нового растения из культивируемых эксплантатов, органогенез и соматический эмбриогенез (рис. 1). Процесс, в котором инициируется и развивается орган (например, побег или корень), известен как органогенез.С другой стороны, процесс формирования зародыша, который развивается из соматических клеток, называется соматическим эмбриогенезом. В то время как появление униполярного зачатка или биполярного зародыша являются типичными характеристиками органогенеза и соматического эмбриогенеза соответственно. Если во время вышеуказанных процессов происходит де-дифференцировка (образование костной мозоли), они называются непрямой регенерацией.
Рисунок 1. Пути регенерации, ведущие к регенерации H.perforatum , как показано в нашем предыдущем отчете (Franklin and Dias, 2006) .
В H. perforatum регенерация была продемонстрирована через как эмбриогенез, так и органогенез в той же культуре (Franklin and Dias, 2006). В этом исследовании меристематические клетки, сформированные из субэпидермального слоя, развивались одновременно в две функционально разные глобулярные структуры. Шаровидные структуры, прикрепленные к эксплантату, развились в побеги, а остальные, отделившиеся от эксплантата, претерпели эмбриогенез.Эмбриогенез прогрессировал от глобулярных эмбрионов до стадии семядолей через эмбрионов в форме сердца и на стадии торпеды. Семядольные зародыши не развились в растения, поскольку не смогли сформировать корневую систему. Следует отметить, что непрямая регенерация лучше подходит для создания трансгенных растений, чем прямая регенерация, поскольку отбор трансгенного каллуса обычно прост и позволяет эффективно обогащать трансформированную ткань перед регенерацией.
Доставка ДНК в
H.perforatum Растительные клеткиТрансформация, опосредованная Agrobacterium
Трансформация, опосредованная A. tumefaciens , является наиболее эффективным и широко используемым методом в генной инженерии растений. С другой стороны, культуры волосистых корней, созданные с помощью трансформации, опосредованной A. rhizogenes , часто поддерживают стабильную продуктивность в условиях культивирования без гормонов, что приводит к накоплению большого количества вторичных метаболитов (Oksman-Caldentey and Sévon, 2002).
Agrobacterium называют «естественной генной инженерией» из-за ее естественной способности инфицировать растения и вводить фрагмент ДНК (Т-ДНК) из плазмиды, индуцирующей опухоль (Ti) или индуцирующей корень (Ri), в клетки растений через процесс, известный как «перенос Т-ДНК». Попав внутрь растительной клетки, Т-ДНК (перенесенная ДНК) транспортируется в ядро, где она стабильно интегрируется в геном растения. Т-ДНК кодирует гены синтеза ауксина, цитокинина и опина.Следовательно, интеграция Т-ДНК в геном хозяина приводит к дисбалансу соотношений ауксин-цитокинин клетки-хозяина, что приводит к неконтролируемому делению клеток и развитию коронных галлов или волосатых корней и синтезу опина. Опины используются в качестве основного пищевого ресурса Agrobacterium . Поскольку ни Т-ДНК не может быть транскрибирована в Agrobacterium , ни опины, метаболизируемые растениями, процесс переноса Т-ДНК представляет собой молекулярную нишу для выживания Agrobacterium . Этот естественный процесс наблюдается у нескольких видов растений (например, у растений).g., роза, виноград, косточковые, семечковые, помидоры) и считается болезнью. Этот процесс передачи Т-ДНК, вызывающий заболевание, использовался как инструмент для введения генов в растения. Сегодня трансформация, опосредованная A. tumefaciens , является предпочтительным методом для функциональной геномики из-за ее простоты и частой интеграции единственной копии трансгена в геном хозяина.
Хотя A. tumefaciens опосредовано трансформацией H. perforatum еще не сообщалось, индукция волосистых корней после совместного культивирования с A.rhizogenes (Таблица 2). Хотя штаммы ATCC 15834 и штаммы A4 могут давать волосатые корни, штамм A. rhizogenes K599 не индуцирует образование волосистых корней (Santarem et al., 2008). С другой стороны, штамм A. rhizogenes , такой как A4, LBA9402, не мог индуцировать волосистые корни у H. perforatum cv. Хелос (Франклин и др., 2007). На первый взгляд противоречивые результаты между группами ясно подчеркивают сложность опосредованной A. rhizogenes трансформации H.perforatum .
Таблица 2. A. rhizogenes опосредованная трансформация H. perforatum .
культуры волосистых корней могут быть получены из эпикотилей H. perforatum , совместно культивируемых с штаммом A4 A. rhizogenes , содержащим ген GUS (β-глюкуронидазы), вставленный в плазмиду Ri pRiA4 (Vinterhalter et al., 2006). Эти волосатые корни обладают высоким потенциалом спонтанной регенерации в целые трансгенные растения.Присутствие гена GUS в культурах волосистых корней и побегов определяли с помощью ПЦР-анализа. Недавно эта группа изучила влияние концентрации сахарозы на потенциал регенерации побегов клонов волосистых корней H. perforatum , полученных в результате их предыдущего исследования (Vinterhalter et al., 2006), и обнаружила, что до 2% сахарозы способствует интенсивной регенерации побегов (Vinterhalter и др., 2015).
Совместное культивирование сегментов корня с штаммом A. rhizogenes A4 привело к образованию волосистых корней H.perforatum (Тусевский и др., 2013б, 2014). Трансгенная природа культур волосистых корней была продемонстрирована с помощью ПЦР-амплификации гена rolB в ДНК, выделенной из корней. Эти авторы также обнаружили несколько важных вторичных метаболитов (фенольные кислоты, флавонолгликозиды, флавоноидные агликоны, флаван-3-олы и ксантоны) в волосатых корнях H. perforatum (Tusevski et al., 2013b, 2014). Эта группа также сравнила продукцию фенольных соединений между культурами волосистых корней, выращенных в темноте, и культурами, выращенными при 16-часовом фотопериоде, что выявило заметные различия в фенольных кислотах, флавонолах, флаван-3-олах и ксантонах между этими культурами (Tusevski et al. al., 2013а). Точно так же клоны волосатых корней с повышенными уровнями гиперозида, хлорогеновой кислоты и гиперицина были получены из фрагментов листьев и корней, совместно культивируемых с штаммом A. rhizogenes ATCC 15834 (Bertoli et al., 2008). Более того, гиперицин был обнаружен в повышенных уровнях в придаточных побегах H. perforatum после совместного культивирования с штаммом A. rhizogenes K599, несмотря на то, что совместное культивирование не привело к образованию волосистых корней (Santarem et al., 2008, 2010 ).Точно так же совместное культивирование с A. tumefaciens и A. rhizogenes увеличивало продукцию вторичных метаболитов в суспензионной культуре клеток H. perforatum (Tusevski et al., 2015).
H. perforatum Устойчивость к Agrobacterium ИнфекцияНи A. rhizogenes (LBA99402 и A4), ни A. tumefaciens (LBA4404 и EHA105) не могли инфицировать тканей H. perforatum в наших исследованиях. Различные эксплантаты (листовая пластинка, черешок, стебель и сегменты корня) совместно культивировали с A.tumefaciens и A. rhizogenes , несущий бинарный вектор pCAMBIA1301, который несет ген HPT (гигромицинфосфотрансферазы) в качестве маркера отбора и GUS, прерванный эукариотическим интроном (GUS-INT) в качестве репортерного гена. Присутствие интрона в гене GUS допускает экспрессию гена только в эукариотических клетках, таких как клетки растений. При анализе на временную экспрессию гена GUS ни один из эксплантов не показал голубых фокусов (Franklin et al., 2007). Это происходило независимо от индукции гена vir или добавления антиоксиданта (бутилированный гидрокситолуол, BHT), тиоловых соединений (цистеин) или ингибиторов этилена (AgNO 3 и аминоэтоксивинилглицин) в среду для совместного культивирования.Мы предположили, что антимикробные вторичные метаболиты могут быть причиной неспособности Agrobacterium инфицировать эти эксплантаты.
Чтобы избежать в эксплантатах антимикробных соединений, таких как гиперицины, мы использовали органогенные эксплантаты клубеньков, полученные из суспензионной культуры клеток, в которых отсутствуют гиперициновые железы (Franklin et al., 2007). При совместном культивировании с A. tumefaciens или A. rhizogenes эти эксплантаты начали становиться коричневыми в течение одного дня и впоследствии некротизировались в течение 10 дней.Они не показали какой-либо временной экспрессии GUS или образования каллуса при выращивании на селективной среде, содержащей антибиотик. С другой стороны, в неселективных условиях все экспланты, совместно культивируемые с A. tumefaciens и A. rhizogenes , восстановили свой нормальный рост в течение 5 дней и образовали каллусы, сопоставимые с контрольными эксплантами. Несмотря на потемнение, происходящее после совместного культивирования Agrobacterium , геномная ДНК, выделенная из эксплантов, не показала какой-либо фрагментации, что указывает на несовместимость опосредованной Agrobacterium трансформации в H.perforatum не является результатом некроза, вызванного запрограммированной гибелью клеток, как сообщалось у кукурузы (Hansen, 2000).
Когда среда для совместного культивирования была дополнена BHT, два экспланта, совместно культивированных с штаммом A. tumefaciens EHA105, и один эксплант, совместно культивировавшимся с штаммом A. tumefaciens LBA4404, показали синие фокусы в анализе GUS. В то же время эксплантаты, совместно культивируемые в присутствии других антиоксидантов и ингибиторов этилена, а также побеги, полученные из каллусов, сохраняемых в неселективной среде после совместного культивирования, не проявляли экспрессии гена GUS.Несмотря на то, что каллусы, полученные в неселективных условиях, регенерировали побеги в качестве контроля, ни один из них не был трансгенным. Ряд видов растений, ранее считавшихся устойчивыми к A. tumefaciens , стали трансформируемыми при добавлении антиоксидантов (Das et al., 2002; Frame et al., 2002) и ингибиторов этилена (Han et al., 2005; Petri et al., 2005; Seong et al., 2005) в среде для совместного культивирования. Это происходит главным образом из-за того, что эти поглотители могут подавлять окислительный выброс или образование этилена во время взаимодействий между растениями и агробактериями .Однако в нашем случае тестируемые антиоксиданты и ингибиторы этилена, добавленные в среду для совместного культивирования, не предотвращали потемнение тканей и не способствовали трансформации.
H. perforatum Ответ защиты растений против AgrobacteriumМеханизм устойчивости H. perforatum к инфекции Agrobacterium был изучен с использованием суспензионных культур клеток (Franklin et al., 2008, 2009a). Вкратце, суспензионная культура клеток H. perforatum была заражена A.tumefaciens , штамм EHA105 и A. rhizogenes , штамм A4, оба содержат плазмиду pCAMBIA1301. После различных периодов постинокуляции (0, 6, 12 и 24 ч) анализировали как клетки растений, так и бактерии. Наблюдалась типичная двухфазная вспышка АФК (активных форм кислорода) с последующим потемнением клеток H. perforatum . Несмотря на продукцию АФК, клеток H. perforatum не подверглись явному апоптотическому процессу, в то время как клеток A. tumefaciens и A.rhizogenes достиг 99% смертности в течение 12 часов совместного культивирования (Franklin et al., 2008). С другой стороны, совместное культивирование A. tumefaciens с клетками BY2 табака в тех же условиях приводит к успешному переносу Т-ДНК.
В дополнение к продукции ROS, гены, кодирующие важные ферменты фенилпропаноидного пути, такие как фенилаланинаммиаклиаза (PAL), 4-кумарат: CoA-лигаза (4CL) и бензофенон-синтаза (BPS), были активированы, что в конечном итоге привело к изменению профиль вторичных метаболитов.Анализ растворимой фенольной фракции показал огромное увеличение концентрации ксантона и появление многих ксантонов в клетках H. perforatum после совместного культивирования Agrobacterium , в то время как содержание флавоноидов осталось неизменным (Franklin et al., 2009a). Недавно мы изучили изменения в фракциях клеточной стенки H. perforatum и связанных с клеточной стенкой фенольных соединениях в ответ на выявление A. tumefaciens (Singh et al., 2014).Это исследование показало, что содержание лигнина было значительно увеличено в клеточных стенках H. perforatum после выявления A. tumefaciens (0,085–0,24 мг / мг сухой массы клеточной стенки), что подразумевает, что H. perforatum укрепляет клеточную стенку в качестве защитного меры против инфекции A. tumefaciens . Точно так же содержание флавоноидов (например, кверцетина, кверцетрина и т. Д.) Также было значительно выше в клеточных стенках вызванных клеток по сравнению с контролем. Следовательно, в дополнение к PAL, 4CL и BPS (Franklin et al., 2009a), халконсинтаза (CHS) также активируется после выявления (Singh et al., 2014). В то время как эти ксантоны, продуцируемые в ответ на активацию A. tumefaciens , были включены в растворимую фенольную фракцию, флавоноиды фактически были включены в клеточную стенку. Это быстрое изменение вторичных метаболитов увеличивало антиоксидантную и противомикробную способность клеток по сравнению с контрольными клетками, показывая, что это изменение играет двойную роль в клетках растений; как антиоксиданты для защиты клеток от окислительного повреждения и как фитоалексины для замедления роста патогенов при взаимодействии Agrobacterium .
Таким образом, мы предоставили первое свидетельство типичного окислительного всплеска в сочетании с активацией генов фенилпропаноидного пути в ответ на совместное культивирование Agrobacterium , что может предотвратить перенос Т-ДНК. Недавно сообщалось об усилении регуляции связанного с патогенезом гена 10 (PR10) (Sliwiak et al., 2015) в H. perforatum при совместном культивировании A. tumefaciens (Kosuth et al., 2013). Основываясь на приведенных выше наблюдениях, мы полагаем, что устойчивые растения могут мобилизовать свои антиоксидантные, противомикробные и PR-защитные механизмы против Agrobacterium (рис. 2).
Рисунок 2. Модель, обобщающая активацию защиты растений в H. perforatum при его взаимодействии с Agrobacterium .
Принимая во внимание все исследования, проведенные до сих пор в нашей лаборатории и другими, появляется изображение того, что как при совместимых, так и при несовместимых взаимодействиях растений Agrobacterium индуцируется начальный защитный ответ. В случае совместимых взаимодействий, несмотря на первоначальную временную активацию базовой защиты хозяина, последующий перенос факторов вирулентности может привести к подавлению защиты растений, что приведет к успешной трансформации, наблюдаемой в табаке (Veena et al., 2003; Франклин и др., 2008). Напротив, при несовместимых взаимодействиях первоначально вызванный защитный ответ растения является длительным (и успешным), следовательно, воздействуя на бактерию и предотвращая перенос Т-ДНК в клетки растения, как это наблюдалось в H. perforatum (Franklin et al., 2008). ), что делает эти растения устойчивыми к трансформации, опосредованной Agrobacterium .
Биолистическая трансформация
H. perforatumБиолистическая технология (бомбардировка частицами) — полезный метод, используемый при генетическом манипулировании многими программами улучшения сельскохозяйственных культур.В этом методе вектор, несущий интересующий ген, наносят на металлические частицы и бомбардируют ткани-мишени с высокой силой / давлением с помощью биолистического устройства или генной пушки (Kikkert et al., 2005). Биолистический метод не только позволяет экспрессию нескольких трансгенов в ткани-мишени, что может быть достигнуто путем слияния генов в одной плазмиде, которая затем бомбардируется в ткани-мишени, но также служит альтернативным методом для достижения временной или стабильной трансформации. в Agrobacterium устойчивых видов растений.В последние годы кассеты экспрессии генов были успешно перенесены во многие устойчивые виды растений (Guirimand et al., 2009; Liu et al., 2014; Sparks and Jones, 2014; Carqueijeiro et al., 2015; Zhang et al., 2015). ). Использование бомбардировки облегчило перенос больших фрагментов ДНК в геном растения, хотя целостность ДНК вызывает беспокойство (Barampuram and Zhang, 2011).
