320405 паз: Пригородный автобус ПАЗ 320405-04 Вектор Next (с ремнями безопасности)

Trabalhe Conosco

Buscamos profissionais alinhados aos valores da empresa, com perfil inovador e proativo.

Faça Você também parte da equipe Rema Tip Top Brasil.

Envie o currículo para o e-mail: cvs @rematiptop. com.br

Endereço

Родовия Дом Педро I, 87 км | Edifício Camões, unidade 39 — Ponte Alta |
CEP 12.952-821 | Атибая / Сан-Паулу

Contato

ПОЛНОСТЬЮ СБОРНАЯ вешалка для верхней одежды с белыми корзинами Tetbury Truffle Подвесная полка с 2 белыми корзинами для хранения Очень прочная

Ключ для подъема крышки Набор инструментов для консервирования, включая воронку для консервирования, подъемник для банок, набор из 6 предметов для домашнего консервирования, щипцы и стойку для консервирования с силиконовыми ручками Принадлежности для консервирования банок Mason Jars, 2 шт.Круглый льняной футон, моющийся чехол, диаметр 40 см, подушки для стульев, балкон, эркер, матовый коврик в японском стиле, утолщенные подушки сиденья, мягкая напольная подушка, 16 дюймов, Fissler Royal 1863300690, ручка для скороварки. Пробойник для яиц Пробойник для яиц Пробойник для яиц Кухонный инструмент Полуавтоматический с предохранительным замком Белый Желтый. Изготовлено вручную Уильямом Стертом. Изящная оловянная чаша для соли из ракушек устрицы, Baoblaze 200 штук МИНИ-САТИНОВАЯ ЛЕНТА РОЗОВЫЙ БУДЕТ ЦВЕТОК С ЗЕЛЕНЫМИ ЛИСТЬЯМИ ПРИМЕРЫ ДЛЯ ШИТЬЯ DIY УКРАШЕНИЯ / АКСЕССУАРЫ ДЛЯ ВОЛОС ДЛЯ ДЕВОЧЕК / Подушка для хранения контуров / Подушка с памятью для шеи, НОВИНКА для спящих на животе сбоку, подушка нестандартного размера 50 Мягкая поддерживающая подушка 30 см со съемной моющейся наволочкой.Выдвижная двусторонняя черная рулетка Gaoominy для измерения тела. Измерительная лента для тела. Измерительная лента для шитья. Индивидуальная измерительная лента для ткани, Cookology CGL100SS. Нержавеющая сталь. Изогнутая стеклянная вытяжка 100 см. Комплект для вытяжки. Черный набор из 3 универсальных нескользящих ковриков в рулонах противоскользящего коврика 30см x 150xm. SunnyClover Прочный пластиковый отпариватель для яиц Креативная куриная форма для яиц Котел для яиц для домашнего использования 1PCS White.

ПОЛНОСТЬЮ СБОРНАЯ вешалка для верхней одежды с белыми корзинами Tetbury Truffle Подвесная полка с 2 белыми корзинами для хранения Очень прочная

2002-2008 C6H0,7H0 (42) ДВЕРНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ CHEVROLET kodiak Kodiak (Мексика)

