Гк компромисс: Квартиры в Севастополе и Крыму недорого, новые квартиры в Cевастополе цены, недвижимость в Крыму для россиян, купить новую квартиру в Севастополе

>

Застройщик Компромисс в Севастополе — новостройки на сайте от официального застройщика Компромисс, объекты недвижимости

ЧП Компромисс, а ныне — Группа компаний Компромисс, было создано в 2003 году. Цель создания ЧП — работа со всеми видами недвижимости и операции с ними: продажа, управление, строительство.

Почти десять лет назад мы начинали с того, что занимались индивидуальным строительством и реализацией объектов недвижимости. 10 лет прошли и эти 10 лет в корне изменили рынок недвижимости Украины, Крыма и Севастополя в частности. Мы пережили взлет курса доллара, коренные изменения в государственных структурах, кризис 2009 года и с каждым годом становились только сильнее.

ЧП Компромисс никогда не ограничивалось тривиальной схемой «купи-продай» или посредническими услугами, нет, вектор работы постоянно менялся: расчетливое инвестирование, работа с коммерческой недвижимостью, разработка и предварение в жизнь самых амбициозных строительных проектов. В этом есть большая заслуга руководства Группы компаний Компромисс. Высокие профессиональные качества, отношение к работе и организаторский талант являются тем фундаментом на основе которого построен «Компромисс». Всегда быть первым и сильным, идти в ногу со временем — вот девиз организации, заложенный ее основателем. Именно ЧП «Компромисс» стало одной из первых организаций в Севастополе, начавших работу с недвижимостью и продвижение своих услуг в глобальной сети Интернет, автоматизировавшей процесс обработки, анализа и хранения данных, связанных с недвижимостью, на основе печатных СМИ, но уже в цифровом, электронном виде. Анализ потребностей рынка, емкие и лаконичные отчеты — это ежедневная трудоемкая, но такая необходимая работа для процветания компании.

Группа компаний Компромисс воспитала уже не один десяток специалистов широкого профиля. Это инженеры и юристы, строители и менеджеры, архитекторы и проектировщики, управленцы и рекламные агенты, и все это — в одном лице! Директор компании своим примером задает высокую планку. В компании постоянно, ежедневно идет освоение сотрудниками необходимых знаний. Здесь нет узкой европейской специализации. Сотрудники компании со временем могут самостоятельно создавать и вести строительный объект до логического завершения.

Что же представляет из себя группа компаний Компромисс на сегодняшний день? Это инвестиционно-строительная компания в управлении у которой более десяти объектов строительства микрорайонов многоэтажных жилых домов, а на реализации — самые большие торговые центры города Севастополя. Это только за последний год четыре крупных объекта, которые мы сопровождаем были введены в эксплуатацию. Из них: два вовремя, два досрочно!

Мы занимаемся именно той, девелоперской, деятельностью, которой так не хватает на сегодняшний день. Мы тесно взаимодействуем с такими организации, как строительная компания ООО «Арди», проектная организация «АрхиградПроект», ЧП «Дунайэнергоальянс». В то время, когда не строит только ленивый, а достраивает только опытный и сильный, — нужны девелоперские компании, такие, которые своей работой доказали свою успешность и смогут создать, воплотить в жизнь и реализовать любой объект.

Партнерами группы компаний «Компромиcc» являются: большой авторитет в сфере архитектуры — «Архиград Проект», мощная строительная компания ООО «Арди» и, конечно, организация, которая всегда «дотянет» коммуникации — ЧП «Дунайэнергоальянс».

Нам есть, что предложить инвесторам: крупные проекты, как жилой, так и коммерческой направленности. Кроме этого мы сами готовы рассматривать предложения о сотрудничестве и об инвестициях в ваши проекты.

Символика группы компаний Компромисс — сама гармония «Инь и Янь», а название говорит само за себя. Без компромисса не может быть успешных проектов, но есть мы, а, значит, — все получится.

в каких ситуациях стоит возвращать бывших сотрудников? — Реальное время

Как правило работодатель с опаской относится к идее возвращать специалиста в покинутое «гнездо».

Хотя такая ситуация не редкость и для обозначения «возвращенцев» даже существует специальный термин — «сотрудник-бумеранг».

Останавливает прежде всего эмоциональный фактор. Руководители часто воспринимают увольнение сотрудника как предательство. Им трудно начать заново доверять такому бумерангу, ведь он может снова «сбежать» в неподходящий момент, особенно в кризисной ситуации.

Поэтому в вопросе о возвращении бывшего сотрудника многое зависит от того, как он покинул компанию — мирно и экологично или подвел команду своим уходом.