Благодаря биолистической технологии микрочастицы, покрытые ДНК (золото или платина), ускоряются непосредственно в неповрежденные ткани с помощью физического процесса, что позволяет избежать негативного влияния A.tumefaciens компонентов (элиситоров), а гены могут быть доставлены буквально в любой тип клеток. Достигнув ядра, ДНК может быть случайным образом интегрирована в геном хозяина. Поскольку H. perforatum остается очень устойчивым к генетической трансформации, опосредованной A. tumefaciens (Franklin et al., 2007, 2008), мы использовали биолистическую бомбардировку для трансформации этого вида (Рисунок 3). В данной работе в качестве целевых материалов использовались органогенные эксплантаты клубеньков, полученные из суспензионной культуры клеток.Система доставки частиц PDS-1000 / He (Bio-Rad) была использована для введения генов HPT и GUS из бинарного вектора pCAMBIA1301 в ткань H. perforatum . После отбора подвергнутых бомбардировке эксплантатов были получены устойчивые к гигромицину трансгенные культуры каллуса и впоследствии GUS-положительные растения. Методы молекулярной биологии, такие как ПЦР и Саузерн-блот-анализ, были использованы для анализа трансгенной природы полученных растений. Результаты впервые продемонстрировали, что H.perforatum можно было трансформировать, и трансгенные растения можно было получить путем биолистической бомбардировки новых суспензионных культур органогенных клеток.
Фигура 3. Схема, показывающая опосредованную биолистической бомбардировкой трансформацию H. perforatum на основе результатов, сообщенных ранее (Franklin et al., 2007, 2009b) .
Генотип, физиологический возраст, тип эксплантата, период культивирования до и после переноса гена, состав культуральной среды и предварительная осмотическая обработка были ключевыми параметрами, влияющими на эффективность трансформации, опосредованной бомбардировкой частицами.Что касается биолистического устройства, давление ускорения, расстояние между разрывной мембраной, макроносителем, останавливающим экраном и мишенной пластиной, вакуумное давление в бомбардировочной камере, количество бомбардировок, а также размер и плотность микрочастиц, ДНК-микро- протоколы смешивания частиц и физическая конфигурация трансформации ДНК — все это влияло на эффективность трансформации.
Перспективы на будущее и стратегии для
H. perforatum ТрансформацияУлучшение содержания существующих биологически активных соединений (гиперицин, гиперфорин, ксантоны и др.)) и производство новых вариантов являются основными целями генной инженерии H. perforatum . Хотя сверхэкспрессия генов, участвующих в этапах биосинтеза, ограничивающих скорость, позволит нам достичь вышеуказанных целей, инженерия путей у этого вида все еще находится в зачаточном состоянии, в основном из-за отсутствия генетической информации об этих биосинтетических путях и из-за отсутствия эффективных метод трансформации. Например, хотя гиперицин был идентифицирован много веков назад, его биосинтетический путь еще не изучен.Исследования генов, участвующих в биосинтезе гиперицина, начались только недавно, а о систематическом анализе генов, участвующих в биосинтезе гиперицина, еще не сообщалось. Десять лет назад предполагалось, что биосинтез гиперицина происходит посредством поликетидного пути, в котором поликетидсинтазы типа III действуют как ключевые ферменты (Bais et al., 2003). Хотя ген, названный hyp1, был клонирован из красных суспензионных клеток и, как утверждается, участвует в последних этапах биосинтеза гиперицина (Bais et al., 2003), недавние исследования противоречат его участию (Karppinen et al., 2008, 2010; Kosuth et al., 2011). Паттерн экспрессии этого гена не коррелирует с продукцией гиперицина, поскольку этот ген конститутивно экспрессируется в тканях (корнях) и видов Hypericum , которые не продуцируют гиперицин (Kosuth et al., 2007). Недавнее исследование показало, что экспрессия hyp1 не является ограничивающим фактором биосинтеза гиперицина у видов, которые обычно продуцируют гиперицин (Kosuth et al., 2011). Недавно de novo секвенирования транскриптомов H. perforatum дало огромное количество генетических данных (He et al., 2012; Галла и др., 2015; Сотак и др., 2016). Кроме того, используя сильную корреляцию между наличием темных желез и накоплением гиперицина, мы выполнили вычитание между кДНК тканей с гиперициновыми железами и без них, чтобы построить библиотеку кДНК, специфичную для гиперициновых желез (Singh et al., 2016).
Как правило, функции генов можно предсказать с помощью как прямого, так и обратного генетических подходов. H. perforatum обладает полиплоидным (тетраплоидным или гексаплоидным) геномом, в котором гены обычно представлены двумя или тремя гомеологичными копиями с высоким сходством последовательностей.Поскольку эффект нокаута одного гена обычно может быть сведен на нет функциональной избыточностью гомеологических генов, присутствующих в других геномах, прямые генетические подходы, такие как мутагенез, будут неэффективными. У растений с полиплоидными геномами РНК-интерференция (РНКи) является ценным методом, с помощью которого можно одновременно снижать регуляцию нескольких гомеологов. РНКи представляет собой явление глушения генов, индуцированное двухцепочечной РНК (дцРНК), которое сохраняется среди различных организмов, включая животных и растения.Технология РНКи может блокировать активность ферментов, которые не только кодируются мультигенным семейством, но также экспрессируются во многих тканях и на разных стадиях развития. Эта технология успешно использовалась при вскрытии вторичных метаболических путей (Lin et al., 2015). Альтернативно, система коротких палиндромных повторов (CRISPR) / CRISPR-ассоциированного белка (Cas9) может быть использована для нокдауна функции гена (Xing et al., 2014). В этой системе используется нуклеаза Cas9, управляемая РНК, для индукции двухцепочечных разрывов.Опосредованные Cas9 разрывы репарируются с помощью механизмов репарации клеточной ДНК и опосредуют модификации гена / генома. Хотя использование вышеуказанных методов в H. perforatum было бы полезно для понимания функций генов, кассеты RNAi и CRISPR-кассеты необходимо ввести в геном H. perforatum , что требует надежного метода генетической трансформации. Другой мощный обратный генетический подход, сочетающий химический мутагенез с высокопроизводительным скринингом мутаций, известный как TILLING (Targeting Induced Local Lesions in Genomes), не требует генетической трансформации.Хотя полиплоиды хорошо подходят для TILLING из-за их устойчивости к высокой плотности мутаций, этот подход требует много времени, трудоемок и сложен для H. perforatum , поскольку образование семян у этого вида оказалось очень полиморфным (Matzk et al., 2001 ).
Хотя гетерологичная экспрессия генов вторичных метаболических путей привела к успешному продуцированию многих вторичных метаболитов в микробных системах, гетерологичная экспрессия специфических путей Hypericum (e.g., биосинтез гиперицина) в настоящее время ограничивается отсутствием клонированных генов, кодирующих ферменты, участвующие в представляющих интерес путях. Более того, из-за потенциальной токсичности этих соединений для тканей растений они накапливаются в специализированных темных железах. Следовательно, анализ функций генов, связанных с синтезом гиперицина, будет возможен только в системе, содержащей эти железы.
По вышеуказанным причинам создание эффективного протокола опосредованной трансформации A. tumefaciens неизбежно для продвижения H.perforatum функциональная геномика и метаболическая инженерия.
Активация защиты растений считается основной причиной устойчивости растений к инфекции Agrobacterium (Franklin et al., 2008; Pitzschke, 2013). Следовательно, для достижения оптимальной доставки гена в клетки H. perforatum через Agrobacterium важно либо подавление, либо предотвращение возникновения защитных реакций.
A. tumefaciens — H.perforatum приводит к продукции ROS. Последствия окислительного взрыва защитных реакций растений могут быть подавлены добавлением антиоксидантов, таких как аскорбиновая кислота, цистеин, лимонная кислота, поливинилполипирролидон (PVPP), поливинилпирролидон (PVP), дитиотреитол (DTT), BHT, токоферол и т. Д. , следует напомнить, что использование этих соединений по отдельности не помогло в трансформации H. perforatum в наших предыдущих попытках (Franklin et al., 2007). Тем не менее, применение смеси антиоксидантов может быть полезным, поскольку было показано, что она повышает эффективность трансформации, опосредованной Agrobacterium , у ряда других устойчивых видов растений (Dan, 2008; Dan et al., 2010, 2015) . Также важно понимать сигнальные события, которые запускают активацию защиты H. perforatum при взаимодействии Agrobacterium . Сигнальные пути растений, связанные с системной резистентностью и вторичным метаболизмом, участвуют в успешной активации защитных ответов против A.tumefaciens (Юань и др., 2007; Франклин и др., 2008). Следует отметить, что было продемонстрировано участие салициловой кислоты (СК) в подавлении экспрессии регулона A. tumefaciens vir и тем самым в прямом нарушении процесса инфицирования (Yuan et al., 2007; Anand et al., 2008). ). Следовательно, ингибирование сигнальных путей, таких как SA, метилжасмонат (MeJ), жасмоновая кислота (JA), оксид азота (NO) и фенилпропаноидный путь с помощью ингибиторов [паклобутразол, 2-4-карбоксифенил-4,4,5,5 -тетраметилимидазолин-1-оксил-3-оксид (cPTIO), 2-аминоиндан-2-фосфоновая кислота (AIP) или диэтиокарбамат] может улучшить скорость превращения.
В дополнение к вышеуказанным стратегиям подавления защиты растений, защитную реакцию растений против A. tumefaciens можно обойти, применяя следующие принципы. Хотя H. perforatum остается невосприимчивым к трансформации, опосредованной Agrobacterium (Franklin et al., 2007, 2008), мы смогли успешно трансформировать это растение и получить трансгенные растения посредством трансформации, опосредованной бомбардировкой частицами (Franklin et al., 2007, 2009b), предполагая, что H.perforatum Устойчивость к трансформации, опосредованной A. tumefaciens , обеспечивается бактериальными компонентами. Несмотря на присутствие хорошо охарактеризованных патоген-ассоциированных молекулярных паттернов (PAMP) у A. tumefaciens , таких как флагеллин и EF-Tu, также известно, что не все растения реагируют на все элиситоры (Felix and Boller, 2003; Kunze et al., 2004). Следовательно, очень важно идентифицировать конкретные элиситоры / PAMP A. tumefaciens , которые распознаются H.perforatum , чтобы активировать свой защитный механизм, поскольку A. tumefaciens , лишенные функции активатора, смогут эффективно преобразовать H. perforatum . Однако может оказаться невозможным получить мутанты-элиситоры, если эта мутация является летальной.
Стенка растительной клетки играет решающую роль в восприятии сигналов (например, ассоциированных со стенкой рецепторных киназ), установлении базовой защиты хозяина и служит основным местом активации защиты (Yeom et al., 2012). Присутствия стенок растительных клеток можно избежать, используя трансформацию протопластов.Возможна эффективная изоляция жизнеспособных протопластов из H. perforatum и последующая регенерация (Pan et al., 2004). Используя преимущества тесного латерального контакта A. tumefaciens с протопластами растений через множественных вирулентных систем секреции типа IV (Aguilar et al., 2011), можно осуществить перенос Т-ДНК , опосредованный A. tumefaciens (Wang и др., 2005). Однако возможно, что протопласты могут продуцировать АФК и растворимые фенольные соединения во время процесса мацерации и в ответ на А.tumefaciens . Следовательно, при необходимости здесь могут быть использованы химические ингибиторы защитных путей и поглотители АФК. Следовательно, можно с высокой эффективностью трансформировать изолированные протопласты с помощью A. tumefaciens . Кроме того, используя жидко-мозаичные характеристики протопластов, можно достичь таких методов поглощения голой ДНК, как трансфекция полиэтиленгликолем (ПЭГ) и электропорация (Hassanein et al., 2009), при которых как стенки клеток растений, так и бактерии компоненты исключены.
Помимо вышеперечисленных стратегий, также может использоваться вирусная трансформация. Были идентифицированы и охарактеризованы вирусы, поражающие H. perforatum (Kegler et al., 1999) и H. japonicum (Du et al., 2013). Более того, доставка ДНК в клетки растений, опосредованная наночастицами, набирает обороты (Rai et al., 2015), что также может дать потенциальные преимущества в генетической трансформации H. perforatum в будущем.
Прогресс в областях H.perforatum – Agrobacterium , такое как понимание молекулярных механизмов распознавания и активации защиты Agrobacterium вместе с новыми стратегиями, обсуждаемыми здесь, позволит нам в полной мере использовать и максимально использовать потенциал этого чрезвычайно полезного источника биотерапевтических средств.
Авторские взносы
GF задумал идею этого обзора, разработал общую концепцию и участвовал в написании. WH и PS участвовали в написании статьи и оформлении таблиц и рисунков.Все авторы одобрили окончательную версию.
Заявление о конфликте интересов
Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.
Благодарности
GF и PS финансируются из проекта BIOTALENT (GA621321), финансируемого Седьмой рамочной программой Европейского Союза (FP7) Пилотный конкурс председателей ERA и софинансируются за счет средств, выделенных на образование в рамках проекта № W26 / 7.PR / 2015 [GA 3413 / 7.PR / 2015/2] на 2015-2019 годы. Эта работа была частично поддержана проектом Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) (PTDC / AGR-GPL / 119211/2010). WH благодарит финансовую поддержку, предоставленную FCT (SFRH / BD / 52561/2014) в рамках докторской программы «Цепи сельскохозяйственного производства — от вилки до фермы» (PD / 00122/2012).
Список литературы
Agostinis, P., Vantieghem, A., Merlevede, W., and De Witte, P.A. (2002). Гиперицин в лечении рака: впереди еще много света. Внутр. J. Biochem. Cell Biol. 34, 221–241. DOI: 10.1016 / S1357-2725 (01) 00126-1
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Агилар, Дж., Кэмерон, Т. А., Зупан, Дж., И Замбрыски, П. (2011). Периплазматическая мембрана и ядро Agrobacterium tumefaciens Компоненты системы секреции вирулентного типа IV локализуются во множестве участков по периметру бактерий во время латерального прикрепления к клеткам растений. MBio 2, e00218 – e00211. DOI: 10.1128 / mBio.00218-11
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ананд, А., Уппалапати, С. Р., Рю, К. М., Аллен, С. Н., Кан, Л., Тан, Ю. Х. и др. (2008). Салициловая кислота и системная приобретенная резистентность играют роль в ослаблении болезни коронковой желчи, вызываемой Agrobacterium tumefaciens . Plant Physiol. 146, 703–715. DOI: 10.1104 / стр.107.111302
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Аян, А.К., Чирак, К., Кевсероглу, К., и Сёкмен, А. (2005). Влияние типов эксплантатов и различных концентраций сахарозы и фитогармонов на регенерацию растений и содержание гиперицина в Hypericum perforatum L. Turkish J. Agric. Лесное хозяйство 29, 197–204.