PNC	Код детали	Название	Количество	Информация	i
0	19354137	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR (BODY SI)	01
0	19354137	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR (BODY SI)	01
0	88979802	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR (BODY SI)	01
0	88979802	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR (BODY SI)	01
0	88979800	ПЕТЛЯ, FRT S / D UPR (BODY SI)	01
0	88979800	ПЕТЛЯ, FRT S / D UPR (BODY SI)	01
0	12475678	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D LWR (BODY SI)	01
0	12475678	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D LWR (BODY SI)	01
0	12475677	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D LWR (BODY SI)	01
0	12475677	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D LWR (BODY SI)	01
0	88979797	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D LWR (DR SI)	01
0	88979797	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D LWR (DR SI)	01
0	88979795	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D LWR (DR SI)	01
0	88979795	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D LWR (DR SI)	01
0	12475075	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR (DR SI)	01
0	12475075	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR (DR SI)	01
0	12475076	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR (DR SI)	01
0	12475076	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR (DR SI)	01
1	12387770	ДВЕРЬ, ПЕРЕДНЯЯ СИСТЕМА SI (БЕЗ ПЕТЛИ)	01
1	12387769	ДВЕРЬ, ПЕРЕДНЯЯ СИСТЕМА SI (БЕЗ ПЕТЛИ)	01
2	159	НАЩЕЛЬНИК, ПЕРЕДНИЙ S / D WDO (ГОРИЗОНТАЛЬНО)	01
2	159		НАЩЕЛЬНИК, ПЕРЕДНИЙ S / D WDO (ГОРИЗОНТАЛЬНО)	01
3		LABEL, ODOM SERV INFO
4	15594594	ГАЙКА, FRT S / D LK STKR	02
5		РАСПОРКА, ПЕРЕДНИЙ S / D LK STKR
10	15667290	ИЗОЛЯТОР, FRT S / D LKG ROD (16. 150) (** ВПИ 1-877-846-8243)	01
12	12338100	ЗАЖИМ, ПЕРЕДНИЙ S / D LK REL LVR LKG ШТОК (ТИП ПРУЖИНЫ)	01
14		БАМПЕР, ПЕРЕДНИЙ S / D LK ВИЛКА (ЧАСТЬ 15)
15	16631626	ЗАМОК, ПЕРЕДНИЙ S / D (12,13,14 ЭЛЕМЕНТОВ # ВКЛЮЧЕНО , 16)	01
15	16631627	ЗАМОК, ПЕРЕДНЯЯ S / D (ВКЛЮЧАЮЩИЕ ЭЛЕМЕНТЫ № 12,13,14,16)	01
15	11610365	РАСПОРКА, ПЕРЕДНИЙ S / D LAT STKR	02
16		ПРУЖИНА, FRT S / DO / S HDL P / BUT RTN (ЧАСТЬ ИЗ 15)
21		ПРИВОД, FRT S / D LK
22	15714276	ВИНТ, HWH, W / FL WA, САМОРЕЗОН, M4. 2X1,41X18,12,5 Н.Д., 6010M, PS (8,977)	AR
23	12338108	ФИКСАТОР, ПЕРЕДНИЙ S / D I / S HDL BZL (TYPE U SPR CLIP) (9.665) (ACDelco # 12338108)	06
23	22551452	ФИКСАТОР, FRT S / D I / S HDL BZL (10.240)	06
23	22551452	ЗАЖИМ, ФИКСАТОР, 0,051 ТОЛЩ., ZC (FRT S / D I / S HDL BZL) (10.240)	AR
24	22071939	БЕЗЕЛЬ, ПЕРЕДНИЙ S / D I / S HDL	01
24	22071940	БЕЗЕЛЬ, ПЕРЕДНИЙ S / D I / S HDL	01
25	22086873	КОНТРОЛЬ, ПЕРЕДНИЙ S / D LK (ВКЛЮЧАЕТ РУЧКУ)	01
25	22086874	CONTROL, FRT S / D LK (ВКЛЮЧАЕТ РУЧКУ)	01
26		ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЬ, DR LK
27		ПЕРЕКЛЮЧАТЕЛЬ, SI WDO
75
75 9000W , АВТОМАТИЧЕСКИЙ КАНАЛ, M4. 2X1,41X18,12,5 Н.Д., 6010M, PS (8,977)	AR
29	12363327	ПАНЕЛЬ, ПЕРЕДНИЙ S / D INR (С РЕГУЛЯТОРОМ)	01
30	15718115	КЛАПАН, ПЕРЕДНИЙ S / D ДАВЛЕНИЕ RLF	01
30	15718116	КЛАПАН, ПЕРЕДНИЙ S / D ДАВЛЕНИЕ RLF	01
30	22071945	КЛАПАН, ПЕРЕДНИЙ S / D ДАВЛЕНИЕ RLF (INR MTG)	01
31	11514623	БОЛТ, ШЕСТИГРАННЫЙ W / CON WA, M6X1X20 (FRT S / D WDO CHAN)	AR
33	22071950	РЕГУЛЯТОР, ПЕРЕДНИЙ S / D WDO (РУЧНОЙ) (ACDelco # 22071950)	01
33	22071951	РЕГУЛЯТОР, ПЕРЕДНИЙ S / D WDO (РУЧНОЙ) (ACDelco # 22071951)	01
34	11561257	ЗАКЛЕПКА, КУПОЛЬНАЯ, 6. 3DIA X 16.125, 13 OD, AL СПЛАВ, ОБЫЧНЫЙ, 1.52-8.26 GRP R	AR
35	15656027	ВИНТ, HWH, С УПЛОТНЕНИЕМ, M4.2X1.41X16, 8.9 O.D., 6172M, BO (КЛАПАН СНЯТИЯ ДАВЛЕНИЯ ПЕРЕДНЕГО ДАВЛЕНИЯ) (8.900)	06	06
36	15039965	БАМПЕР, ПЕРЕДНИЙ S / D	02