Однако в тех случаях, когда работодатель может «смотреть шире» и готов принять специалиста назад, есть много положительных моментов для обеих сторон:

Сотрудник получил новый опыт извне и может привнести что-то новое в компанию. Он сможет свежим взглядом посмотреть на процессы и предложить новые решения, что трудно сделать лояльным сотрудникам, работающим в привычной обстановке много лет.

Также плюсом является экономия на рекрутменте и адаптации. Бумерангу не требуется время на обучение, работодатель знает, какие задачи ему можно поручить.

Возвращение специалистов повышает бренд компании, т. к. свидетельствует о лучших условиях в сравнении с конкурентами.

Главным плюсом я считаю лояльность вернувшегося сотрудника. Возобновление трудовых отношений — это осознанный шаг, и работник чувствует благодарность за оказанный ему кредит доверия. Как правило, такой сотрудник старается оправдать хорошее к себе отношение. На это влияет и некоторое чувство вины, и желание вновь завоевать утраченные позиции.

Плюсов действительно много, поэтому не стоит бояться возвращать ценные кадры «домой».

Перспективным экс-сотрудникам стоит напоминать, что их возвращению будут рады, например звонить раз в полгода — год, и давать понять, что готовы снова работать с ними.

Конкуренты часто переманивают кадры, преувеличивая достоинства новой позиции. В действительности все может оказаться куда менее привлекательным. И обманутый в ожиданиях сотрудник уже хотел бы вернуться назад, поэтому подобные напоминания могут стать триггером для возвращения.

Результаты поиска работодателя «Автомобили, запчасти, автохимия » — Страница 142

Список работодателей Всего: 1987

ооо гидротех

Основное название: ооо гидротех
Другие названия: ленинградское шоссе 300
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Описание деятельности: установка кму

ООО ГК Компромисс

Основное название:
ООО ГК Компромисс

Другие названия: ООО Механик, ТСК Компромисс
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Сайт: tsk-k. ru
Страна: Россия
Регион работы: Москва
Рейтинг компании:
Описание деятельности: Продажа запасных частей для спецтехники

ООО Гринэкс

Основное название: ООО Гринэкс
Другие названия: Представительство Mercedes-Benz в России
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Сайт: www.mercedes-mbr.ru
Страна: Россия
Регион работы: Москва
Описание деятельности: Автосалон

ооо Грузомобиль-Питер

Основное название:
ооо Грузомобиль-Питер

Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регион работы: Санкт-Петербург
Рейтинг компании:

ООО Группа компаний Мега-Авто

Основное название: ООО Группа компаний Мега-Авто
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Сайт:
www. megaavto.com

Страна: Россия
Регионы работы: Москва, Санкт-Петербург
Рейтинг компании:
Описание деятельности: Продажа и обслуживание автомобилей. Официальные дилеры.

ООО ГУДОКРЕНТ

Основное название: ООО ГУДОКРЕНТ
Другие названия: GOODOKRENT
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регион работы: Москва
Описание деятельности: Автопрокат

ООО Дельта-Авто

Основное название: ООО Дельта-Авто
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регион работы: Москва
Описание деятельности: автосалон метро Алма-Атинская

ооо денса трак

Основное название: ооо денса трак
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регион работы: Екатеринбург
Рейтинг компании:
Описание деятельности: Эта шарашкина конторка, еще себя позиционируют как единственный поставщик грузовых автозапчастей на урале. Ищут кладовщика, при чем без разницы мужчина или женщина, обещают график 2/2 с 9 до 21ч.при зп в 30,000 р. По факту официально не трудоустраивают, по договору подряда. За полтора года семь кладовщиков сменилось. Хотя соискателю этого не скажут на собеседовании, от работников узнаете только, но зато пообещают золотые горы. Генеральный директор с утра до ночи сидит в камерах смотрит кто чем занимается видимо других дел нет. Чай, кофе и даже воду покупают работники вскладчину, мне об этом сказали в…

ООО ДЕПП-АТ

Основное название: ООО ДЕПП-АТ
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регион работы: Москва
Рейтинг компании:

ООО Дженсер Сервис

Основное название: ООО Дженсер Сервис
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регион работы: Москва
Рейтинг компании:
Описание деятельности: ООО «Дженсер Сервис»

Результаты поиска работодателя «Автомобили, запчасти, автохимия » — Страница 141

Список работодателей Всего: 1987

ООО ВЕЛОсити

Основное название: ООО ВЕЛОсити
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Сайт: www. velocityk.ru
Страна: Россия
Регион работы: Москва
Рейтинг компании:
Описание деятельности: Продажа мото-велотехники. Эксколюзивный дистрибъютор мототехники SYM в России

ООО Вирбак автомастер

Основное название: ООО Вирбак автомастер
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регионы работы: Воронеж, Краснодар, Ростов-на-Дону
Рейтинг компании:
Описание деятельности: Розничная торговля АКБ, дисков т.д. и сервисное обслуживание автомобилей