Google Scholar
Байс, Х. П., Вепачеду, Р., Лоуренс, К. Б., Стермитц, Ф. Р., и Виванко, Дж. М. (2003). Молекулярная и биохимическая характеристика фермента, ответственного за образование гиперицина в зверобоях.Зверобой ( Hypericum perforatum L.). J. Biol. Chem. 278, 32413–32422. DOI: 10.1074 / jbc.M301681200
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Бертоли А., Джованнини А., Руффони Б., Гуардо А. Д., Спинелли Г., Маццетти М. и др. (2008). Производство биоактивных компонентов зверобоя in vitro волосистых корней. Регенерированные линии растений. J. Agric. Food Chem. 56, 5078–5082. DOI: 10.1021 / jf0729107
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Carqueijeiro, I., Masini, E., Foureau, E., Sepulveda, L.J., Marais, E., Lanoue, A., et al. (2015). Индуцированное вирусом подавление гена в Catharanthus roseus путем биолистной инокуляции векторов вируса табачной погремушки. Plant Biol. (Штутг) 17, 1242–1246. DOI: 10.1111 / plb.12380
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Целларова Е., Кимакова К., Брутовска Р. (1992). Множественные побеги и фенотипические изменения регенерантов R0 у Hypericum perforatum L. Acta Biotechnol. 12, 445–452. DOI: 10.1002 / abio.370120602
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дэн Ю. (2008). Биологические функции антиоксидантов в трансформации растений. Клетка in vitro. Dev. Биол. Завод 44, 149–161. DOI: 10.1007 / s11627-008-9110-9
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дэн, Ю., Бакстер, А., Чжан, С., Пантазис, К. Дж., И Вейле, Р. Э. (2010). Разработка эффективной системы регенерации и трансформации растений для недоношенных растений с использованием Agrobacterium tumefaciens и нескольких культур почек в качестве эксплантов. BMC Plant Biol. 10: 165. DOI: 10.1186 / 1471-2229-10-165
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дэн, Ю., Чжан, С., Чжун, Х., И, Х., и Сайнз, М. Б. (2015). Новые соединения, которые усиливают трансформацию растений, опосредованную Agrobacterium , путем смягчения окислительного стресса. Plant Cell Rep. 34, 291–309. DOI: 10.1007 / s00299-014-1707-3
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Дас, Д.К., Редди, М. К., Упадхьяя, К. К., и Сопори, С. К. (2002). Эффективный метод культивирования листовых дисков для регенерации посредством соматического эмбриогенеза и трансформации винограда ( Vitis vinifera L .). Plant Cell Rep. 20, 999–1005. DOI: 10.1007 / s00299-002-0441-4
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ди Гуардо А., Целларова Е., Копердакова Дж., Пистелли Л., Руффони Б., Аллавена А. и др. (2003). Индукция опушения корней и регенерация растений у Hypericum perforatum L. J. Genet. Порода. 57, 269–278.
Google Scholar
Du, Z., Tang, Y., Zhang, S., She, X., Lan, G., Varsani, A., et al. (2013). Идентификация и молекулярная характеристика вируса с одноцепочечной кольцевой ДНК, сходного с Sclerotinia sclerotiorum , ДНК вируса, ассоциированного с гиповирулентностью 1. Arch. Virol. 159, 1527–1531. DOI: 10.1007 / s00705-013-1890-5
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Феликс, Г.и Боллер Т. (2003). Молекулярное зондирование бактерий в растениях — высококонсервативный РНК-связывающий мотив RNP-1 белков бактериального холодового шока распознается как элиситорный сигнал в табаке. J. Biol. Chem. 278, 6201–6208. DOI: 10.1074 / jbc.M209880200
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Frame, B. R., Shou, H. X., Chikwamba, R. K., Zhang, Z. Y., Xiang, C. B., Fonger, T. M., et al. (2002). Трансформация зародышей кукурузы, опосредованная Agrobacterium tumefaciens , с использованием стандартной бинарной векторной системы. Plant Physiol. 129, 13–22. DOI: 10.1104 / pp.000653
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Франклин, Г., Консейсао, Л. Ф. Р., Комбринк, Э., и Диас, А. С. П. (2008). Клетки растений Hypericum perforatum снижают жизнеспособность Agrobacterium при совместном культивировании. Planta 227, 1401–1408. DOI: 10.1007 / s00425-008-0691-7
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Франклин, Г., Консейсао, Л. Ф. Р., Комбринк, Э., и Диас, А. С. П. (2009a). Биосинтез ксантона в клетках Hypericum perforatum обеспечивает антиоксидантную и антимикробную защиту при биотическом стрессе. Фитохимия 70, 60–68. DOI: 10.1016 / j.phytochem.2008.10.016
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Франклин, Г., и Диас, А. С. П. (2006). Органогенез и эмбриогенез нескольких генотипов Hypericum perforatum . Клетка in vitro.Dev. Биол. Завод 42, 324–330. DOI: 10.1079 / IVP2006787
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Франклин, Г., и Диас, А. С. П. (2011). Хлорогеновая кислота участвует в регуляции роста побегов, корней и корневых волосков у Hypericum perforatum . Plant Physiol. Biochem. 49, 835–842. DOI: 10.1016 / j.plaphy.2011.05.009
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Франклин Г., Оливейра М. и Диас А.К. П. (2007). Получение трансгенных растений Hypericum perforatum путем трансформации, опосредованной бомбардировкой частицами, новых суспензионных культур органогенных клеток. Plant Sci. 172, 1193–1203. DOI: 10.1016 / j.plantsci.2007.02.017
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Галла, Г., Фогель, Х., Шарбель, Т. Ф., и Баркачча, Г. (2015). De novo секвенирование транскриптома цветка Hypericum perforatum L. для выявления потенциальных генов, связанных с чувственным размножением растений. BMC Genomics 16: 254. DOI: 10.1186 / s12864-015-1439-y
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Гоэль, М. К., Кукрежа, А. К., и Бишт, Н. С. (2008). In vitro манипуляций с зверобоем ( Hypericum perforatum L.) для непрерывного и масштабного микроразмножения с использованием придаточных корней в жидкой среде и оценки клональной верности с помощью анализа RAPD. Культ растительных клеток и органов. 96, 1–9. DOI: 10.1007 / s11240-008-9453-2
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Guirimand, G., Burlat, V., Oudin, A., Lanoue, A., St-Pierre, B., and Courdavault, V. (2009). Оптимизация временной трансформации клеток Catharanthus roseus путем бомбардировки частицами и ее применение для субклеточной локализации гидроксиметилбутенил-4-дифосфатсинтазы и гераниол-10-гидроксилазы. Plant Cell Rep. 28, 1215–1234. DOI: 10.1007 / s00299-009-0722-2
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хан, Дж.С., Ким, К. К., Парк, С. Х., Хирши, К. Д., и Мок, И. (2005). Опосредованная агробактериями трансформация бутылочной тыквы ( Lagenaria siceraria Standl.). Plant Cell Rep. 23, 692–698. DOI: 10.1007 / s00299-004-0874-z
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Hassanein, A., Hamama, L., Loridon, K., and Dorion, N. (2009). Исследование прямого переноса генов и регенерация трансгенных растений после электропорации в протопласты мезофилла Pelargonium x hortorum , «Panache Sud». Plant Cell Rep. 28, 1521–1530. DOI: 10.1007 / s00299-009-0751-x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хэ М., Ван Ю., Хуа В., Чжан Ю. и Ван З. (2012). De novo секвенирование транскриптома Hypericum perforatum для выявления потенциальных генов, участвующих в биосинтезе активных метаболитов. PLoS ONE 7: e42081. DOI: 10.1371 / journal.pone.0042081
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Хван, Х.Х., Галвин, С. Б., и Лай, Э. М. (2015). Редакция: «Биология Agrobacterium и ее применение в производстве трансгенных растений». Фронт. Plant Sci. 6: 265. DOI: 10.3389 / fpls.2015.00265
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Карппинен, К., Хокканен, Дж., Маттила, С., Нойбауэр, П., и Хохтола, А. (2008). Поликетидсинтаза типа III, продуцирующая октакетид, из Hypericum perforatum экспрессируется в темных железах, накапливающих гиперицины. FEBS J. 275, 4329–4342. DOI: 10.1111 / j.1742-4658.2008.06576.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Карппинен, К., Таулавуори, Э., и Хохтола, А. (2010). Оптимизация экстракции белка из тканей Hypericum perforatum и иммуноблоттинг-обнаружение Hyp-1 на разных стадиях развития листа. Мол. Biotechnol. 46, 219–226. DOI: 10.1007 / s12033-010-9299-9
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кеглер, Х., Fuchs, E., Plescher, A., Ehrig, F., Schliephake, E., and Grüntzig, M. (1999). Доказательства и характеристика вируса зверобоя ( Hypericum perforatum L.). Arch. Фитопатол. Plant Prot. 32, 205–221. DOI: 10.1080 / 032354093290
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Киккерт, Дж. Р., Видаль, Дж. Р., и Райш, Б. И. (2005). Применение биолистического метода генетической трансформации виноградной лозы. Acta Hortic. 689, 459–462.DOI: 10.17660 / ActaHortic.2005.689.54
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кошут, Дж., Хрехорова, Д., Яскольски, М., Целларова, Е. (2013). Стресс-индуцированная экспрессия и структура предполагаемого гена hyp-1 для биосинтеза гиперицина. Культ растительных клеток и органов. 114, 207–216. DOI: 10.1007 / s11240-013-0316-0
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кошут, Й., Катковчинова, З., Олексова, П., и Челларова, Э. (2007). Экспрессия гена hyp-1 на ранних стадиях развития Hypericum perforatum L. Plant Cell Rep. 26, 211–217. DOI: 10.1007 / s00299-006-0240-4
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст
Kosuth, J., Smelcerovic, A., Borsch, T., Zuehlke, S., Karppinen, K., Spiteller, M., et al. (2011). Ген hyp-1 не является ограничивающим фактором для биосинтеза гиперицина у представителей рода Hypericum. Функц. Plant Biol. 38, 35–43. DOI: 10.1071 / FP10144
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кумар Н., Гулати А. и Бхаттачарья А.(2013). L-глутамин и L-глутаминовая кислота способствуют успешному заражению Agrobacterium устойчивых сортов чая. заявл. Biochem. Biotechnol. 170, 1649–1664. DOI: 10.1007 / s12010-013-0286-z
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Кунце, Г., Ципфель, К., Робацек, С., Нихаус, К., Боллер, Т., и Феликс, Г. (2004). N-конец бактериального фактора элонгации Tu вызывает врожденный иммунитет у растений Arabidopsis . Растительная клетка 16, 3496–3507.DOI: 10.1105 / tpc.104.026765
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лекрубье Ю., Клерк Г., Диди Р. и Кизер М. (2002). Эффективность экстракта зверобоя WS 5570 при большой депрессии: двойное слепое плацебо-контролируемое исследование. г. J. Psychiatry 159, 1361–1366. DOI: 10.1176 / appi.ajp.159.8.1361
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Лин, К. Ю., Ван, Дж. П., Ли, К., Чен, Х. К., Лю, Дж., Лозюк, П., и другие. (2015). 4-кумароил и кофеил шикимовая кислоты ингибируют 4-кумаровую кислоту: лигазы кофермента А и модулируют метаболический поток для 3-гидроксилирования в биосинтезе монолигнола P opulus trichocarpa . Мол. Завод 8, 176–187. DOI: 10.1016 / j.molp.2014.12.003
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Мацк Ф., Мейстер А., Брутовска Р. и Шуберт И. (2001). Реконструкция репродуктивного разнообразия у Hypericum perforatum L.открывает новые стратегии управления апомиксисом. Plant J. 26, 275–282. DOI: 10.1046 / j.1365-313x.2001.01026.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Марч, С. Дж., Чоффе, К. Л., Виктор, Дж. М. Р., Слиммон, Т. Ю., Кришнарадж, С., и Саксена, П. К. (2000). Регенерация растений, индуцированная тидиазуроном, из культур гипокотилей зверобоя ( Hypericum perforatum , cv «Anthos»). Plant Cell Rep. 19, 576–581. DOI: 10.1007 / s0029776
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Марч, С.Дж. И Саксена П. К. (2002). Нейрогормоны млекопитающих: потенциальное значение для репродуктивной физиологии зверобоя (Hypericum perforatum L.)? Naturwissenschaften 89, 555–560. DOI: 10.1007 / s00114-002-0376-1
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Оксман-Кальдентей, К. М., Севон, Н. (2002). Трансформация, опосредованная Agrobacterium rhizogenes : корневые культуры как источник алкалоидов. Planta Med. 68, 859–868.DOI: 10,1055 / с-2002-34924
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Палмер, К. Д., Келлер, В. А. (2011). Регенерация растений из эксплантатов лепестков Hypericum perforatum L. Культура тканевых органов растений. 105, 129–134. DOI: 10.1007 / s11240-010-9839-9
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Пан, З. Г., Лю, К. З., Марч, С. Дж., И Саксена, П. К. (2004). Материалы симпозиума конгресса SIVB 2004 г. «Мышление вне клетки»: оптимизированное химическое разнообразие в линиях, полученных из протопластов St.Зверобой ( Hypericum perforatum L.). Клетка in vitro. Dev. Биол. Завод 41, 226–231. DOI: 10.1079 / IVP2004635
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Паскуа, Г., Авато, П., Монацелли, Б., Сантамария, А. Р., и Арджентери, М. П. (2003). Метаболиты в клеточных суспензионных культурах, каллусах и in vitro, регенерированных органов Hypericum perforatum cv. Топас. Plant Sci. 165, 977–982. DOI: 10.1016 / S0168-9452 (03) 00275-9
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Петри, К., Альбурке, Н., Перес-Торнеро, О., и Бургос, Л. (2005). Импульсы ауксина и синергетическое взаимодействие между полиаминами и ингибиторами этилена улучшают побочную регенерацию из листьев абрикоса и опосредованную Agrobacterium трансформацию тканей листа. Культ растительных клеток и органов. 82, 105–111. DOI: 10.1007 / s11240-004-7013-y
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Претто, Ф. Р., и Сантарен, Э. Р. (2000). Формирование каллуса и регенерация растений из листьев Hypericum perforatum . Культ растительных клеток и органов. 62, 107–113. DOI: 10.1023 / A: 1026534818574
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Рай, М., Бансод, С., Баваскар, М., Гаде, А., Сантос, К. А., Сибра, А. Б. и др. (2015). «Системы доставки на основе наночастиц в генетической трансформации растений», в Нанотехнологии в продовольствии и сельском хозяйстве , ред. М. Рай, К. Рибейро, Л. Маттосо и Н. Дюран (Cham: Springer International Publishing), 209–239.
Google Scholar
Сантарен, Э.Р., Астарита Л. В. (2003). Образование множественных побегов у Hypericum perforatum L. и продукция гиперицина. Brazilian J. Plant Physiol. 15, 43–47. DOI: 10.1590 / S1677-04202003000100006
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сантарен, Э. Р., Замбан, Д. К., Феликс, Л. М., и Астарита, Л. В. (2008). Вторичный метаболизм Hypericum perforatum , индуцированный Agrobacterium rhizogenes . Клетка in vitro. Dev. Биол. Anim. 44, S52.
Сантарен, Э., Сильва, Т., Фрейтас, К., Сартор, Т., и Астарита, Л. (2010). Agrobacterium rhizogenes и салициловая кислота запускают защитные реакции в побегах Hypericum perforatum . Клетка in vitro. Dev. Биол. Anim. 46, S159 – S160.