38		ЖГУТ ПРОВОДОВ, P / W и DR LK DR WRG	01
39		ЖГУТ ПРОВОДОВ, P / W и DR LK CR	40		ТРУБОПРОВОД, O / S RR VIEW MIR DR WRG HARN
41	22555343	ГАЙКА, FRT S / D INR MTG PNL (M4.2X1,4) (П-образный) (16,250)	01
42	25881409	БАМПЕР, ПЕРЕДНИЙ S / D WDO	02
42	25881409	PAD, FRT S / D WDO STOP (16. 190)
43	06256958	ЗАГЛУШКА, RD 1 3/4 ОТВЕРСТИЯ ПЛАСТИКОВАЯ (ПЕРЕДНЯЯ S / D WRG ОТВЕРСТИЯ CDT) (** VPI 1-877-846-8243)	02
45		ЗАКЛЕПКА, ПЕРЕДНЯЯ S / D WDO RET
47	20633148	ФИКСАТОР, ПЕРЕДНИЙ S / DO / SED LK ROD .474) 380256	02
48	01154607	КЛЮЧ, DR LK (OVAL HD) (ПАЗ H) 320405	02
49	15619623	PAWL, FRT S / D LK 321620	01
49	15619622	PAWL, FRT S / D LK 321621	01
50	12546858	ЦИЛИНДР, ПЕРЕДНИЙ S / D LK (С ЧЕРНЫМИ И ЯРКИМИ ПЫЛЬНИКАМИ)	01
51	15619624	РУЧКА, ПЕРЕДНИЙ S / D O / S 594717	01
51	15619625	РУЧКА, ПЕРЕДНИЙ S / D O / S 594716	01
52	15619623	PAWL, FRT S / D LK 321620	01
52	15619622	PAWL, FRT S / D LK 321621	01	10. 474) 380256	02
55	16600277	ФИКСАТОР, ПЕРЕДНИЙ S / D O / S HDL CYL LVR (ПРУЖИННЫЙ ЗАЖИМ) (10.550) 321936AA1	02
56	03530230	БОЛТ, ПЕРЕДНИЙ S / D O / S HDL (FRT S / D O / S HDL) (M6X1X13) (10,527)	02
56	15982750	БОЛТ, FRT S / D O / S HDL (FRT S / D O / S HDL) (M6X1X10 W / CONN WA)	02
57		ШПИЛЬКА, FRT S / D HGE (BODY SI)
59		ПЕТЛЯ, DR UPR (DR HALF) (* KIT1, KIT1, KIT1, KIT1, KIT1, KIT1, KIT1, KIT1
59	15994345	ШТИФТ, ПЕРЕДНИЙ S / D HGE (ПЕТЛЯ, ВЕРХНИЙ ДВИГАТЕЛЬ (ПОЛОВИНА ДВИГАТЕЛЯ) (НЕ СМАЗЫВАЕМЫЙ) (С ВТУЛКАМИ 8.6ММ И 9,6ММ И ФИКСАТОР) (* КОМПЛЕКТ1, КОМПЛЕКТ2)	04
60	888	ПРУЖИНА, ПЕРЕДНЯЯ S / D HGE	02
61		ШПИЛЬКА, FRT S / D HGE (BODY SI)
63		ВТУЛКА, FRT S / D HGE PIN (* KIT3, KIT4)
64		ПЕТЛЯ, DR LWR (DR HALF) (* KIT3, KIT4)
65		ВТУЛКА, FRT S / D 9000 PIN (* KIT4)
66	11515748	ГАЙКА, M8X1.25X7.1, ZC 10 (* KIT3, KIT4)	AR
68		ПЕТЛЯ, DR LWR (ПОЛОВИНА КУЗОВА) (* KIT5, KIT6)
69	115157.25	ГАЙКА, M8X1 KIT6)	AR
70		ПЛАСТИНА, ДВИГАТЕЛЬ HGE BKG (LWR-BODY HALF) (* KIT3, KIT4)
71		000 ШЛАНГ	0003 ШЛАНГ ДВИГАТЕЛЯ
71	88979800	ПЕТЛЯ, FRT S / D UPR (BODY SI) (ПЕТЛЯ, DR UPR (BODY HALF)	01
71	88979802	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR (BODY SI) (ПЕТЛЯ, DR UPR (BODY HALF)	01
71	19354137	КОМПЛЕКТ ПЕТЛИ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR (BODY SI) (ПЕТЛЯ, DR UPR (BODY HALF)	01
72	11514766	БОЛТ, ШЕСТИГРАННЫЙ, M8X1.25X25, 22 THD (FRT S / D HGE) (* KIT1, KIT2, KIT3, KIT4)	01
73		ПЛАСТИНА, DR HGE BKG (UPR-BODY-HALF) (* KIT3, KIT4)
74		ВТУЛКА, ПЕРЕДНЯЯ ВТУЛКА , KIT4)
76		ВТУЛКА, ПЕРЕДНИЙ S / D HGE PIN (* KIT1, KIT2, KIT3, KIT4)
77 X1	25X7.1, ZC 10 (* KIT1, KIT2, KIT3, KIT4)	AR
78		ПИН, FRT S / D HGE
78	19329933	НАБОР ПИН, ПЕРЕДНИЙ S / D HGE (СМАЗЫВАЕМЫЕ, ШТИФТЫ, ШТИФТЫ ЗАЖИМЫ, ZERK FTGS, INST SHT) 9614GVFP-G	02
79	11514766	БОЛТ, ШЕСТИГРАННЫЙ, M8X1.25X25, 22 THD (FRT S / D HGE) (* KIT1, KIT2, KIT3, KIT4)	01
80	15718115	КЛАПАН, ПЕРЕДНИЙ S / D ДАВЛЕНИЕ RLF	01
80	15718116	КЛАПАН, ПЕРЕДНИЙ S / D ДАВЛЕНИЕ RLF	01
80	22071945	КЛАПАН, ПЕРЕДНИЙ S / D ДАВЛЕНИЕ RLF (INR MTG)	01
81		ШТИФТ, ПЕРЕДНИЙ S / D UPR BODY SI HGE STOP
82		РОЛИК, FRT S / D CHK LINK												ШТИФТ, ПЕРЕДНИЙ S / D CHK LINK RLR
84		КОМПЛЕКТ РЕМНЯ, ПЕРЕДНИЙ S / D CHK
85 44 9000RE	157 FL WA, АВТОМАТИЧЕСКАЯ КНОПКА, M4.2X1.41X18,12,5 НАД., 6010M, PS (FRT S / D CHK STRP BRKT) (8.977)	AR
86	11503632	БОЛТ, M8-1.25X20 HEX FLG 9,8 PC (FRT S / D CHK STRP BRKT)	AR
87	11609679	ШАЙБА, ПЛОСКАЯ, M8 (ПЕРЕДНИЙ S / D CHK STRP BRKT)	AR
88	11609989	БОЛТ, ШЕСТИГРАННАЯ ШАЙБА, M6X1X25,15 THD, 17 OD, 6202M STL, GMW3200, TAPTITE (FRT S / D CHK STRP BRKT)	AR	AR
89	11516780	ГАЙКА, ШЕСТИГРАННАЯ W / CON WA, M8X1.25,10THK, 19 наруж., 10,7111M (FRT S / D CHK STRP BRKT) (8.917)	AR
90	11561043	БОЛТ, ПЕРЕДНИЙ S / D LAT	01