ООО Висма

Основное название: ООО Висма
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регион работы: Челябинск
Рейтинг компании:
Описание деятельности: Оптовая фирма по продаже автохимии и автомасел, на рынке более 10 лет

ООО ВО Автотехноимпорт

Основное название: ООО ВО Автотехноимпорт
Другие названия: мастер
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Описание деятельности: перевозка автомобилей

ООО Волга-Раст

Основное название: ООО Волга-Раст
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Сайт: www. volga-rast.ru
Страна: Россия
Регионы работы: Москва, Волгоград
Рейтинг компании:
Описание деятельности: официальный дилер таких компаний, как Volkswagen, SKODA, Renault, Honda и Suzuki,

ООО Восток Лада

Основное название: ООО Восток Лада
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регион работы: Москва
Рейтинг компании:
Описание деятельности: Дилер Автоваз

ООО Восток-Лада

Основное название: ООО Восток-Лада
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регион работы: Челябинск
Рейтинг компании:

ООО Все авто

Основное название: ООО Все авто
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Страна: Россия
Регион работы: Саранск

ООО Гарант

Основное название: ООО Гарант
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Сайт: garant777. ru
Страна: Россия
Регион работы: Москва
Описание деятельности: ООО «Гарант» предлагает оригинальные запасные части для сельхозтехники в Москве. В наличии запчасти к посевной, почвообрабатывающей, кормоуборочной, зерноуборочной, сеноуборочной и прочей технике. Производим доставку в Рязань и прочие города России.

ООО Гидравия

Основное название: ООО Гидравия
Сфера деятельности: Торговля: Автомобили, запчасти, автохимия
Сайт: hydravia.ru
Страна: Россия
Регионы работы: Москва, Санкт-Петербург, Кемерово
Рейтинг компании:

Страсти по сурими/ от Максима Трало

 

 

Рынок сурими-продуктов, который в России в основном представлен крабовыми палочками, в 2014 году ожидает стагнация. Причиной этому стало желание потребителей разнообразить свое рыбное меню. Впрочем, производителей в наступившем году должен волновать не только спад интереса к готовой продукции. В России практически нет компаний, способных в промышленных масштабах производить само сурими.

Следует пояснить, что сурими  — это белковая масса, изготовленная из рыбных тушек. При чем процесс производства высокотехнологичен – на качество конечного продукта влияют многие факторы, вплоть до разницы в градус в температуре используемой воды. И если вопрос строгого соблюдения технологии и отпугивает некоторые компании, то проблемы организации стабильных поставок рыбы заставляют большинство организаций отказываться от идеи изготовления сурими.

Отечественные поставщики не в состоянии полностью удовлетворить потребности производителей. Это связано и с нестабильным качеством предлагаемой рыбы и с ее высокой стоимостью. Но, пожалуй, основной проблемой остается дороговизна портовых обработок и бюрократические препоны. Многим рыбодобывающим компаниям проще продавать рыбу сразу за границу, даже без захода в российские гавани.

На этом фоне производителям крабовых палочек, гораздо легче сразу завести в страну уже готовое, замороженное сурими, и заняться лишь его обработкой. Отечественное происхождение имеют практически 90% крабовых палочек. При этом в России есть только один производитель полного цикла, который изготавливает и само сырье, и конечный продукт – «Карельский Комбинат».

К проблемам рынка в 2013 году добавилось и сокращение объемов продаж крабовых палочек. У потребителей появилась возможность расширить рыбное меню за счет других категорий морских продуктов: креветок, кальмаров и т.д.

При этом альтернативные сурими-продукты, такие как дим-самы, фиш-болы, распространенные в Азии, у отечественных покупателей пока не столь популярны. И если на Востоке их потребление превышает миллион тонн в год, то в России сурими-продукты занимают незначительную часть в общем объеме.

Несмотря на то, что многие потребители все чаще отдают предпочтение замороженным морепродуктам, крабовые палочки по-прежнему остаются востребованными. Крепкие позиции обусловлены низкой розничной стоимостью. Тенденция отказа от сурими-продуктов, бесспорно, существует, но относится скорее к крупным мегаполисам с высоким уровнем дохода. И именно поэтому расстановка сил на рынке производителей крабовых палочек в ближайшее время не изменится.

Так, главными игроками отрасли в России остаются 3 компании. Основную долю на рынке – около 40% — занимает литовская ГП  «Вичюнай», представленная торговой маркой VICI. Несмотря на свою прибалтийскую родословную основные производственные мощности компания расположила в Калининграде.

В тройку лидеров вошли и полностью отечественные производители: Карельский комбинат с 20% долей на рынке, и РОК-1 также с 20%. Остальные производителей, такие как «Санта-Бремор», «Меридиан» и «Альбатрос», делят между собой оставшиеся 10%.