Савио, Л. Э. Б., Астарита, Л. В., и Сантарен, Э. Р. (2011). Вторичный метаболизм у микроразмножающихся Hypericum perforatum L., выращенных в неаэрированной жидкой среде. Растительная клетка, культ тканевого органа.(PCTOC) 108, 465–472. DOI: 10.1007 / s11240-011-0058-9
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Шинази, Р. Ф., Чу, К. К., Бабу, Дж. Р., Освальд, Б. Дж., Заалманн, В., Кэннон, Д. Л. и др. (1990). Антрахиноны как новый класс противовирусных средств против вируса иммунодефицита человека. Antiviral Res. 13, 265–272. DOI: 10.1016 / 0166-3542 (90) -E
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сеонг, Э.С., Сонг, К.Дж., Джегал, С., Ю, К. Ю., Чанг, И. М. (2005). Нитрат серебра и аминоэтоксивинилглицин влияют на трансформацию яблони, опосредованную Agrobacterium . Регул роста растений. 45, 75–82. DOI: 10.1007 / s10725-004-6126-y
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Силва Б. А., Диас А. К., Ферререс Ф., Мальва Дж. О. и Оливейра К. Р. (2004). Нейропротекторный эффект экстрактов H. perforatum на нейротоксичность, вызванную бета-амилоидом. Neurotox Res. 6, 119–130. DOI: 10.1007 / BF03033214
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Силва Б. А., Ферререс Ф., Мальва Дж. О. и Диас А. С. П. (2005). Фитохимическая и антиоксидантная характеристика спиртовых экстрактов Hypericum perforatum . Food Chem. 90, 157–167. DOI: 10.1016 / j.foodchem.2004.03.049
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сингх Р. К., Хоу В. и Франклин Г. (2016). Библиотека кДНК, специфичная для гиперициновой железы, посредством супрессивной субтрактивной гибридизации. Methods Mol. Биол. 1391, 317–334. DOI: 10.1007 / 978-1-4939-3332-7_22
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сингх Р. К., Хоу В., Марслин Г., Диас А. С. П. и Франклин Г. (2014). Содержание лигнина и флавоноидов увеличивается в клеточной стенке Hypericum perforatum после совместного культивирования Agrobacterium tumefaciens . Planta Med. 80, 1388–1388. DOI: 10.1055 / с-0034-13
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сливяк, Дж., Даутер, З., Ковиль, М., Маккой, А. Дж., Рид, Р. Дж., И Яскольски, М. (2015). ANS-комплекс белка PR-10 зверобоя с 28 копиями в асимметричной единице: дьявольская комбинация псевдосимметрии с тетартоэдрическим двойникованием. Acta Crystallogr. D Biol. Кристаллогр. 71, 829–843. DOI: 10.1107 / S13915001388
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Сотак М., Черанкова О., Кляйн Д., Нигутова К., Альтшмид Л., Ли Л. и др. (2016).Дифференциально экспрессируемые гены в гиперицинсодержащих тканях листа Hypericum perforatum , что выявлено сборкой de novo RNA-Seq. Завод Мол. Биол. Rep. DOI: 10.1007 / s11105-016-0982-2. [Epub перед печатью].
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Траутманн-Спонсель, Р. Д., и Динель, А. (2004). Безопасность экстракта Hypericum у амбулаторных пациентов с депрессией легкой и средней степени тяжести — обзор, основанный на данных трех рандомизированных плацебо-контролируемых исследований. J. Affect. Disord. 82, 303–307. DOI: 10.1016 / j.jad.2003.12.017
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тусевски О., Петреска Станоева Ю., Стефова М., Павокович Д. и Гадзовска Шимич С. (2014). Идентификация и количественное определение фенольных соединений в трансгенных побегах Hypericum perforatum L. Acta Physiol. Растение. 36, 2555–2569. DOI: 10.1007 / s11738-014-1627-4
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тусевский, О., Петреска Станоева, Дж., Стефова, М., Симич, С. Г. (2013a). Фенольный профиль культур волосистых корней Hypericum perforatum L., выращенных в темноте и подвергшихся воздействию фотопериода. Scientific World J. 2013, 9. doi: 10.1155 / 2013/602752
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тусевски О., Станоева Ю. П., Стефова М., Кунгуловский Д., Панчевска Н. А., Секуловски Н. и др. (2013b). Волосатые корни Hypericum perforatum L: перспективная система для получения ксантона. центов. Евро. J. Biol. 8, 1010–1022. DOI: 10.2478 / s11535-013-0224-7
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Тусевски О., Станоева Дж., Стефова М., Симич С. Г. (2015). Agrobacterium усиливает продукцию ксантона в суспензиях клеток Hypericum perforatum . Регул роста растений. 76, 199–210. DOI: 10.1007 / s10725-014-9989-6
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Вина Цзян, Х. М., Дёрге, Р. У., и Гелвин, С.Б. (2003). Перенос белков Т-ДНК и Vir в клетки растений с помощью Agrobacterium tumefaciens индуцирует экспрессию генов-хозяев, участвующих в опосредовании трансформации, и подавляет экспрессию защитных генов хозяина. Plant J. 35, 219–236. DOI: 10.1046 / j.1365-313X.2003.01796.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст
Винтерхальтер Б., Нинкович С., Цингель А. и Винтерхальтер Д. (2006). Культура побегов и корней Hypericum perforatum L., трансформированная Agrobacterium rhizogenes A4M70GUS. Biol. Растение. 50, 767–770. DOI: 10.1007 / s10535-006-0127-9
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Винтерхальтер Б., Здравкович-Корач С., Митич Н., Боханец Б., Винтерхальтер Д. и Савич Дж. (2015). Влияние сахарозы на регенерацию побегов у корней Agrobacterium , трансформированных Hypericum perforatum L. Acta Physiol. Растение. 37, 1–12. DOI: 10.1007 / s11738-015-1785-z
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ван, Ю.П., Зоннтаг К., Рудлофф Э. и Хан Дж. (2005). Получение фертильной трансгенной Brassica napus посредством трансформации протопластов, опосредованной Agrobacterium . Заводская порода. 124, 1–4. DOI: 10.1111 / j.1439-0523.2004.01015.x
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Xing, H. L., Dong, L., Wang, Z. P., Zhang, H. Y., Han, C. Y., Liu, B., et al. (2014). Набор инструментов CRISPR / Cas9 для мультиплексного редактирования генома растений. BMC Plant Biol. 14: 327.DOI: 10.1186 / s12870-014-0327-y
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Xu, R.F., Li, H., Qin, R.Y., Wang, L., Li, L., Wei, P.C, et al. (2014). Нацеливание на гены с использованием системы CRISPR-Cas, опосредованной Agrobacterium tumefaciens , в рисе. Рис 7: 5. DOI: 10.1186 / s12284-014-0005-6
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Ядолла-Дамаванди, С., Чавоши-Неджад, М., Джангхоли, Э., Некуйян, Н., Hosseini, S., Seifaee, A., et al. (2015). Местное применение Hypericum perforatum улучшает регенерацию тканей в полнослойных эксцизионных ранах на модели крыс с диабетом. Evid. На основе дополнения. Альтернат. Med. 2015: 245328. DOI: 10.1155 / 2015/245328
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Йом, С. И., Со, Э., О, С. К., Ким, К. В., и Чой, Д. (2012). Обычный белок клеточной стенки растений HyPRP1 выполняет двойную роль как положительный регулятор гибели клеток и отрицательный регулятор базовой защиты от патогенов. Завод J. 69, 755–768. DOI: 10.1111 / j.1365-313X.2011.04828.x
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Юань, З. К., Эдлинд, М. П., Лю, П., Саенкхам, П., Банта, Л. М., Уайз, А. А. и др. (2007). Сигнальная салициловая кислота растений подавляет экспрессию виррегулона и активирует гены, подавляющие квормон, в Agrobacterium . Proc. Natl. Акад. Sci. США 104, 11790–11795. DOI: 10.1073 / pnas.0704866104
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Чжан, К., Лю, Дж., Чжан, Ю., Ян, З., и Гао, К. (2015). Биолистическая генетическая трансформация широкого спектра сортов китайской элитной пшеницы ( Triticum aestivum L). J. Genet. Геномика 42, 39–42. DOI: 10.1016 / j.jgg.2014.11.005
PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar
Зобайед, С.М.А., Марч, С.Дж., Рупасингх, Х.П.В., и Саксена, П.К. (2004). In vitro производство и химическая характеристика зверобоя ( Hypericum perforatum L.cv «New Stem»). Plant Sci. 166, 333–340. DOI: 10.1016 / j.plantsci.2003.10.005
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Зобайед, С.М.А., и Саксена, П.К. (2003). Корни, выращенные in vitro : превосходный эксплант для регенерации плодовитых побегов зверобоя ( Hypericum perforatum L. cv «New Stem») во временном иммерсионном биореакторе. Plant Sci. 165, 463–470. DOI: 10.1016 / S0168-9452 (03) 00064-5
CrossRef Полный текст | Google Scholar
Выявление как инструмент для улучшения профилей ценных вторичных метаболитов и фармакологических свойств Hypericum perforatum | Журнал фармации и фармакологии
Аннотация
Objectives
В этом обзоре мы стремимся обновить имеющуюся информацию об улучшении Hypericum perforatum L.( Hypericaceae ) фитохимический профиль и фармакологические свойства через выявление .
Основные выводы
Hypericum perforatum проростки, побеги, корни, каллусы и суспензионные культуры клеток обрабатывали различными элиситорами, чтобы вызвать образование вторичных метаболитов. Экстракты обработанного элиситором растительного материала, содержащего нафтодиантроны, флороглюцинолы, ксантоны, флавоноиды и другие новые соединения, были количественно проанализированы и протестированы на их биоактивность.В то время как гиперицины в основном продуцировались в культурах H. perforatum , содержащих темные клубеньки, а именно на побегах и проростках, другие классы соединений, такие как ксантоны, флороглюцинолы и флавоноиды, образовывались во всех типах культур. Экстракты, полученные из образцов, обработанных элиситором, обычно обладали лучшей биоактивностью по сравнению с экстрактом контрольной биомассы.
Резюме
Хотя выявление — отличный инструмент для производства ценных вторичных метаболитов в H.perforatum , его использование все еще находится в зачаточном состоянии, главным образом из-за недостаточной воспроизводимости и трудностей с увеличением производства биомассы.
Введение
Hypericum perforatum L. ( Hypericaceae ), известный как зверобой, является важным лекарственным растением. Экстракты, настои и отвары издревле применялись при лечении различных недугов. Ряд фармакологических исследований и клинических испытаний показали, что H.perforatum обладают поразительным набором фармакологических свойств, включая антидепрессант, противовоспалительное, противовирусное, противоопухолевое и антибактериальное действие. В частности, экстракты H. perforatum столь же эффективны, как и их лекарственные аналоги, такие как флуоксетин (прозак), сертралин (золофт) и другие ведущие антидепрессанты при лечении депрессии. В настоящее время это широко используемое лекарственное растение для лечения легкой и умеренной депрессии, [1] прописано по этому показанию в некоторых странах ЕС, а в Соединенных Штатах продается в качестве растительной добавки без рецепта. [2]
Помимо эффективности при лечении неврологических расстройств, исследования показывают, что это растение может быть полезно при лечении рака, связанных с воспалением расстройств, а также бактериальных и вирусных заболеваний. [3–7] Эти лечебные свойства связаны с составом вторичных метаболитов, присутствующих в экстракте, особенно гиперицинов, гиперфоринов, флавоноидов, ксантонов и других ценных соединений. [8] Фитохимическая характеристика H.perforatum выявил присутствие различных классов соединений, включая нафтодиантроны (гиперицин и псевдогиперицин), пренилированные ацилфлороглюцинолы (гиперфорин и адгиперфорин), флавоноиды (кверцетин, гиперозид, рутин, катехин, соединения бигентоферкитрин, а также изоквиферкитрин). хлорогеновая кислота, дубильная кислота и кофейная кислота), ксантоны (1,3,6,7-тетрагидроксиксантон) и эфирное масло, богатое сесквитерпенами [9–11] (рис. 1).
Рисунок 1
Основные классы вторичных метаболитов, обнаруженные в Hypericum perforatum .
Рисунок 1
Основные классы вторичных метаболитов, обнаруженные в Hypericum perforatum .
В настоящее время H. perforatum является одним из самых продаваемых лекарственных средств на травах во всем мире. Из-за своей известной лекарственной ценности этот вид включен в фармакопеи нескольких стран, включая Европу и США. Согласно фармакопеям США и Европы, сырое лекарство состоит из высушенных цветущих верхушек или надземных частей растения. Чтобы удовлетворить постоянно растущие потребности фармацевтической промышленности и получить качественную биомассу, H.perforatum возделывается во многих странах. Растения, растущие в полевых условиях, обычно подвергаются биотическим и абиотическим воздействиям, которые могут повлиять на фитохимический состав. Например, растений H. perforatum , полученных из разных географических регионов, сезонов, почвенных условий, существенно различаются по своему фитохимическому профилю. [12–14] Поскольку фармакологический потенциал экстрактов H. perforatum в основном определяется его фитохимическим составом и соотношением между важными соединениями, такие изменения могут повлиять на лечебную эффективность экстрактов. [15,16] Культуры in vitro , выращенные в контролируемых условиях, могут преодолеть эти проблемы и стали привлекательной альтернативой полевому выращиванию. [17,18]
Сегодня увеличение содержания важных биологически активных молекул и производство новых соединений являются основными аспектами биотехнологии H. perforatum . Разработки систем культивирования клеток растений и молекулярной биологии предложили множество способов улучшения производства соединений, таких как отбор клеточных линий, иммобилизация клеток, пермеабилизация, кормление предшественниками, секреция продукта, биотрансформация, метаболическая инженерия, биореакторная инженерия, синтетическая биология и выявление. [19–21] Среди всего прочего, выявление является привлекательной стратегией для увеличения производства вторичных метаболитов у видов растений, таких как H. perforatum , в которых применение инструментов метаболической инженерии или синтетической биологии остается трудным из-за отсутствия умелые методы трансформации и генетическая информация о биосинтетических путях. [22] Следовательно, продукция вторичных метаболитов посредством выявления с использованием различных систем культивирования in vitro представляет большой интерес для H.perforatum исследование.
В последние годы в литературе накопилось значительное количество данных о манипулировании вторичным метаболизмом H. perforatum посредством выявления . Однако, насколько нам известно, консолидированный отчет или критический анализ этих опубликованных данных недоступны. Здесь мы комплексно рассматриваем доступную информацию о выявлении вторичного метаболизма H. perforatum , рассматриваем потенциальное применение наночастиц в качестве элиситоров и обсуждаем, как опосредованное выявлением улучшение H.perforatum профиль вторичных метаболитов может быть использован для открытия лекарств.
Основание для извлечения
Растения должны защищаться от любых угроз, исходящих от окружающей среды, таких как атака патогенов, травоядность, засуха, засоление, воздействие УФ-излучения. Растения воспринимают такие сигналы опасности через свои рецепторы и сенсоры и активируют защитные реакции, чтобы противодействовать этим стрессам. [23–26] Ответы включают вторичный метаболизм. [27] Например, растения распознают элиситоры, производные от патогенов, через рецепторы, связанные с плазматической мембраной, и активируют в качестве защитной реакции производство низкомолекулярных антимикробных соединений. В то время как эти фитоалексины синтезируются и накапливаются в растениях только после воздействия патогенных микробов, фитоантиципины либо уже существуют, либо синтезируются после микробной атаки исключительно из уже существующих компонентов растения. [28] Помимо их роли в защитной реакции растений, эти соединения часто обладают важными фармакологическими свойствами. [29,30] Способность растений противодействовать биотическим и абиотическим стрессам посредством мобилизации их вторичного метаболизма является центральной догмой выявления.