Запрограммированная доставка биомолекул для обеспечения и направления миграции клеток для восстановления соединительной ткани

Выделение и культивирование клеток

Фетальные (конец 2–3 триместра) и взрослые (20–30 месяцев) коленные суставы крупного рогатого скота были стерильно иссечены и колено мениски были удалены.Для выделения клеток тела медиальных менисков (красная / белая центральная зона) измельчали, помещали на пластик для тканевых культур (TCP) и инкубировали при 37 ° C в базальной среде (BM), состоящей из модифицированной Дульбекко среды Игла (DMEM; Sigma). -Aldrich) с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 1% пенициллина / стрептомицина / фунгизона (PSF). Клетки, вышедшие из измельченной ткани на TCP, размножались до 80% конфлюэнтности перед тем, как их отделяли с помощью 0,25% трипсина-ЭДТА (Пассаж 1; P1). Перед исследованиями хемотаксиса клетки голодали в течение ночи в средах с низким содержанием сыворотки (LM; DMEM с 1% FBS и 1% PSF), чтобы минимизировать воздействие сыворотки.

Миграция клеток in vitro

96-луночный набор для анализа миграции Transwell (96-луночный анализ миграции Chemicon QCM, EMD Millipore) был использован в соответствии с инструкциями производителя для оценки миграции клеток в зависимости от размера пор мембраны и хемоаттрактанта (рекомбинант человека фактор роста тромбоцитов-AB, PDGF-AB; Prospec Bio) (рис. 1а). 0 (контроль), 50 или 100 нг / мл PDGF-AB (низкий или высокий PDGF) в LM добавляли (150 мкл) в нижнюю камеру лунок и 50000 менисковых клеток P1, меченных диацетатом 5-хлорметилфлуоресцеина (CellTracker Green ; Thermo Fisher Scientific) засевали в верхнюю камеру и инкубировали в течение 16 ч при 37 ° C перед количественным определением.Миграцию оценивали с различными размерами пор (диаметр 3, 5 или 8 мкм, n = 4 / группа), и интенсивность сигнала флуоресценции нормализовали к группе пор 3 мкм для каждого условия. После миграции мембраны фиксировали в 4% параформальдегиде и окрашивали 4 ’, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI; Thermo Fisher Scientific) для визуализации ядер клеток. Клетки, мигрирующие через мембраны, были визуализированы (конфокальный микроскоп Nikon A1, увеличение × 20, интервалы 1 мкм) в каналах FITC (475–490 нм), DAPI (385–400 нм) и TRITC (545–565 нм) для визуализации клетки, соответствующие ядра и мембраны Transwell (автофлуоресцентные в канале TRITC).

Чтобы лучше понять миграцию клеток через ткань, был разработан тканевый анализ миграции камеры Бойдена с использованием ткани (срезы толщиной ~ 35 мкм через микротом криостата), вырезанных из средней зоны медиального мениска плода крупного рогатого скота. Срезы ткани помещали на предметные стекла над четырьмя прорезанными лазером отверстиями (диаметром 1 мм) так, чтобы преобладающее направление волокон коллагена было параллельно поверхности предметного стекла. Слайды помещали на вогнутые стеклянные слайды, содержащие 140 мкл LM или LM с 200 нг / мл PDGF-AB (PDGF) (рис.1d) и фиксируется зажимами из нержавеющей стали. Эксплантаты взрослых тканей, помеченные CellTracker Green, помещали поверх срезов ткани и инкубировали при 37 ° C в течение 48 часов в LM ( n = 3 / группа). Затем предметные стекла фиксировали и окрашивали, как указано выше, и отображали с помощью конфокальной микроскопии (увеличение × 10, интервалы 2 мкм) в каналах FITC и DAPI для визуализации клеток, соответствующих ядер и тканевого барьера (автофлуоресцентного в канале DAPI). Для количественной оценки интерстициальной миграции через тканевой барьер подсчитывали общее количество клеток и количество мигрировавших клеток (полностью встроенных в ткань или появившихся на противоположной стороне).

Изготовление нановолоконного каркаса

Гиалуроновая кислота, модифицированная гидроксиэтилметакрилатом (HEMA-HA), была синтезирована, как описано ранее ^{24, 29} , посредством реакции тетрабутиламмониевой соли гиалуроновой кислоты (74 кДа; Lifecore Biomedical модификации 2) и Lifecore Biomedical 2) и -гидроксиэтилметакрилат. HEMA-HA (для простоты называемый HA) очищали с помощью обширного диализа против деионизированной воды при 4 ° C, лиофилизировали и анализировали с помощью ¹ H ЯМР для определения функционализации 30%.

Нановолоконные каркасы были синтезированы трехкомпонентным электроспиннингом (дополнительный рисунок 1) со следующими компонентами: (1) 14,3 мас.% Поли (ε-капролактона) (80 кДа PCL; Sigma-Aldrich) в смеси 1: 1 диметилформамид и тетрагидрофуран; (2) 8 мас.% Полиэтиленоксида (200 кДа PEO; Polysciences) в 50% этаноле в деионизированной воде; и (3) 4 мас.% ГА с 2 мас.% ПЭО (900 кДа ПЭО; Sigma-Aldrich) и 0,05 мас.% Irgacure 2959 в деионизированной воде. Для каркасов, содержащих коллагеназу, 2 мас.% Коллагеназы типа IV (тип IV из Clostridium histolyticum , ≥125 единиц расщепления коллагеназы / мг твердого вещества; Sigma-Aldrich) добавляли к раствору PEO непосредственно перед электропрядением.Для каркасов с PDGF-AB, 50 мкг / мл PDGF-AB (Shenandoah Biotechnology Inc.) добавляли к раствору HA непосредственно перед электропрядением. Каждый раствор загружали в отдельные шприцы и размещали на равных расстояниях (в радиальном направлении) вокруг общей вертикально вращающейся сборной оправки ¹⁸ . Электроспиннинг проводили с использованием следующих параметров для каждого компонента: (PCL) + 12–15 кВ, 2,0 мл / ч, 15 см; (ПЭО) + 12–15 кВ, 2,5 мл / ч, 15 см; (HA) + 24–28 кВ, 1,4 мл / ч, 16 см, что соответствует приложенному напряжению, скорости потока полимера и расстоянию от фильеры до оправки.Кроме того, напряжение подавалось на оправку (-3 кВ) и дефлектор (+4 кВ) для повышения эффективности сбора волокна на оправке. Чтобы сделать возможным сшивание волокон НА, каркасы подвергали воздействию ультрафиолетового света 10 мВт / см ² в атмосфере азота в течение 15 мин с каждой стороны. Изображения с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM; FEI Quanta 600 FEG Mark II, Penn Singh Center for Nanotechnology Facility) использовали для количественной оценки диаметров волокон с помощью NIH ImageJ ( n = 4 образца, 50 волокон на образец).Для визуализации различных фракций волокон в растворы PCL, PEO и HA добавляли метакрилоксиэтилтиокарбамоил родамин B (родамин; 0,05% мас. / Об.), 5 (6) -карбоксифлуоресцеин (0,5% мас. / Об.) И DAPI (0,05%). w / v), соответственно, до электроспиннинга и полученные изображения с помощью флуоресцентной микроскопии.

Оценка каркаса

После электроспиннинга и сшивания трехкомпонентные нановолоконные каркасы (толщиной ~ 0,5 мм) погружали в фосфатно-солевой буфер (PBS) для оценки разложения и высвобождения биомолекул.Объемную потерю массы каркаса определяли путем измерения веса сухого каркаса до и после погружения в PBS для различных временных точек ( n = 4 / группа). Количество уроновой кислоты, компонента деградации НА, в супернатанте определяли количественно с течением времени с использованием модифицированного анализа уроновой кислоты, описанного в других статьях ^{48, 49} , и сравнивали с известными концентрациями НА ( n = 5 / группа). Высвобождение коллагеназы количественно определяли путем измерения поглощения раствора при 280 нм и сравнения со стандартной кривой ( n = 5 / группа), а высвобождение PDGF-AB определяли количественно с помощью набора для иммуноферментного анализа PDGF-AB (R&D Systems) ( n = 5 / группа).

Механические свойства трехкомпонентных каркасов на различных стадиях разрушения оценивались с помощью испытаний на одноосное растяжение. Каркасы PCL / PEO / HA (30 × 5 × 0,5 мм) погружали в PBS на 1, 7, 14, 28 и 56 дней (гидратированный). Контроли включали скаффолды в исходном состоянии (необработанные) и скаффолды, обработанные гиалуронидазой (HASE; Sigma-Aldrich) в течение 24 часов (6,7 мг / мл в PBS) для удаления фракций волокон PEO и HA. После гидратации каркасы лиофилизировали и определяли площадь поперечного сечения с использованием специальной лазерной измерительной системы ¹⁷ .Образцы помещали в зубчатые захваты, предварительно нагружали при 0,5 Н и растягивали до разрушения при 0,1% деформации в секунду с использованием микротестера Instron 5848 и тензодатчика 50 Н ¹⁷ . Модуль упругости был рассчитан из линейного участка кривой зависимости напряжения (нагрузка, нормированная на площадь поперечного сечения) от деформации (смещение, нормированное на расчетную длину) ( n = 4–6 / группа).

Инфильтрация клеток в нановолокнистые субстраты

Взрослые эксплантаты мениска, помеченные CellTracker Green, помещали поверх нановолоконных субстратов PCL / PEO / HA (толщиной ~ 20 мкм, флуоресцентно допированные 0.05% масс. / Об. Родамина), который предварительно инкубировали в PBS с или без 1 мг / мл HASE в течение 72 часов для разложения фракции волокон НА. Результаты сравнивали с контрольным каркасом PCL / PEO, в котором компонент волокна HA был заменен дополнительным компонентом волокна PEO. Эксплантаты и каркасы культивировали в течение 72 часов в BM с последующей фиксацией и окрашиванием DAPI, как описано выше, и конфокальной визуализацией (увеличение × 20, интервалы 1 мкм) в каналах FITC, DAPI и TRITC для визуализации клеток, соответствующих ядер и нановолокна.

Для оценки клеточной инфильтрации в нановолоконные каркасы, пористость каркаса, диаметр ядра и глубина ядерной инфильтрации были количественно определены для каждой экспериментальной группы ( n = 3 каркаса / группа). Для оценки пористости каркаса размер пор и долю площади определяли с использованием центрального среза z — из канала TRITC ( n = 3 z — стопок / группа), где области без волокон рассматривались как поры (области <20 мкм ² считались артефактами и исключены из анализа).Средний диаметр дискретных пор и средний диаметр ядер, проецируемых в 2D, были измерены с помощью программного обеспечения для обработки изображений Fiji и плагина Local Thickness. Инфильтрацию клеток в электроспряденные волокнистые каркасы оценивали путем количественного определения глубины инфильтрации ядра, определяемой как расстояние между апикальной поверхностью каркаса и z -центроидным местоположением ядра ( n = 20 клеток / группа). Первое место z , где сигнал волокна был обнаружен под ячейкой, было определено как апикальная поверхность субстрата.Ядро z -центроид определяли с помощью плагина BoneJ Particle Analyzer ⁵⁰ . Клетки, расположенные внутри перфораций или дефектов каркаса, исключались из анализа.