Элиситор может быть фактором окружающей среды или сигнальной молекулой, которая активирует каскад передачи сигнала, который опосредует экспрессию генов, связанных с биосинтезом вторичных метаболитов с биотехнологической точки зрения. Элиситоры в основном делятся на три категории в зависимости от их происхождения, а именно биологические, химические и физические триггеры.Биологические элиситоры — это в основном компоненты стенок микробных клеток (хитин, хитозан и глюканы) и углеводы, такие как поли- и олигосахариды, полученные из стенок растительных клеток (пектин, пектиновая кислота и целлюлоза). Поли- и олигосахариды являются наиболее изученными сигнальными молекулами для путей выявления, поскольку эти соединения могут эффективно индуцировать аналогичные защитные реакции растений на вторжение патогенов. [31] При выявлении в растении системно инициируется серия метаболических изменений, чтобы активировать врожденную иммунную систему растения [32,33] , а также подготовить растение к стрессовой нагрузке. [34] Кроме того, сигнальные соединения защиты растений, такие как салициловая кислота (SA), жасмоновая кислота (JA), метилжасмонат (MeJA) и оксид азота, которые опосредуют защитный ответ, также могут служить элиситорами и их способность вызывать вторичные метаболизм хорошо документирован. [8,35–39] Неорганические вещества, такие как тяжелые металлы, ионы металлов и оксиды металлов, могут действовать как химические элиситоры вторичного метаболизма растений. [40–42] Физические компоненты, такие как холодовой шок, УФ, озон, осмотический стресс и водный стресс, также вызывают ферментативную активность и вторичный метаболизм. [43]
Механизм выявления чрезвычайно сложен из-за тысяч взаимосвязанных событий. Кроме того, все эти события колеблются в зависимости от происхождения, специфичности и концентрации элиситоров, стадии цикла роста и потребления питательных веществ растениями, физико-химической среды взаимодействия и т. Д. Хотя трудно предложить универсальную модель механизма выявления, потока кальция. всплеск активных форм кислорода (ROS) и фосфорилирование митоген-активируемой протеинкиназы (MAPK) являются начальными событиями, запускаемыми в большинстве взаимодействий активатор-растительная клетка. [44] Более поздние события, такие как активация сигнальных путей и активация факторов транскрипции, приводящие к индукции вторичного метаболизма растений, также хорошо задокументированы. [45–47]
Распознавание сигнала опосредуется рецепторами и сайтами связывания элиситоров, присутствующими на плазматической мембране в ответ на элиситоры, которые активируют следующий каскад событий, таких как потоки ионов, взрыв Ca 2+ , закисление цитоплазмы , Всплеск АФК, активация НАДФН-оксидазы, активация G-белка и фосфорилирование MAPK. [31] Первоначальная реакция растения — это обмен ионами, например, выходы K + / Cl — и притоки Ca 2+ / H + , в ответ на элиситоры. Приток Ca 2+ считается наиболее важным событием из-за его разнообразного участия в физиологических и клеточных процессах. [48,49] Ca 2+ сигналы вырабатываются посредством конформационных изменений в различных Ca 2+ -связывающих белках, таких как кальмодулин, кальмодулиноподобные белки, кальций-зависимые киназы (CDPK) и фосфолипазы, а также через вторичные посредники, такие как инозитол-1,4,5-трифосфат (IP 3 ) и диацилглицерин (DAG). [50–52] Ca 2+ / Кальмодулин-опосредованные пути участвуют во многих физиологических реакциях растений на стимулы. CDPK играют разнообразную роль в нижестоящих сигнальных каскадах и фосфорилировании белков, чтобы координировать клеточные процессы, такие как регуляция окислительного взрыва, гормональная передача сигналов и экспрессия генов. [53] Генерация АФК является еще одним важным явлением в защитной реакции растений, как и действие НАДФН-оксидазы и других оксидаз в растительных клетках, и даже всплеск Ca 2+ также ответственен за образование АФК. [49,54,55] Исследования показали взаимосвязанную роль G-белков в стимуляции ионных каналов, фосфолипазы A, фосфолипазы C и фосфолипазы D, генерации ROS и гибели клеток у растений. [50,56,57] Активированный G-белок может стимулировать уровень цАМФ, IP 3 и DAG, который запускает киназы-мишени PKA и PKC. Эти индуцированные протеинкиназы вызывают фосфорилирование MAPK, что приводит к экспрессии генов, ведущей к ферментативным реакциям, которые, в свою очередь, перепрограммируют путь продукции вторичных метаболитов [58] (Рисунок 2).
Рисунок 2
Молекулярный механизм выявления: Распознавание элиситоров рецепторами, связанными с плазматической мембраной, приводит к потокам ионов, выбросу Ca 2+ , подкислению цитоплазмы, выбросу ROS, активации НАДФН-оксидазы, активации G-белка и активации митогена фосфорилирование протеинкиназы. Он также активирует посредников нижестоящих сигнальных путей, таких как салициловая кислота, жасмоновая кислота и метилжасмонат. Посланники активируют факторы транскрипции и экспрессию генов, что приводит к перепрограммированию вторичного метаболизма.
Рисунок 2
Молекулярный механизм выявления: Распознавание элиситоров рецепторами, связанными с плазматической мембраной, приводит к ионным потокам, выбросу Ca 2+ , подкислению цитоплазмы, выбросу ROS, активации НАДФН-оксидазы, активации G-белка и митогену. фосфорилирование активированной протеинкиназы. Он также активирует посредников нижестоящих сигнальных путей, таких как салициловая кислота, жасмоновая кислота и метилжасмонат. Посланники активируют факторы транскрипции и экспрессию генов, что приводит к перепрограммированию вторичного метаболизма.
Манипуляции с
Hypericum perforatum Вторичный метаболизм Через ВыявлениеВ общем, тип культуры, а не тип элиситора определяет соединения, индуцированные в H. perforatum при выявлении. Гиперицины являются наиболее часто вызываемыми элиситорами соединениями в проростках и культурах побегов, вероятно, из-за присутствия клубеньков гиперицина. С другой стороны, клеточные суспензии, каллусы и корневые культуры в основном образуют флавоноиды и ксантоны.
В дополнение к типу культуры, на успех выявления влияет несколько других факторов, которые включают тип элиситора, концентрацию, условия инкубации и продолжительность обработки элиситором. Различные биотические и абиотические элиситоры, испытанные для воздействия на вторичный метаболизм H. perforatum , сгруппированы на фиг.3. Важные соединения, индуцируемые этими элиситорами в различных типах культур H. perforatum , таких как проростки, побеги, корни, каллусы и др. клеточные суспензии перечислены в таблице 1.
Рисунок 3
Элиситоры биотического и абиотического происхождения, испытанные на индукцию вторичных метаболитов в Hypericum perforatum .
Рисунок 3
Элиситоры биотического и абиотического происхождения, испытанные на индукцию вторичных метаболитов в Hypericum perforatum .
Таблица 1Различные типы культур Hypericum perforatum и элиситоров, используемых для индукции вторичных метаболитов
| Тип культуры . | Elicitor . | Выявленные соединения . | ссылку . | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Клеточная суспензия | Нанооксид цинка | Гиперицин и гиперфорин | [41] | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Нанооксид железа | Гиперицин и гиперфорин | [41] | 194[41] | 195 Ch , флавонолы, флаванолы, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин[66] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Пектин | Фенольные соединения, флавонолы, флаванолы, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | флавонол | , антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | [66] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phytophthora cinnamoni экстракт клеточной стенки гриба | Отсутствует | [39] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
eciltoorisium e e e e e MyColloosporidium| Асперг иллю Flavus мицелий экстракт | фенольные соединения, флавонолы, флавонолы, антоцианы и hypericins | [62] | Fusarium oxysporum | фенолы, флавоноиды, антоцианы, гиперицин и pseudohypericin | [63] | Phoma exigua | Фенолы, флавоноиды, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | [63] | Botrytis cinerea | 9195 9195 9195 9195 9195 9195 9195 | 9195 9195 9195 | 9199 9194 9195 9199 9194 9195 | Гиперицины | [39] | JA | Фенольные соединения, флаванолы, флавонолы, гиперицин и псевдогиперицин | [38] | MeJA | MeJA | Флавоны | Флавоны 9 | [8] | Ксантоны | [85] | SA | Нет | [35] | SA | Нет | [39] | [39] | [39] | SAudo | ] | SA | Флавоноиды | [8] | MeJA + C.gloeosporioides | Ксантоны | [35] | SA + C. gloeosporioides | Ксантоны | [35] | | 199 Agrobacterium | A. tumefaciens | Лигнин и флаваноиды | [72] | A. tumefaciens | Фенольные соединения, флавонолы, флаванолы и ксантоны | [73]4 A.rhizogenes | Фенолы, флавонолы, флаванолы и ксантоны | [73] | Каллус | SA | Гиперицины, псевдогиперицины | [86] | [86] | 5 [86] [86] | 9 Гиперицин | IBA | Гиперицин | [84] | Уксусная кислота | Ксантоны | [91] | Хитозан | Ксантоны | [68] | Стрельба | SA | Гиперицины и псевдогиперицины | [86] | Маннан | Псевдогиперицин и гиперицин | 3-глюкан | Псевдогиперицин | [59] | Пектин | Псевдогиперицин | [59] | Дрожжевой экстракт | Отсутствует | [59] | Гиперицин и псевдогиперицин | [64] | Декстран | Гиперицин и псевдогиперицин | [64] | 199 | 195 | 9 | 9 | 9 | 9 + PEG | Гиперицин и гиперфорин | [69] | Сахароза + MeJA | Гиперицин и гиперфорин | [69] | 957 A.tumefaciens | Гиперицин и гиперфорин | [69] | + Stenotrophomonas maltophilia культурального фильтрата | Pseudohypericin | [70] | саженца | Chromium | Protopseudohypericin, гиперицин и pseudohypericin | [ 40] | Никель | Нет | [12] | Ризофаг внутри лучезапястного канала | Гиперицин и псевдогиперицин | 60194 | 195 | 4maltophilia | Гиперицин и псевдогиперицин | [70] | |
| Тип культуры . | Elicitor . | Выявленные соединения . | ссылку . | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Клеточная суспензия | Нанооксид цинка | Гиперицин и гиперфорин | [41] | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Нанооксид железа | Гиперицин и гиперфорин | [41] | 194[41] | 195 Ch , флавонолы, флаванолы, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин[66] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Пектин | Фенольные соединения, флавонолы, флаванолы, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | флавонол | , антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | [66] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phytophthora cinnamoni экстракт клеточной стенки гриба | Отсутствует | [39] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
eciltoorisium e e e e e MyColloosporidium| Асперг иллю Flavus мицелий экстракт | фенольные соединения, флавонолы, флавонолы, антоцианы и hypericins | [62] | Fusarium oxysporum | фенолы, флавоноиды, антоцианы, гиперицин и pseudohypericin | [63] | Phoma exigua | Фенолы, флавоноиды, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | [63] | Botrytis cinerea | 9195 9195 9195 9195 9195 9195 9195 | 9195 9195 9195 | 9199 9194 9195 9199 9194 9195 | Гиперицины | [39] | JA | Фенольные соединения, флаванолы, флавонолы, гиперицин и псевдогиперицин | [38] | MeJA | MeJA | Флавоны | Флавоны 9 | [8] | Ксантоны | [85] | SA | Нет | [35] | SA | Нет | [39] | [39] | [39] | SAudo | ] | SA | Флавоноиды | [8] | MeJA + C.gloeosporioides | Ксантоны | [35] | SA + C. gloeosporioides | Ксантоны | [35] | | 199 Agrobacterium | A. tumefaciens | Лигнин и флаваноиды | [72] | A. tumefaciens | Фенольные соединения, флавонолы, флаванолы и ксантоны | [73]4 A.rhizogenes | Фенолы, флавонолы, флаванолы и ксантоны | [73] | Каллус | SA | Гиперицины, псевдогиперицины | [86] | [86] | 5 [86] [86] | 9 Гиперицин | IBA | Гиперицин | [84] | Уксусная кислота | Ксантоны | [91] | Хитозан | Ксантоны | [68] | Стрельба | SA | Гиперицины и псевдогиперицины | [86] | Маннан | Псевдогиперицин и гиперицин | 3-глюкан | Псевдогиперицин | [59] | Пектин | Псевдогиперицин | [59] | Дрожжевой экстракт | Отсутствует | [59] | Гиперицин и псевдогиперицин | [64] | Декстран | Гиперицин и псевдогиперицин | [64] | 199 | 195 | 9 | 9 | 9 | 9 + PEG | Гиперицин и гиперфорин | [69] | Сахароза + MeJA | Гиперицин и гиперфорин | [69] | 957 A.tumefaciens | Гиперицин и гиперфорин | [69] | + Stenotrophomonas maltophilia культурального фильтрата | Pseudohypericin | [70] | саженца | Chromium | Protopseudohypericin, гиперицин и pseudohypericin | [ 40] | Никель | Нет | [12] | Ризофаг внутри лучезапястного канала | Гиперицин и псевдогиперицин | 60194 | 195 | 4maltophilia | Гиперицин и псевдогиперицин | [70] | |
Различные типы Hypericum perforatum культур и элиситоров, используемых для индукции вторичных метаболитов
| Тип культуры . | Elicitor . | Выявленные соединения . | ссылку . | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Клеточная суспензия | Нанооксид цинка | Гиперицин и гиперфорин | [41] | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Нанооксид железа | Гиперицин и гиперфорин | [41] | 194[41] | 195 Ch , флавонолы, флаванолы, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин[66] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Пектин | Фенольные соединения, флавонолы, флаванолы, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | флавонол | , антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | [66] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phytophthora cinnamoni экстракт клеточной стенки гриба | Отсутствует | [39] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
eciltoorisium e e e e e MyColloosporidium| Асперг иллю Flavus мицелий экстракт | фенольные соединения, флавонолы, флавонолы, антоцианы и hypericins | [62] | Fusarium oxysporum | фенолы, флавоноиды, антоцианы, гиперицин и pseudohypericin | [63] | Phoma exigua | Фенолы, флавоноиды, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | [63] | Botrytis cinerea | 9195 9195 9195 9195 9195 9195 9195 | 9195 9195 9195 | 9199 9194 9195 9199 9194 9195 | Гиперицины | [39] | JA | Фенольные соединения, флаванолы, флавонолы, гиперицин и псевдогиперицин | [38] | MeJA | MeJA | Флавоны | Флавоны 9 | [8] | Ксантоны | [85] | SA | Нет | [35] | SA | Нет | [39] | [39] | [39] | SAudo | ] | SA | Флавоноиды | [8] | MeJA + C.gloeosporioides | Ксантоны | [35] | SA + C. gloeosporioides | Ксантоны | [35] | | 199 Agrobacterium | A. tumefaciens | Лигнин и флаваноиды | [72] | A. tumefaciens | Фенольные соединения, флавонолы, флаванолы и ксантоны | [73]4 A.rhizogenes | Фенолы, флавонолы, флаванолы и ксантоны | [73] | Каллус | SA | Гиперицины, псевдогиперицины | [86] | [86] | 5 [86] [86] | 9 Гиперицин | IBA | Гиперицин | [84] | Уксусная кислота | Ксантоны | [91] | Хитозан | Ксантоны | [68] | Стрельба | SA | Гиперицины и псевдогиперицины | [86] | Маннан | Псевдогиперицин и гиперицин | 3-глюкан | Псевдогиперицин | [59] | Пектин | Псевдогиперицин | [59] | Дрожжевой экстракт | Отсутствует | [59] | Гиперицин и псевдогиперицин | [64] | Декстран | Гиперицин и псевдогиперицин | [64] | 199 | 195 | 9 | 9 | 9 | 9 + PEG | Гиперицин и гиперфорин | [69] | Сахароза + MeJA | Гиперицин и гиперфорин | [69] | 957 A.tumefaciens | Гиперицин и гиперфорин | [69] | + Stenotrophomonas maltophilia культурального фильтрата | Pseudohypericin | [70] | саженца | Chromium | Protopseudohypericin, гиперицин и pseudohypericin | [ 40] | Никель | Нет | [12] | Ризофаг внутри лучезапястного канала | Гиперицин и псевдогиперицин | 60194 | 195 | 4maltophilia | Гиперицин и псевдогиперицин | [70] | |
| Тип культуры . | Elicitor . | Выявленные соединения . | ссылку . | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Клеточная суспензия | Нанооксид цинка | Гиперицин и гиперфорин | [41] | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Нанооксид железа | Гиперицин и гиперфорин | [41] | 194[41] | 195 Ch , флавонолы, флаванолы, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин[66] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Пектин | Фенольные соединения, флавонолы, флаванолы, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | флавонол | , антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | [66] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Phytophthora cinnamoni экстракт клеточной стенки гриба | Отсутствует | [39] | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