Активность биомолекул

Нановолоконные каркасы PCL / PEO / HA с коллагеназой или без коллагеназы во фракции PEO инкубировали в буфере Triton-Tris-Calcium (TTC; 0,05 об.% Triton X 100, 50 мМ трис-гидрохлорида, 1 мМ кальция. хлорид, pH 7,4) в течение 2 ч при перемешивании для быстрого растворения PEO и высвобождения коллагеназы.Релизат собирали и активность коллагеназы анализировали, добавляя 50 мкл в лунку 96-луночного планшета с субстратом флуорогенного пептида, чувствительного к матриксным металлопротеиназам (Mca-PLGL-Dpa-AR-Nh3; R&D Systems), до конечной концентрации 10 мкМ пептидный субстрат. Было проведено исследование кинетики флуоресценции при возбуждении / испускании 320/405 нм с непрерывной записью в течение 5 минут, и было проведено сравнение с контролями коллагеназы для определения активности, и общее количество коллагеназы, высвобожденной из каждого образца, было измерено с использованием оптической плотности ( n = 5 / группа).В качестве дополнительной меры биоактивности коллагеназы скаффолды инкубировали в присутствии 4 мм цилиндрических образцов суставного хряща, выделенных из канавки трохлеарной канавки молодых бедренной кости крупного рогатого скота в BM при 37 ° C ( n = 4 / группа). Через 72 часа ткань подвергали криосрезу (толщиной 16 мкм) и окрашивали альциановым синим для визуализации содержания протеогликана с помощью оптической микроскопии.

Для оценки биологической активности PDGF-AB, миграцию менисковых клеток (P1) и пролиферацию клеток определяли в присутствии рилизата из нановолоконных каркасов.Каркасы стерилизовали под бактерицидной лампой, инкубировали в LM при 37 ° C, собирали рилизат и замораживали через 1, 3 и 7 дней для анализа. Миграцию менисковых клеток количественно оценивали с использованием того же 96-луночного набора для анализа миграции Transwell (96-луночный анализ миграции Chemicon QCM, EMD Millipore), описанного ранее ( n = 5 / группа). Пролиферацию менисковых клеток оценивали с помощью набора для анализа на бромдезоксиуридин (BrdU) (Abcam) в соответствии с инструкциями производителя с использованием 96-луночного планшета, где 5000 клеток высевали на лунку в BM и инкубировали в течение ночи для адгезии ( n = 5 / группа ).После этого добавляли 100 мкл рилизата и количественно определяли пролиферацию клеток через 24 часа.

Модель подкожного ксенотрансплантата in vivo

Для оценки влияния каркасов на восстановление мениска в условиях in vivo использовали модель ксенотрансплантата голой крысы ⁹ . Все процедуры были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Медицинского центра капрала Майкла Кресенца. Взрослые эксплантаты мениска крупного рогатого скота (диаметр 8 мм, высота 4 мм, n = 3 донора) были разрезаны для создания горизонтального дефекта (рис.5а). Дефект был либо оставлен незаполненным (Пустой), либо заполнен одним из четырех нановолоконных каркасов (рис. 5b): PCL / PEO / HA (каркас), PCL / PEO / HA с коллагеназой во фракции волокон PEO (каркас + C), PCL / PEO / HA с PDGF-AB во фракции волокон HA (каркас + P) и PCL / PEO / HA с коллагеназой и PDGF-AB (каркас + C + P). Каркасы (толщиной ~ 0,5 мм) разрезали до диаметра 6 мм с центральным отверстием диаметром 2 мм для обеспечения контакта ткани с тканью внутри репарационной конструкции и стерилизовали под бактерицидным светом перед использованием.Нагрузка биомолекул составила ~ 173 мкг коллагеназы и / или ~ 242 нг PDGF-AB на каркас (~ 2,14 мг). Дефекты закрывали рассасывающимися швами перед подкожной имплантацией самцам бестимусных голых крыс ( n = 5; Hsd: RH-Foxn1 ^rnu , возраст 8–10 недель, ~ 300 г, Харлан). Крыс анестезировали изофлураном, спину брили и промывали этанолом и бетадином. На каждом животном делали четыре разреза (по одному на краниальном и каудальном аспектах, с каждой стороны от средней линии) и формировали подкожный карман с помощью тупого рассечения.По одной рандомизированной ремонтной конструкции на группу помещали в каждый карман, и разрез закрывали зажимами для ран.

Через 2 и 4 недели крыс умерщвляли удушением CO ₂ , и конструкции удаляли из подкожной ткани. Полученные образцы заливали парафином, делали срезы толщиной 8 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) для определения морфологии ткани, Picrosirius Red (PSR) для коллагена или DAPI для ядер клеток. Чтобы оценить клеточность, интенсивность клеточного сигнала относительно границы раздела была определена количественно путем преобразования ядерного сигнала DAPI в белый (интенсивность = 255) и фона в черный (интенсивность = 0) с помощью ImageJ, как описано ранее ⁹ .Затем интенсивность пикселей относительно границы раздела усреднялась, начиная от границы раздела до расстояния 500 мкм, перпендикулярного дефекту. Интенсивность сигнала DAPI по отношению к местоположению была разделена на интервалы 100 мкм и нормализована к значению незаполненного дефекта (Пустой) на границе раздела ( n = 4–5 / группа). Средняя интенсивность сигнала DAPI внутри каркаса была определена как средний сигнал трех интервалов по 100 мкм в самой центральной части каркаса, покрывающих толщину 300 мкм.Инфильтрацию клеток в каркас измеряли путем деления максимального расстояния инфильтрации в каркас на общую толщину каркаса в случайно выбранной точке вдоль каркаса в полных сечениях H&E ( n = 4–5 / группу, в среднем 10 измерений на образец).

Интеграцию тканей количественно оценивали путем деления совокупной длины интегрированных сегментов (на основе качественной адгезии между слоями нативной ткани и / или каркаса) на общую длину дефекта, измеренную в полных сечениях H&E.Наконец, была проведена иммуногистохимия для определения отложения коллагена типа I и II ⁹ . Регидратированные депарафинизированные срезы подвергали извлечению антигена протеиназы К в течение 15 минут при 37 ° C, а затем инкубировали либо с первичными антителами к коллагену типа I (10 мкг / мл; Millipore), либо с типом II (10 мкг / мл; банк гибридом исследований развития, University of Iowa) в течение ночи при 4 ° C. После промывания сигнал детектировали с помощью системы вторичного обнаружения иммунопероксидазы (EMD Millipore) в соответствии с протоколом производителя.ImageJ использовали для идентификации отдельных областей, которые окрашивались положительно на коллаген типа II, и среднюю интенсивность сигнала в 3 центрально расположенных интервалах внутри каркаса количественно оценивали с использованием описанного выше протокола ( n = 3 / группа).

Статистика

Все статистические анализы были выполнены с использованием SYSTAT. Достоверность оценивали с помощью одно- или двустороннего дисперсионного анализа с апостериорным тестом HSD Тьюки, где значение p <0,05 считалось значимым. В частности, для анализа DAPI группы и расстояние между ячейками сравнивались с помощью двухфакторного дисперсионного анализа.Данные представлены как среднее значение ± стандартное отклонение, если не указано иное.

Доступность данных

Все соответствующие данные доступны у соответствующих авторов.

MLB Гонка за награды MVP: Шохей Отани — фаворит AL

Гонка за MVP начинает приобретать форму, когда мы вступаем в последний уик-энд мая. У Майка Траута был лучший сезон до того, как из-за деформации икр он попал в список травмированных, вероятно, до середины июля или августа. В его отсутствие другой Ангел стал фаворитом AL MVP.Между тем у гонки NL соперников больше.

Sports Illustrated обозреватели бейсбола взглянули на MVP каждой лиги после первых двух месяцев сезона.

Роберт Бек / Sports Illustrated

Том Вердуччи

Американская лига: Шохей Отани

MVP за два месяца AL — Шохеи Отани из Ангелов. Не говори мне, что Ангелы плохо выступают и их защита ужасна. То, что делает Отани, почему-то недооценивают.Его достижения в качестве нападающего и питчера настолько необычны, что конкурентоспособность его команды не имеет значения.

Национальная лига: Рональд Акунья-младший

В NL я даю преимущество Рональду Акунье-младшему над Фернандо Татисом-младшим хотя бы из-за объема. Акунья, лидер хоумрана, сыграл еще 12 игр, что составляет более 25% отставания в это время года.

Стефани Апштейн

Американская лига: Shohei Ohtani

Ни FanGraphs, ни Baseball-Reference WAR не согласны со мной здесь, но пока трудно не выбрать Охтани.Он появился в 47 из первых 50 игр Ангелов, и у него есть 154 OPS + и 187 ERA +. Он также является событием каждый раз, когда что-то делает. Если он останется здоровым, это будет самый впечатляющий сезон для бейсболиста.

Национальная лига: Макс Манси

Я возьму Макса Манси на волосок от Ника Кастелланоса, главным образом потому, что Манси сыграл еще пять игр, а в сезоне, когда, казалось бы, все постоянно травмировались, я просто думаю стоять на поле как можно чаще — это огромная услуга для вашей команды.Особенно, если у вас OBP 0,450!

Эмма Бакчеллиери

Американская лига: Шохеи Отани

Хотя я действительно думаю, что здесь есть еще несколько интересных кандидатов — особенно выделяются Владимир Герреро-младший и Байрон Бакстон — я не понимаю, как вы можете пойти с кем-то другим чем парень, делающий то, чего не видели уже столетие. Это может измениться, если он не может оставаться здоровым или если команда решит быть более осторожной с его использованием, но на данный момент я не могу отказаться от OPS + более 150 и ERA + более 180.

Карим Эльгазар / США СЕГОДНЯ Sports Network

Национальная лига: Ник Кастелланос

Он лидирует в лиге по множеству атакующих категорий, и хотя его защита, конечно, не приносит здесь большого значения, это также не вычитая много в этом сезоне, что представляет собой улучшение по сравнению с прошлыми годами. Этого достаточно, чтобы я чувствовал себя в безопасности, выбирая его, а не Макса Манси — хотя, если оба продолжат так бить, это должно стать интересной гонкой на протяжении всего лета.

Will Laws

Американская лига: Shohei Ohtani

Тот факт, что оба нынешних фаворита играют за команды ниже 0,500, примечателен, даже если это больше не имеет значения для избирателей. На фоне еще одного неудачного сезона в Анахайме, который на этот раз стал еще более болезненным из-за потери Майка Траута, один человек сделал все возможное, чтобы удержать на плаву как атаку, так и ротацию «Ангелов». Шохей Отани лидирует в лиге по добавленной вероятности победы (2,0) — и это без учета его подачи! Он уступает только Владимиру Герреро-младшему.в хоум-ранах и уступает только Шейну Биберу в аутах за девять подач (мин. 30 поданных подач). Помимо цифр, необходимо учитывать степень трудности уравновешивания действия, которое никто в бейсболе не делал на протяжении более столетия. Если Охтани продолжит свой темп — и даже если он немного замедлится, — это будет год, когда мы помните его двусторонние подвиги.