eciltoorisium e e e e e MyColloosporidium| Асперг иллю Flavus мицелий экстракт | фенольные соединения, флавонолы, флавонолы, антоцианы и hypericins | [62] | Fusarium oxysporum | фенолы, флавоноиды, антоцианы, гиперицин и pseudohypericin | [63] | Phoma exigua | Фенолы, флавоноиды, антоцианы, гиперицин и псевдогиперицин | [63] | Botrytis cinerea | 9195 9195 9195 9195 9195 9195 9195 | 9195 9195 9195 | 9199 9194 9195 9199 9194 9195 | Гиперицины | [39] | JA | Фенольные соединения, флаванолы, флавонолы, гиперицин и псевдогиперицин | [38] | MeJA | MeJA | Флавоны | Флавоны 9 | [8] | Ксантоны | [85] | SA | Нет | [35] | SA | Нет | [39] | [39] | [39] | SAudo | ] | SA | Флавоноиды | [8] | MeJA + C.gloeosporioides | Ксантоны | [35] | SA + C. gloeosporioides | Ксантоны | [35] | | 199 Agrobacterium | A. tumefaciens | Лигнин и флаваноиды | [72] | A. tumefaciens | Фенольные соединения, флавонолы, флаванолы и ксантоны | [73]4 A.rhizogenes | Фенолы, флавонолы, флаванолы и ксантоны | [73] | Каллус | SA | Гиперицины, псевдогиперицины | [86] | [86] | 5 [86] [86] | 9 Гиперицин | IBA | Гиперицин | [84] | Уксусная кислота | Ксантоны | [91] | Хитозан | Ксантоны | [68] | Стрельба | SA | Гиперицины и псевдогиперицины | [86] | Маннан | Псевдогиперицин и гиперицин | 3-глюкан | Псевдогиперицин | [59] | Пектин | Псевдогиперицин | [59] | Дрожжевой экстракт | Отсутствует | [59] | Гиперицин и псевдогиперицин | [64] | Декстран | Гиперицин и псевдогиперицин | [64] | 199 | 195 | 9 | 9 | 9 | 9 + PEG | Гиперицин и гиперфорин | [69] | Сахароза + MeJA | Гиперицин и гиперфорин | [69] | 957 A.tumefaciens | Гиперицин и гиперфорин | [69] | + Stenotrophomonas maltophilia культурального фильтрата | Pseudohypericin | [70] | саженца | Chromium | Protopseudohypericin, гиперицин и pseudohypericin | [ 40] | Никель | Нет | [12] | Ризофаг внутри лучезапястного канала | Гиперицин и псевдогиперицин | 60194 | 195 | 4maltophilia | Гиперицин и псевдогиперицин | [70] | |
Биотическое выявление
Грибы и экстракты мицелия грибов
В культурах побегов H. perforatum дрожжевой экстракт не оказывал стимулирующего действия на продукцию гиперицина или псевдогиперицина. [59] Виды арбускулярных микоризных грибов (AMF) Rhizophagus intraradices усилили H.perforatum рост проростков и производство гиперицина и псевдогиперицина при внесении в почву отдельно или в смеси с AMF, а именно Funneliformis constrictum, F. geosporum и F. mosseae . [60]
Hypericum perforatum суспензионные культуры клеток, обработанные экстрактом клеточной стенки Colletotrichum gloeosporioides , показали значительное увеличение накопления ксантона. [35] Интересно, что это накопление ксантона увеличивалось в 12 раз, когда культуры были примированы MeJA или SA перед добавлением экстракта грибов. Aspergillus niger , Fussarium oxysporum и дрожжевые экстракты увеличивали накопление фенольных соединений и флавоноидов в дополнение к продукции новых компонентов, таких как p -гидроксибензойная кислота, во взвешенных клетках H. triquetrifolium . [61] С другой стороны, экстракт мицелия из Aspergillus flavus только стимулировал уровень антоцианов в суспензиях клеток H. perforatum . [62]
Интересно, что экстракты клеточной стенки из F.oxysporum , Phomaexigua и Botrytis cinerea показали быструю стимуляцию нафтодиантронов (гиперицин и псевдогиперицин) в дополнение к флавоноидам и антоцианинам в суспензионных культурах клеток H. perforatum . [63] Клеточные стенки A. niger индуцировали биосинтез гиперицина в суспензионных культурах клеток H. perforatum . [36]
Полисахариды
Олигосахариды и полисахариды, соответственно, из клеточных стенок грибов и растений являются наиболее изученными сигнальными молекулами в путях выявления. [31] В культурах побегов H. perforatum , маннан, β -1,3-глюкан, пектин и дрожжевой экстракт были изучены для получения нафтодиантронов. [59] Хотя маннан существенно стимулировал выработку псевдогиперицина и гиперицина, β -1,3-глюкан и пектин показали слабый эффект на продукцию псевдогиперицина, но не оказали влияния на продукцию гиперицина. В то время как пектин и декстран увеличивали содержание псевдогиперицина и гиперицина, хитин не проявлял никакого стимулирующего эффекта у H.perforatum побеговых культур. [64] Маннан и пектин были протестированы на биосинтез гиперицинов в проростках H. adenotrichum , выращенных in vitro . [65] Хотя оба элиситора стимулировали биосинтез псевдогиперицина и гиперицина, стимулирующий потенциал маннана был ниже, чем у пектина.
Обработка хитином, пектином и декстраном улучшила продукцию фенилпропаноидов (фенольных соединений, флаванолов, антоцианов) в культурах клеточных суспензий. [66] Brasili et al. [67,68] изучали влияние обработки хитозаном на культурах придаточных корней H. perforatum . Хитозан увеличивал синтез эпикатехина, ксантонов и изопреноидов [68] , а новый ксантон, бразиликсантон B, был идентифицирован в обработанных корневых культурах. [67]
Бактерии
Выявление культур побегов H. perforatum комбинацией сахарозы и инактивированной Agrobacterium tumefaciens способствовало продукции гиперицина и гиперфорина. [69] Обработка проростков H. perforatum Stenotrophomonas maltophilia повысила содержание гиперицина и псевдогиперицина. [70] Эти авторы также сообщили, что обработка культур побегов H. perforatum фильтратом культуры S. maltophilia индуцировала только продукцию псевдогиперицина. [70]
Анализ метанольного экстракта культур клеточных суспензий, обработанных A. tumefaciens , выявил 12-кратное увеличение общей концентрации ксантона и появление многих новых ксантонов. [71] Кроме того, содержание лигнина и флавоноидов (кверцетин, кверцетрин и т. Д.) Также значительно увеличилось во фракции фенольных соединений клеточной стенки после выявления A. tumefaciens . [72] Аналогичным образом, улучшение концентраций фенола, флавонола, флаванола и ксантона в ответ на обработку A. tumefaciens и A. rhizogenes наблюдали в культурах клеточной суспензии. [73] Однако A. rhizogenes был менее эффективен в индукции вторичного метаболизма по сравнению с A.tumefaciens . [73] Индукция вторичного метаболизма растений H. perforatum с помощью Agrobacterium может быть связана с такими компонентами, как белок холодового шока, флагеллин, пептидогликан и фактор удлинения Tu. [74–80]
Сигнальные соединения и регуляторы роста растений
Было показано, что сигнальные соединения защиты растений, такие как SA, MeJA, JA, модулируют вторичный метаболизм H. perforatum .При обработке аналогом MeJA, 2,3-дигидроксипропилжасмонатом, продукция гиперицинов и гиперфорина увеличивалась в культурах побегов H. perforatum и H. sampsonii . [81] Различные комбинации регуляторов роста растений и сигнальных соединений (JA и SA) усиливали накопление гиперицинов, псевдогиперицина и гиперфорина в культурах побегов H. hirsutum и H. maculatum . [82] Добавление регуляторов роста растений в культуральную среду по-разному влияло на накопление нафтодиантрона в культурах побегов. [83] В этом исследовании сообщается, что присутствие IBA фактически снижает концентрацию гиперицина и псевдогиперицина, хотя добавка ИУК не влияет на выработку нафтодиантрона в проростках.
Концентрация MeJA показала отрицательную корреляцию с производством биомассы и положительную корреляцию с производством гиперицина в культурах придаточных корней, выращенных в биореакторах с воздушным подъемником баллонного типа, в которых оптимальное содержание гиперицина 1,61 мг / г DW было достигнуто при 350 мкм MeJA. [84]
Влияние сигнальных соединений на индукцию вторичного метаболизма в клеточных суспензионных культурах H. perforatum различается между группами. Conceicao и др. . [35] сообщил, что обработанные MeJA культуры суспензий клеток H. perforatum накапливали новые флавоноиды (флавоны), тогда как SA не могла вызвать какие-либо изменения вторичного метаболизма. Выделение культур клеток с помощью 100 мкмоль / л MeJA на 15 день дало 2.Производство флавоноидов в 7 раз выше (280 мг / л) по сравнению с контрольными культурами. [8] Другое исследование показало, что лечение JA значительно увеличивало количество фенольных соединений, флаванолов и флавонолов, одновременно снижая содержание антоцианов. [38] Двукратное увеличение содержания ксантона, каденсина G и паксантона было обнаружено в суспензионных культурах клеток H. perforatum после выявления с помощью SA. [85]
Уокер и др. . [39] обнаружили, что JA резко увеличивает продукцию гиперицина в клеточных культурах, инкубированных в темноте, по сравнению с культурами, выращенными в фотопериодических условиях, хотя обработка SA не может индуцировать продукцию гиперицина в клеточных суспензиях.Напротив, SA заметно влияла на продукцию гиперицина и псевдогиперицина в суспензионных культурах клеток H. perforatum , согласно отчету Gadzovska-Simic et al . [86]
Абиотическое выявление
Физические факторы
Несколько физических факторов, таких как воздействие высокой интенсивности света, озона, ультрафиолетового излучения и осмотического стресса, были проверены на индукцию вторичного метаболизма у H.perforatum . Концентрации гиперфорина, псевдогиперицина и гиперицина были изменены у растений H. perforatum после воздействия УФ-В во время вегетативного роста. [87] Однако уровень и продолжительность УФ-В-излучения отрицательно повлияли на концентрацию гиперицина в листьях, хотя содержание флавоноидов и танинов увеличивалось с увеличением уровней УФ-В-излучения. [88] Обработка полиэтиленгликолем (ПЭГ) увеличивала концентрации гиперицина и псевдогиперицина в культивируемых H.adenotrichum саженцы. Однако это увеличение зависело от концентрации ПЭГ и периода лечения, оптимальным является 10 г / л ПЭГ для 15-дневного лечения. [89] С другой стороны, синтез гиперицина и гиперфорина в культурах побегов H. perforatum не увеличивался в присутствии 10 и 15 г / л ПЭГ, хотя более низкая концентрация ПЭГ стимулировала продукцию этих соединений. [69] Было показано, что сахароза как осмотический агент стимулирует гиперицины в культивируемых проростках H.adenotrichum с увеличением концентрации до 45 г / л с последующим снижением. [89] Соответственно, присутствие сахарозы (10–30 г / л) влияло на продукцию гиперицина и гиперфорина в культурах побегов H. perforatum и комбинации ПЭГ (1,25–5 г / л) и сахарозы ( 10–30 г / л) синергетически увеличивали продукцию вышеуказанных соединений. [69]
В суспензионных культурах клеток Hypericum perforatum накапливались антоцианы и флавоноиды с одновременным снижением ксантонов при увеличении освещенности культур с 20 мкмоль / с на м 2 до 60 мкмоль / с на м 2 . [90] Воздействие озона стимулировало синтез гиперицина в суспензионных культурах клеток H. perforatum , причем культуры клеток в экспоненциальной фазе были более чувствительными, чем культуры в лаговой и стационарной фазах. [91]
Химическая промышленность
Обработка хромом индуцировала продукцию протопсевдогиперицина, гиперицина и псевдогиперицина в проростках H. perforatum , тогда как обработка никелем не оказывала стимулирующего эффекта. [40] В культурах корня H. perforatum уксусная кислота увеличивала выработку ксантона. [91]
Обработка суспензионных культур клеток H. perforarum 100 частями на миллиард нанооксидов цинка и железа способствовала выработке гиперицина и гиперфорина, в то время как более высокие концентрации этих наноматериалов отрицательно влияли на продукцию этих соединений. [41]
Фармакологические свойства
Hypericum perforatum после выявленияХотя в ряде исследований сообщается об индуцированной элиситором модуляции фитохимического профиля H.perforatum in vitro культур, только некоторые из них действительно тестировали биоактивность обработанных культур. Метанольный экстракт суспензионных культур клеток H. perforatum , зараженных A. tumefaciens , исследовали на различную биоактивность. Этот экстракт показал более высокий антиоксидантный потенциал, большую способность предотвращать перекисное окисление липидов синаптосом [71] и улучшенную антимикробную активность против нескольких патогенных бактерий человека. [92] Он также предлагал человеческим клеткам HepG2 большую защиту от окислительного повреждения, вызванного t-BOOH, по сравнению с контрольным экстрактом. [93] Tocci et al. . [94] показали, что экстракты корневой ткани, вызванные хитозаном, O -карбоксиметилхитозаном и его производными, показали противогрибковую активность против грибковых патогенов человека, таких как Candida spp., Cryptococcus neoformans и дерматофитов.
Перспективы на будущее
Возможное применение нанотехнологий
В дополнение к нескольким хорошо известным биотическим и абиотическим элиситорам, рассмотренным выше, наночастицы в настоящее время появляются как новый класс элиситоров.Несколько исследований индукции вторичных метаболитов в ответ на обработку наночастицами дают представление об использовании этих частиц субмикронного размера в качестве элиситоров вторичных метаболитов. Например, содержание артемизинина увеличивалось в культуре волосистых корней Artemisia annua после обработки наночастицами серебра ядро-оболочка. [95] В Calendula officinalis содержание антоцианов и флавоноидов было снижено, тогда как содержание каротиноидов и сапонинов увеличивалось в ответ на воздействие наночастиц серебра, как показали классические колориметрические анализы. [96] Кроме того, многослойные углеродные нанотрубки стимулировали биосинтез вторичных метаболитов и антиоксидантную способность лекарственного растения Satureja khuzestanica , выращенного in vitro . [97] В случае H. perforatum одно исследование показало, что нанооксиды цинка и железа стимулируют выработку гиперицина и гиперфорина в культурах клеточной суспензии. [41]
Помимо использования металлических наночастиц в качестве элиситоров, сигнальные соединения, такие как JA, SA и MeJA, могут быть инкапсулированы в биоразлагаемые полимеры в виде наночастиц и могут использоваться для замедленного высвобождения сигнальных молекул в культуральную среду. , что может быть полезно для устойчивого производства вторичных метаболитов, не влияя на рост культур.Возможность использования металлических наночастиц в качестве уловителей вторичных метаболитов растений была продемонстрирована на примере A. thaliana . [98] Авторы сообщили, что наночастицы анатаза TiO 2 (меньше 20 нм) проникают в клетки растений, конъюгируют флавоноиды с богатыми эндиолами и катехиновыми группами in situ и покидают клетки растений в виде конъюгатов флавоноид-наночастица. Адсорбционная способность наночастиц может быть дополнительно улучшена за счет функционализации.Например, адсорбционная способность наночастиц SiO 2 по отношению к кверцетину может быть улучшена за счет функционализации TiO 2 по сравнению с нефункционализированными и функционализированными децильными группами наночастицами SiO 2 из-за возможного связывания кверцетина с оксидом металла. [99] Эта адсорбционная способность линейно возрастает с увеличением покрытия поверхности TiO 2 , подчеркивая корреляцию между функциональной поверхностью и адсорбцией кверцетина. Это явление может предоставить нам привлекательную возможность для разработки стратегий нанозахвата для широкого спектра вторичных метаболитов в ближайшем будущем.
Выявление вторичного метаболизма
Hypericum perforatum : путь к открытию лекарствХотя манипуляции с вторичным метаболизмом H. perforatum посредством выявления сообщалось в многочисленных исследованиях, очень немногие авторы фактически тестировали фармакологические свойства индуцированных соединений и экстрактов из обработанных клеток. [92–94] Для содействия открытию новых лекарств экстракты из обработанных элиситором клеток, содержащие новые соединения, должны быть проанализированы и скринингованы на предмет разнообразной биоактивности.Можно использовать фракционирование по биологической активности. Возможный путь к открытию лекарств после обнаружения резюмирован на следующем рисунке 4.