Дейл Занин / США СЕГОДНЯ Спорт

Национальная лига: Рональд Акунья-младший

Рональд Акунья-младший не в активе в сезоне 40–40, но он идет в ногу с клубом 50/20, который в составе четырех человек (Алекс Родригес, Кен Гриффи-младший., Брэди Андерсон, Уилли Мейс) в равной степени эксклюзивен. 23-летний игрок всегда сильно и далеко отбивал мяч во время своего пребывания в мейджоре, но более дисциплинированный подход к пластине привел к значительному снижению его количества аутирующих в эпоху, которую особенно сложно достичь. В результате он стал самым грозным нападающим Национальной лиги. Он безраздельно властвует как в традиционной статистике (15 лучших хоум-ранов по безлимитной гонке), так и в показателях Statcast, занимая 97-й процентиль средней скорости выхода, процента сильных ударов, ожидаемого среднего показателя, ожидаемого процента отбрасывания, скорости преследования и скорости спринта.Он был немного ниже среднего в защите, но все же намного лучше, чем Фернандо Татис-младший (MLB-high 12 ошибок), которого эксперты считают его ближайшим конкурентом на эту награду.

Мэтт Мартелл

Американская лига: Шохеи Отани

В какой-то момент вы просто должны вручить награду человеку, у которого самый выдающийся сезон, независимо от того, чем занимается его команда. Как уже отмечалось выше, Отани — один из лучших нападающих в бейсболе (154 OPS +) и самых эффективных питчеров (187 ERA +).Теперь представьте, что Ангелы играют без Майка Траута следующие несколько месяцев, а Энтони Рендон борется (75 ОПС +). Все это говорит о том, что другой лидер, Владимир Герреро-младший, является лучшим нападающим в бейсболе на данный момент (204 ОПС +) и без Джорджа Спрингера держит «Блю Джейс» на плаву на Востоке Альберта. Кроме того, не спите об Аароне Джадже, у которого лучший год с тех пор, как он выиграл новичок года 2017. Но самое главное — он оставался здоровым.

Камил Крзачинский / USA TODAY Sports

Национальная лига: Крис Брайант

Брайант вернулся, детка.Вступая в эти выходные, NL MVP 2016 сокращает 0,320 / .405 / .604 с 11 хоум-ранами и 182 ОПС +. Он делает это, играя роль суперпользователя для Детенышей. Вот его список позиций по 46 играм, сыгранным в этом сезоне: 3B (15 игр), LF (14), RF (12), CF (8), 1B (6). Детеныши всего на половину отстают от Кардиналов в Центральном лиге, и возрождение Брайанта — большая причина, по которой Чикаго находится в решающей схватке. Среди других кандидатов на звание MVP — Рональд Акунья-младший, Фернандо Татис-младший, Ник Кастелланос и Нолан Аренадо.

Ник Селби

Американская лига: Шохеи Отани

Как бы странно ни казалось команде, которая парит на последнем месте, иметь кандидата на звание MVP в своем составе, еще более странно, что это не Майк Траут. Отани делает то, чего не видели больше века. Он возглавляет AL по дополнительным базовым хитам, занимает второе место по проценту пробок и третье место по хоум-ранам, имея 2,37 ЭРА и 45 аутов через 30 1/3 подач. Если он будет поддерживать что-то близкое к этому показателю в течение всего сезона, например, из 550 выступлений на тарелках и 20 стартов, он должен легко выиграть награду.

Национальная лига: Крис Брайант

Жалкий сезон Брайанта 2020 года теперь кажется древней историей, когда бывший MVP сыграл, пожалуй, лучший бейсбол в своей карьере. Он был лучшим нападающим в NL (182 OPS +) и вернул «Кабс» в игру плей-офф после неудачного старта. Победа Брайанта сделала бы его седьмым игроком, когда-либо получившим награду «Новичок года» и нескольких MVP. В эту группу входят Уилли Мэйс, Фрэнк Робинсон, Джонни Бенч, Альберт Пуйольс, Кэл Рипкен-младший.и Майк Траут — неплохая компания, чтобы присоединиться к свободному агентству.

Майкл Шапиро

Американская лига: Владимир Герреро-младший

Мне больно не выбирать Шохеи Отани здесь, хотя, в конечном счете, блестящая пластинка Герреро-младшего принесла больше пользы, чем двусторонняя блеск. Влад-младший лидирует в бейсболе в WAR со значительным отрывом, и он входит в пятницу, лидируя в AL по Хомерсу, ИКР, пробивке и ОПС. Ohtani выпустил 15 завораживающих закусок.Его летучие мыши нужно смотреть по телевизору. Тем не менее, он пока добавил только 30 иннингов на насыпи, а Лос-Анджелес не смог извлечь выгоду из его старта за последние месяцы. Отани — величайший талант в бейсболе, и он вполне мог продолжить этот бурный темп на пути к MVP. Но было бы несправедливо не признать доминирующее начало Герреро по мере приближения Дня памяти.

Венделл Круз / США СЕГОДНЯ Sports

Национальная лига: Рональд Акунья-младший

Показатели Криса Брайанта за последний месяц упали после доминирующего апреля, не оставив явного фаворита в многолюдном поле.Ник Кастелланос измельчает все, что находится в поле зрения. Нолан Аренадо был настолько хорош, насколько рекламировали в Сент-Луисе. У меня есть искушение выдвинуть полусерьезные доводы в пользу Джейка Кроненворта, который, возможно, был лучшим игроком лучшей команды Национальной лиги. Но я выберу Акунью-младшего, когда май подходит к концу. Он был единственным постоянным источником нападок для состава, который еще не нашел своего желаемого, победив 15 Хомеров в своих первых 44 играх и показав 0,990 ОПС. Акунья снизил процент вычётов с 29 до 18,3%.7% в прошлом году; и он публикует лучшие показатели скорости выхода за всю свою карьеру. Нет игрока, из которого я бы предпочел построить команду на следующее десятилетие.

Больше покрытия MLB:
• А вот и детеныши. Но как долго?
• Джави Баэс бросает вызов логике с нелепым басернингом
• Неустойчивое дело Джо Райана и бывших питчеров из колледжа
• Не хвалят лучей за то, что они не потратили