Рисунок 4
Схема возможного использования опосредованных выявлением изменений в профиле вторичного метаболита Hypericum perforatum для открытия лекарств посредством фракционирования по биологической активности.
Рисунок 4
Схема возможного использования опосредованных выявлением изменений в профиле вторичного метаболита Hypericum perforatum для открытия лекарств через фракционирование по биологической активности .
Несмотря на захватывающую возможность индуцирования различных классов биоактивных соединений в культурах клеток и тканей H. perforatum посредством обнаружения , промышленное использование основанных на выявлении изменений вторичного метаболизма и фармакологических свойств все еще находится в зачаточном состоянии. Производство значительных количеств асептической биомассы для выявления является основной проблемой. В этом контексте сообщалось о небольших биореакторах для культур in vitro для производства активных соединений. [18] Недавно были разработаны дополнительные корневые культуры в крупномасштабных биореакторах для производства фитохимикатов H. perforatum . [84,100] Выбор правильных культуральных сосудов и определение экзогенных сигналов, необходимых для производства биомассы in vitro , а также оптимизация мер выявления являются важными факторами для дальнейшего прогресса в этой области.
Заключение
На основании анализа литературы видно, что проростки и in vitro культур H.perforatum — эффективные системы для производства широкого спектра биоактивных вторичных метаболитов посредством выявления . Парадоксальные результаты, полученные между группами с точки зрения фитохимического профиля, а именно продукции гиперицина после выявления, свидетельствуют о сложности методов поддержания культуры, выявления и анализа. Например, в нормальных условиях гиперицин вырабатывается только при наличии темных узелков гиперицина. Несколько исследований подтвердили четкую положительную корреляцию между наличием кластеров темных клеток и накоплением гиперицина независимо от ткани, генотипа, вида и т. Д. [101–104] В корнях растений H. perforatum отсутствуют эти кластеры, в которых не было обнаружено следов гиперицина. [105] Несмотря на отсутствие этих клубеньков в корнях и суспензионных культурах клеток H. perforatum , несколько групп действительно сообщили об образовании гиперицинов в этих культурах после выявления. [38,39,41,63,66,84,86] Дальнейшее исследование способности культур клеток и тканей H. perforatum без этих темных кластеров клеток продуцировать гиперицин может дать новые ключи к разгадке пути биосинтеза гиперицина.
Поскольку потенциал выявления вторичных метаболитов варьируется в зависимости от типа культур, элиситоров, условий лечения и других параметров, необходимы дальнейшие исследования для оптимизации лучших и воспроизводимых протоколов. В этом контексте понимание метаболических путей, ведущих к производству конкретных вторичных метаболитов и их регуляции, является обязательным. Однако, за исключением флавоноидного пути, сложные биосинтетические пути специфически эволюционировали у Hypericum spp.далеки от понимания. Отсутствие соответствующей информации об участвующих ферментах и генах, а также о факторах транскрипции и главных переключателях, контролирующих эти пути, является основным препятствием для разработки эффективных стратегий для активации вторичного метаболизма H. perforatum . Ожидается, что сравнительные транскриптомные, метаболомные и протеомные исследования, проведенные как на контрольных, так и на обработанных элиситором культурах, дадут важные подсказки.
Заявления
Благодарности
Эта работа получила финансирование от Национального научного центра Польши (2016/21 / B / NZ9 / 01980).PS и GF поддерживаются 7-й рамочной программой Европейского Союза по исследованиям, технологическим разработкам и демонстрациям в соответствии с соглашением о гранте № 621321 и софинансируются за счет средств, выделенных на образование в рамках проекта № W26 / 7.PR / 2015 [GA 3413 / 7.PR / 2015/2] на 2015–2019 годы.
Список литературы
Oliveira
AI
et al.Нейропротекторная активность Hypericum perforatum и его основных компонентов
.Фасадный завод Sci
2016
;7
:1004
.Шелтон
RC
.Зверобой ( Hypericum perforatum ) при большой депрессии
.J Clin Psychiatry
2009
;70
(Доп. 5
):23
—27
.Franchi
GG
et al.Состав и антиоксидантная активность in vitro зверобоя ( Hypericum perforatum L.) извлекает
.J Med Plants Res
2011
;5
:4349
—4353
.Klemow
KM
et al.11 Медицинские характеристики зверобоя (Hypericum perforatum)
. Лестер Пакер, доктор философии.2011
:211
.Silva
BA
et al.Фитохимическая и антиоксидантная характеристика Hypericum perforatum спиртовых экстрактов
.Food Chem
2005
;90
:157
–167
.Silva
BA
et al.Экстракты зверобоя ( Hypericum perforatum ) и изолированные фенольные соединения являются эффективными антиоксидантами в нескольких моделях окислительного стресса in vitro.
.Food Chem
2008
;110
:611
—619
.Olivo
M
et al.Новые рубежи в опосредованной гиперицином диагностике рака с современными оптическими технологиями
.Энн Биомед Энг
2012
;40
:460
—473
.Wang
J
et al.Повышенная продукция флавоноидов за счет выявления метилжасмоната в культуре клеточной суспензии Hypericum perforatum
.Биоресур Биопроцесс
2015
;2
:1
—9
.Тацис
EC
et al.Идентификация основных компонентов Hypericum perforatum методами ЖХ / ТФЭ / ЯМР и / или ЖХ / МС
.Фитохимия
2007
;68
:383
—393
.Guedes
AP
et al.Hypericum sp .: состав эфирных масел и биологическая активность
.Phytochem Ред.
2012
;11
:127
—152
.Бруни
R
,Sacchetti
G
.Факторы, влияющие на биосинтез полифенолов у дикорастущего и полевого зверобоя.Зверобой ( Hypericum perforatum L. Hypericaceae / Guttiferae)
.Молекулы
2009
;14
:682
—725
.Murch
SJ
et al.Загрязнение никелем влияет на рост и состав вторичных метаболитов зверобоя ( Hypericum perforatum L.)
.Environ Exp Bot
2003
;49
:251
–257
.Бруни
R
et al.Качество растительного лекарственного средства и фитохимический состав Hypericum perforatum L., пораженный инфекцией фитоплазмы пепельно-желтого цвета
.J Agric Food Chem
2005
;53
:964
—968
.Саутвелл
IA
,Бурк
CA
.Сезонные колебания содержания гиперицина в Hypericum perforatum L. (зверобой)
.Фитохимия
2001
;56
:437
—441
.Marrelli
M
et al.Hypericum perforatum : влияние среды обитания на химический состав, фотоиндуцированную цитотоксичность и антирадикальную активность
.Фарм Биол
2014
;52
:909
—918
.Божин
B
et al.Влияние происхождения и биологического источника на химический состав, антихолинэстеразные и антиоксидантные свойства некоторых видов зверобоя.Вид зверобоя ( Hypericum spp., Hypericaceae) из Центральных Балкан
.Молекулы
2013
;18
:11733
—11750
.Murch
SJ
,Saxena
PK
.Зверобой ( Hypericum perforatum L.): проблемы и стратегии производства химически устойчивых растений
.Can J Plant Sci
2006
;86
:765
—771
.Зобайед
SMA
et al.Производство in vitro и химическая характеристика зверобоя ( Hypericum perforatum L. cv ‘New Stem’)
.Plant Sci
2004
;166
:333
—340
.Рао
SR
,Равишанкар
G
.Культуры растительных клеток: химические заводы вторичных метаболитов
.Biotechnol Adv
2002
;20
:101
–153
.Уилсон
SA
,Робертс
SC
.Последние достижения в области разработки и коммерциализации процессов культивирования растительных клеток для синтеза биомолекул
.Завод Биотехнология J
2012
;10
:249
—268
.Trosset
J-Y
,Carbonell
P
.Синтетическая биология для открытия фармацевтических препаратов
.Drug Des Devel Ther
2015
;9
:6285
.Hou
W
et al.Перспектива генетической трансформации Hypericum perforatum
.Фасадный завод Sci
2016
;7
:879
.Ульм
R
,Дженкинс
GI
.Вопросы и ответы: как растения чувствуют УФ-В излучение и реагируют на него?
BMC Biol
2015
;13
:45
.Wu
L
et al.Убейте: как растения задействуют эффекторный иммунитет для борьбы с патогенами
.Вирулентность
2014
;5
:710
—721
.Wu
J
,Болдуин
IT
.Новые сведения о реакции растений на нападение насекомых-травоядных
.Annu Rev Genet
2010
;44
:1
—24
.Osakabe
Y
et al.Восприятие окружающей среды: ключевые роли мембранно-локализованных киназ в восприятии растений и реакции на абиотический стресс
.J Exp Bot
2013
;64
:445
—458
.Dixon
RA
,Paiva
NL
.Стресс-индуцированный метаболизм фенилпропаноидов
.Plant Cell
1995
;7
:1085
—1097
.VanEtten
HD
et al.Два класса растительных антибиотиков: фитоалексины против «фитоантиципинов»
.Plant Cell
1994
;6
:1191
.González-Lamothe
R
et al.Растительные антимикробные агенты и их влияние на патогены растений и человека
.Int J Mol Sci
2009
;10
:3400
—3419
.Park
S
et al.Глицеоллины, один из фитоалексинов, полученных из соевых бобов при грибковом стрессе, повышают чувствительность к инсулину и обладают инсулинотропным действием
.J Agric Food Chem
2010
;58
:1551
—1557
.Zhao
J
et al.Передача сигнала Elicitor, ведущая к продукции вторичных метаболитов растений
.Biotechnol Adv
2005
;23
:283
—333
.Джонс
JD
,Дангл
JL
.Иммунная система растений
.Природа
2006
;444
:323
—329
.Van Wees
SC
et al.Иммунные реакции растений, вызванные полезными микробами
.Curr Opin Plant Biol
2008
;11
:443
—448
.Конрат
U
.Молекулярные аспекты защитного прайминга
.Trends Plant Sci
2011
;16
:524
—531
.Conceicao
LF
et al.Индукция фенольных соединений в клетках Hypericum perforatum L. с помощью Colletotrichum gloeosporioides elicitation
.Фитохимия
2006
;67
:149
—155
.Xu
M-J
et al.Оксид азота опосредует индуцированную грибковыми элиситорами продукцию гиперицина суспензионных культур клеток Hypericum perforatum через зависимый от жасмоновой кислоты сигнальный путь
.Plant Physiol
2005
;139
:991
—998
.Sivakumar
G
,Paek
K
.Метилжасмонат вызывает повышенное производство растворимых биофенолов в придаточных корнях женьшеня Panax из биореакторов промышленного масштаба.
.Chem Nat Compd
2005
;41
:669
—673
.Гадзовская
S
et al.Выявление жасмоновой кислотой клеточных суспензий Hypericum perforatum L. и влияние на продукцию фенилпропаноидов и нафтодиантронов
.Культ растительных клеток, тканей, органов
2007
;89
:1
—13
.Walker
TS
и др.Продукция гиперицина, индуцированная жасмоновой кислотой, в клеточных суспензионных культурах Hypericum perforatum L. (зверобой)
.Фитохимия
2002
;60
:289
—293
.Tirillini
B
et al.Индукция гиперицинов в Hypericum perforatum в ответ на хром
.Фитотерапия
2006
;77
:164
—170
.Шарафи
E
et al.Улучшение продукции гиперицина и гиперфорина с использованием нанооксидов цинка и железа в качестве элиситоров в культуре клеточной суспензии зверобоя ( Hypericum perforatum L.)
.J Med Plants By-Prod
2013
;2
:177
—184
.Рамирес-Эстрада
K
et al.Elicitation, эффективная стратегия биотехнологического производства биологически активных соединений с высокой добавленной стоимостью на фабриках по производству растительных клеток.
.Молекулы
2016
;21
:182
.Рамакришна
A
,Равишанкар
GA
.Влияние сигналов абиотического стресса на вторичные метаболиты растений
.Сигнальное поведение предприятия
2011
;6
:1720
—1731
.Сейболд
H
et al.Передача сигналов Ca2 + в иммунном ответе растений: от рецепторов распознавания образов до механизмов декодирования Ca2 +
.Новый Фитол
2014
;204
:782
—790
.Schluttenhofer
C
,юаней
L
.Регуляция специализированного метаболизма факторами транскрипции WRKY
.Plant Physiol
2015
;167
:295
—306
.Наумкина
МА
и др.Индуцированные элиситором факторы транскрипции для метаболического перепрограммирования вторичного метаболизма в Medicago truncatula
.БМК Завод Биол
2008
;8
:132
.Maeda
K
et al.DcMYB1 действует как активатор транскрипции гена фенилаланинаммиаклиазы моркови (DcPAL1) в ответ на обработку элиситором, УФ-B-облучение и эффект разведения
.Завод Мол Биол
2005
;59
:739
—752
.Trewavas
AJ
,Malhó
R
.Передача сигналов Ca2 + в растительных клетках: большая сеть!
.Curr Opin Plant Biol
1998
;1
:428
—433
.Белый
PJ
,Broadley
MR
.Кальций в растениях
.Ann Bot
2003
;92
:487
—511
.Meijer
HJ
,Munnik
T
.Передача сигналов на основе фосфолипидов у растений
.Анну Ревзавод Биол
2003
;54
:265
—306
.Ван
X
.Фосфолипаза D в гормональной и стрессовой сигнализации
.Curr Opin Plant Biol
2002
;5
:408
—414
.Bigeard
J
et al.Сигнальные механизмы в помехоустойчивости по шаблону (PTI)
.Завод Мол
2015
;8
:521
—539
.Boudsocq
M
,Sheen
J
.CDPK в иммунной и стрессовой передаче
.Trends Plant Sci
2013
;18
:30
—40
.Болвелл
GP
,Войташек
P
.Механизмы генерации активных форм кислорода в защите растений — широкая перспектива
.Physiol Mol Plant Pathol
1997
;51
:347
—366
.Zhao
J
et al.Индуцированный элиситором биосинтез индольных алкалоидов в культурах клеток Catharanthus roseus связан с притоком Ca 2+ и окислительным взрывом
.Plant Sci
2001
;161
:423
—431
.Ян
Z
.Small GTPases Универсальные сигнальные переключатели на предприятиях
.Растительная клетка
2002
;14
(Доп. 1
):S375
—S388
.Roos
W
et al.Редокс-зависимая фосфолипаза A плазматической мембраны, связанная с G-белком, участвует в активации биосинтеза алкалоидов у Eschscholtzia californica
.Biochim Biophys Acta
1999
;1448
:390
—402
.Vasconsuelo
A
,Boland
R
.Молекулярные аспекты ранних стадий выработки вторичных метаболитов в растениях
.Plant Sci
2007
;172
:861
—875
.Киракосян
А
и др.Стимуляция продукции гиперицинов маннаном в Hypericum perforatum культурах побегов
.Фитохимия
2000
;53
:345
—348
.Зубек
S
и др.Концентрация гиперицина и псевдогиперицина ценного лекарственного растения Hypericum perforatum L.усилены арбускулярными микоризными грибами
.Mycorrhiza
2012
;22
:149
–156
.Azeez
H
,Ibrahim
K
.Влияние биотических элиситоров на продукцию вторичных метаболитов в клеточных суспензиях Hypericum triquetrifolium Turra
.Bull Univ Agric Sci Vet Med Cluj-Napoca Horticul
2013
;70
:26
—33
.Gadzovska-Simic
S
et al.Производство вторичных метаболитов в суспензиях клеток Hypericum perforatum L. при выявлении грибкового мицелия из Aspergillus flavus
.Arch Biol Sci
2012
;64
:113
—121
.Simic
SG
et al.Опосредованное грибковыми элиситором повышение содержания фенилпропаноидов и нафтодиантронов в Hypericum perforatum L.Клеточные культуры
.Культ растительных клеток, тканей, органов
2015
;122
:213
—226
.Gadzovska Simic
S
et al.Влияние элиситоров полисахаридов на продукцию вторичных метаболитов и антиоксидантный ответ в культурах побегов Hypericum perforatum L.
.ScientificWorldJournal
2014
;2014
:609649
.Yamaner
Ö
et al.Стимуляция продукции гиперицинов in vitro проростками Hypericum adenotrichum некоторыми биотическими элиситорами
.Turk J Botany
2013
;37
:153
—159
.Simic
SG
et al.Элиситоры полисахаридов усиливают продукцию фенилпропаноидов и нафтодиантрона в суспензионных культурах клеток Hypericum perforatum
.Культ растительных клеток, тканей, органов
2015
;122
:649
—663
.Бразили
E
et al.Метаболический профиль и развитие корней корней Hypericum perforatum L. in vitro в стрессовых условиях, вызванных обработкой хитозаном и продолжительностью культивирования
.Фасадный завод Sci
2016
;7
:507
.Бразили
E
et al.Ненаправленный метаболомический подход для оценки эффектов роста биомассы и выявления хитозана на первичный и вторичный метаболизм Hypericum perforatum in vitro, корни
.Метаболомика
2014
;10
:1186
—1196
.Павлик
М
и др.Продукция гиперицина и гиперфорина в культуре зверобоя in vitro: влияние сахарозы, полиэтиленгликоля, метилжасмоната и Agrobacterium tumefaciens
.J Agric Food Chem
2007
;55
:6147
—6153
.Mañero
FJG
et al.Выявление вторичного метаболизма в Hypericum perforatum ризосферными бактериями и производными элиситорами в проростках и культурах побегов
.Фарма Биол
2012
;50
:1201
–1209
.Франклин
G
et al.Биосинтез ксантона в клетках Hypericum perforatum обеспечивает антиоксидантную и антимикробную защиту при биотическом стрессе
.Фитохимия
2009
;70
:60
—68
.Singh
RK
et al.Повышение содержания лигнина и флавоноидов в клеточной стенке Hypericum perforatum после совместного культивирования Agrobacterium tumefaciens
.Planta Med
2014
;80
:1388
.Тусевский
О
и др.Agrobacterium усиливает продукцию ксантона в суспензиях клеток Hypericum perforatum
.Регулятор роста растений
2015
;76
:199
—210
.Феликс
G
,Боллер
T
.Молекулярное зондирование бактерий в растениях — высококонсервативный РНК-связывающий мотив RNP-1 бактериальных белков холодового шока распознается как элиситорный сигнал в табаке
.J Biol Chem
2003
;278
:6201
–6208
.Felix
G
et al.Растения обладают чувствительной системой восприятия наиболее консервативного домена бактериального флагеллина
.Завод J
1999
;18
:265
—276
.Кунце
G
et al.N-конец бактериального фактора элонгации Tu вызывает врожденный иммунитет у растений Arabidopsis
.Растительная клетка
2004
;16
:3496
—3507
.Zipfel
C
et al.Устойчивость к бактериальным болезням Arabidopsis через восприятие флагеллина
.Nature
2004
;428
:764
—767
.Zipfel
C
et al.Восприятие бактериального PAMP EF-Tu рецептором EFR ограничивает трансформацию, опосредованную Agrobacterium
.Ячейка
2006
;125
:749
—760
.Эрбс
G
et al.Пептидогликан и муропептиды патогенов Agrobacterium и Xanthomonas вызывают врожденный иммунитет растений: структура и активность
.Chem Biol
2008
;15
:438
—448
.Bauer
Z
et al.Чувствительность различных экотипов и мутантов Arabidopsis thaliana к бактериальному элиситору флагеллину коррелирует с присутствием рецептор-связывающих участков
.J Biol Chem
2001
;276
:45669
—45676
.Лю
X-N
et al.Влияние цитокининов и элиситоров на продукцию гиперицинов и метаболитов гиперфорина в Hypericum sampsonii и Hypericum perforatum
.Регулятор роста растений
2007
;53
:207
—214
.Coste
A
et al.Влияние регуляторов роста растений и элиситоров на продукцию вторичных метаболитов в культурах побегов Hypericum hirsutum и Hypericum maculatum
.Культ растительных клеток, тканей, органов
2011
;106
:279
—288
.Гадзовская
S
et al.Идентификация и количественное определение гиперицина и псевдогиперицина в различных культурах Hypericum perforatum L. in vitro
.Plant Physiol Biochem
2005
;43
:591
—601
.Wu
S-Q
et al.Несколько факторов, влияющих на продукцию гиперицина Hypericum perforatum во время культивирования придаточных корней в биореакторах эрлифта
.Завод Acta Physiol
2014
;36
:975
—981
.Zubrická
D
et al.Ксантоны из корней, волосатых корней и суспензионных культур клеток выбранных видов Hypericum и их противогрибковая активность против Candida albicans
.Plant Cell Rep
2015
;34
:1953
—1962
.Гадзовская
S
et al.Влияние салициловой кислоты на побеги, каллус и суспензионные культуры клеток на продукцию нафтодиантронов и фенилпропаноидов у Hypericum perforatum L
.Культ растительных клеток, тканей, органов
2013
;113
:25
—39 900 13.
Брехнер
ML
et al.Влияние УФ-В на вторичные метаболиты зверобоя ( Hypericum perforatum L.) выращены в контролируемых средах
.Photochem Photobiol
2011
;87
:680
—684
.Зародыш
M
et al.На концентрацию флавоноидов, танинов и гиперицина в листьях зверобоя ( Hypericum perforatum L.) влияет уровень УФ-В излучения
.Food Chem
2010
;122
:471
—474
.Яманер
О
,Эрдаг
В
.Влияние сахарозы и полиэтиленгликоля на содержание гиперицинов в Hypericum adenotrichum
.EurAsian J Biosci
2013
;7
:101
—110
.Франклин
G
,Dias
A
.Клетки Hypericum perforatum накапливают антоцианы и флавоноиды за счет биосинтеза ксантона во время световой адаптации PlantEngine 1 (COST Action FA 1006 — Метаболическая инженерия растений для ценных продуктов, 1-я ежегодная конференция), 2011 г. (17–18 ноября) Мурсия, Испания
2011
.Валлетта
A
et al.Уксусная кислота действует как элиситор, оказывая хитозаноподобный эффект на биосинтез ксантона в культурах корня Hypericum perforatum L.
.Plant Cell Rep
2016
;35
:1009
—1020
.Singh
RK
et al.Agrobacterium-elicited Hypericum perforatum Метанольный экстракт клеток проявляет антибактериальную активность против патогенов человека
.Planta Med
2014
;80
:1424
—1425
.Carvalho
AC
et al.Метанольный экстракт клеток Hypericum perforatum , вызванный Agrobacterium tumefaciens , обеспечивает защиту от окислительного стресса, индуцированного в клетках HepG2 человека
.Ind Crops Prod
2014
;59
:177
–183
.Tocci
N
et al.Биологическое фракционирование экстрактов из корней Hypericum perforatum in vitro, обработанных карбоксиметилхитозанами, и определение противогрибковой активности против грибковых патогенов человека
.Plant Physiol Biochem
2013
;70
:342
—347
.Zhang
B
et al.Стимуляция выработки артемизинина у Artemisia annua волосистых корней с помощью наночастиц ядро-оболочка Ag-SiO2
.Curr Nanosci
2013
;9
:363
—370
.Ганати
F
,Бахтиарян
S
.Влияние метилжасмоната и наночастиц серебра на продукцию вторичных метаболитов Calendula officinalis L (Asteraceae)
.Trop J Pharm Res
2014
;13
:1783
—1789
.Горбанпур
M
,Hadian
J
.Многослойные углеродные нанотрубки стимулируют индукцию каллуса, биосинтез вторичных метаболитов и антиоксидантную способность лекарственного растения Satureja khuzestanica , выращенного in vitro
.Углерод
2015
;94
:749
—759
.Курепа
J
et al.Прямое выделение флавоноидов из растений с использованием сверхмалых наночастиц анатаза TiO (2)
.Завод J
2014
;77
:443
—453
.Schlipf
DM
et al.Адсорбция и стабильность флавоноидов на наночастицах диоксида кремния, функционализированных диоксидом титана
.Colloids Surf A
2015
;478
:15
—21
.Cui
X-H
и др.Опытное культивирование Hypericum perforatum L. придаточных корней в эрлифтных биореакторах для получения биологически активных соединений
.Appl Biochem Biotechnol
2014
;174
:784
—792
.Онелли
E
et al.Ультраструктурные исследования развивающихся секреторных узелков Hypericum perforatum
.Растения Flora Morphol Distrib Distrib Funct Ecol
2002
;197
:92
—102
.Piovan
A
et al.Обнаружение гиперицинов в «красных железах» Hypericum elodes с помощью ESI – MS / MS
.Фитохимия
2004
;65
:411
—414
.Зобайед
S
et al.Взаимодействие растения и окружающей среды: накопление гиперицина в темных железах Hypericum perforatum
.Энн Бот
2006
;98
:793
—804
.Корнфельд
A
et al.Производство гиперицинов в двух отобранных культурах побегов Hypericum perforatum связано с различиями в структуре черных желез
.Plant Physiol Biochem
2007
;45
:24
—32
.Гайд
М
и др.Производство гиперфорина в корневых культурах Hypericum perforatum
.J Biotechnol
2016
;222
:47
—55 900 13.
© 2017 Авторы. Journal of Pharmacy and Pharmacology , опубликованный John Wiley & Sons Ltd от имени Королевского фармацевтического общества
Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (https: // creativecommons.org / licenses / by / 4.0 /), что разрешает некоммерческое повторное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии правильного цитирования оригинальной работы. По вопросам коммерческого повторного использования обращайтесь по адресу [email protected].ЛиАЗ 6213: aphoyintimenti, incazelo kudivayisi
Эмадолобхени амахулу умбузо острый икахулукази абагибели трафик. Куле ндаба, пхамби онджинияла русский баникезва исабело уквенза умфузисело эзифана зокутхута умфакати, обекунгадала индудузо элихлангене кахулу футхи умтхамо.ekugcineni Le moto waba ibhasi LiAZ 6213. Ngo-ke sixoxa ngokuningiliziwe esihlokweni.
ulwazi olujwayelekile
LiAZ 6213, okuyinto idivayisi uzobe kuchazwe ngezansi, ungowokuqala kule Российская Федерация ibhasi ephansi phansi. Ngokokuqala ngqá, wagingqa aphume imboni yokukhiqiza e 2007. Amapharamitha imoto ngokuphelele ihlangabezane nezimiso yesimanje. Нгаинье ялези амабхаси ифакве омунье эзимбили зама инджини этолакалайо.
Okokuqala samuntu — MAN D0836LOH 02.Lokhu Motor amasilinda ahlelwe zibheka futhi umthamo wayo ulingana 278 amahhashi. Uhlelo ngamandla elungiselelwe EURO-3 ejwayelekile.
Okwesibili samuntu -Umuntu Ongokoqobo D0836LOH 55. Лоху мотор имеет амандла 280 амахаши, объем иволуму 6900 куб. стандарт Экологический — ЕВРО-4.
kudivayisi
LIAZ 6213 ifakwe АКПП ZF-6HP 504C. Торможение Uhlelo имеет wesifunda ezimbili womoya kanye enza zonke amasondo. Futhi iyatholakala ohlelweni ABS.Ibhasi ikwazi ngesivinini esiphezulu 75 км / ч.
Кумисва кузова-сенсимби футхи силунгиселелвэ ngendlela le nqola. Isakhiwo asekelayo senziwa metal okuqinile lungekho ukugqwala ngokusebenzisa kuso sishaye ekhethekile ngaphambi kokubeletha kumthengi.
Посадка / высадка укузе abagibeli ayatholakala-umnyango ezine, okuyinto ngesikhala esilinganayo kanye ubude wonke umzimba. Инани лезихлало — 153. Кулава, изихлало 34 — сидячий. Futhi inikeza indawo umuntu okhubazekile ezihambayo ngesihlalo sabakhubazekile.Lokhu esihlalweni ngokugcwele aguqulelwe umuntu abanezidingo ezikhethekile.
LIAZ 6213 nayo ifakwe ophoqelelwe ukupholisa uhlelo. Ngenkathi ezibandayo gumbi ukufuthelana ngu amanzi обогреватель. Я лишисе, велулела йонкана убуде локушиса ангафакати ушукумисела этиле кетшези нгокусебензиса ухлело. Ngenxa yalokhu, esigabeni ngasinye lifudumeza ngokulinganayo. Isikhundla ukushayela ahlukaniswa gumbi umgibeli eziklanyelwe salokhu odongeni ingilazi owawenzelwa ukuvikela umshayeli emsindweni nezingahlobene nendaba kubantu.
ukulungiswa
ЛиАЗ 6213 имеет ongakhetha eziningana. Ikakhulukazi, 6213,20 anezinye umehluko kusuka imodeli wokuqala: в нем есть умбала ukuhluka bese ngombala. Ngaphezu kwalokho, kule ibhasi esihlalweni yesimanje, limbozwa ngendwangu engesiyo kuncike ukugqoka. Интерьер ukukhanyisa — лента, ngcono ukwahlukanisa yangaphakathi.
6213,21 umshini имеет yokukhanya entsha, umklamo ingasebenza modified (поручни njengoba nezihlalo), isimo ezimbili emoyeni.
Автобус ne 6213,22 Inkomba yena, wathola sokuphehla amandla, sayiswa ehhovisi zokunakekelwa kwemvelo EURO-5.Inani lezihlalo он имеет версию efanayo ibhodlela igesi 41. ibhasi — umfuziselo LiAZ 6213,70, eyakhishwa ngo inani izicucu eziyishumi. Kodwa ukuhlolwa edolobheni baye babonisa ukuthi ukusebenza ngempela ongaphakeme, ngakho kwanqunywa ukuyisusa ukukhiqizwa ngokuphelele.
Imodeli obuphambili LIAZ ibhasi — 6213,71 ине ukuzilawula ngokuzenzekelayo izincwadi zokungena kwamanye amazwe abagibeli, ukulawula isimo sezulu, izinga lokushisa izinzwams, ukuzilawula ukuzilawums, electronic nezimpaunums.Нгафезу квалохо, ибхаси зафака укукапа исимо кулели гумби.
amapharamitha
Imininingwane ЛиАЗ 6213 zimi kanje:
- Убуде — 18,04 амамитхи.
- Убубанзи — 2,5 амамитхи.
- Укуфакама — 2,8 амамитхи.
- Okuncane okudingekayo kokuphenduka umbuthano — 11,5 амамитха.
- Колесная база — Isibonisi se-5,96 метра.
- Укунканда исисиндо умшини — аматани 15,73.
- ibhasi isisindo Okugcwele — amathani 29.7.
- Ngaphambili oluvala amasondo umthwalo uwela — amathani 7.1, ngemuva — amathani 11.2.
- Oluvala amasondo ukucushwa — 6×2.
- Ephambi kwezinduna amathangi amabili ukuba uqedwe, umthamo ngayinye ilingana 270 amalitha.
- Топливо ukusetshenziswa — 27 amalitha ngamunye amakhilomitha 100 uhambo endleleni emjikelezweni elihlangene.
- Амасондо айо ифакве усилитель вокубациндезела.
Изиндлэко имото
ЛиАЗ 6213, intengo zazo zokhahlamba kusuka abayizigidi ezingu-2,5 kuya ku 3 рубля русский, имеет изингксеные neyesifunda senziwa ukuphepha wekhasi elinyakaziši ukuphepha wekhasi элихэзэдэ ибэзэзэдэ, укуфэпэ векхаси элихэзэзэ ибэзэсэ.