Производственные показатели рынка сурими-продуктов продемонстрировали в 2013 году небольшое снижение, в пределах 10%. Так, ГК «Вичунай» выпустили порядка 30000 тысяч тонн сурими-продуктов, Рок-1 – 15500 тысяч тонн, «Карельский Комбинат» — 15000 тысяч тонн, общим объем продукции остальных игроков составляет порядка 15000 тысяч тонн.

Несмотря на пока стабильные показатели, производителям вряд ли стоит надеяться на увеличение объемов выпуска продукции. А получение прибыли станет вопросом поиска компромисса между качеством и стоимостью.

Однако и здесь не все так просто. На фоне общего снижения интереса потребителей к крабовым палочкам эксперименты с качеством могут обернуться значительным падением продаж. А соответственно удержание стабильно высокого уровня продукции при сокращении издержек является главной целью производителей на будущий год. При этом добиться таких показателей возможно лишь при наличии собственной независимой сырьевой базы, а эту задачу решить смогут далеко не все игроки рынка.

 

 

Гороскоп на 2022 год для всех знаков зодиака от Тамары Глобы: кому год Тигра приготовил перемены

В год Водяного Тигра многие знаки зодиака ждут стремительные и судьбоносные перемены. Одним удастся воплотить мечты в карьере, других ждет приятный сюрприз в личной жизни. Однако будут и трудности, с которыми необходимо справиться. Астролог Тамара Глоба рассказала, как не упустить свой шанс в 2022 году и добиться успеха. Прогноз опубликован на сайте 2022year.ru.

Овен

Год Тигра принесет Овнам стремительные перемены. Причем изменения окажутся позитивными. Первая половина года будет наполнена суетой, потребуется терпение и трудолюбие, чтобы упорядочить ход их жизни. Зимой даже может нахлынуть хандра и апатия.

Зато в этой суматохе будет появляться много новых возможностей и перспективных направлений, главное выбрать то, что принесет максимальный результат. Во второй половине года Овнов ожидает передышка и можно будет насладиться результатами.

Телец

В целом год будет благоприятен для Тельцов. Но кое-какие трудности все же будут. 

Тельцы могут столкнуться с предательством и разочарованием в людях – не стоит ждать от окружающих больше, чем то, на что они способны.

В отношениях может возникнуть напряжение в первой половине года. Важно не пытаться избегать конфликтов всеми способами, а вовремя обсудить ситуацию и найти компромисс.

Во второй половине года есть риск обострения хронических заболеваний, поэтому заранее позаботьтесь о здоровье.

Тамара Глоба рекомендует Тельцам, которые оказались в трудных жизненных обстоятельствах, заняться переоценкой ценностей и пересмотреть образ жизни. Привычные методы в этом году могут не работать. 2022 год – оптимальное время для перезагрузки и радикальных перемен в жизни.

Близнецы

В 2022 году Близнецы будут щедро вознаграждены за свои старания, удача будет сопутствовать во всех сферах жизни. Однако важно соблюдать баланс.

В любовных и дружеских отношениях ситуации могут обостряться, поэтому важно следить за своими словами и поступками, иначе могут вспыхнуть конфликты.

В карьере инициативность и активность помогут добиться значительных успехов.

В сфере финансов важно не терять здравомыслие – необдуманные импульсивные траты могут оказаться не оправданы.

2022 год станет для Близнецов периодом изобилия. Но в этот период нельзя упускать шансы и возможности, которые будут возникать на жизненном пути.

Рак

Раков ждут сложные моменты в жизни, которые заставят их сделать переоценку своих взглядов и ценностей. Упрямство, нежелание отказываться от своих ошибочных установок и паттернов мышления – главные ошибки Раков, которые могут привести в 2022 году к серьезным потерям в разных сферах жизни. Важно быть открытыми к переменам и готовым к компромиссу.

Лев

У Львов в 2022 году будут хорошие шансы реализовать свой потенциал. Нацеленные на дела и результаты представители знака будут щедро вознаграждены – их продвижение к цели будет проходить семимильными шагами. Судьба откроет возможности, которые позволят представителям этого знака выйти на новый уровень развития. Однако чрезмерная жесткость в общении и отношениях может навредить Львам и принести немало проблем. Постарайтесь не рубить с плеча. Важно уметь вовремя остановиться.

Дева

Если вы хотите начать свое дело или заняться новым проектом —  2022 год для этого лучшее время. Водяной Тигр щедро вознаградит за смелость. Также удача будет сопровождать тех Дев, которые решили кардинально изменить свою жизнь: найти новое место работы, переехать в другой город. Главное – прислушиваться к своему внутреннему голосу и взвешивать каждое решение.

В личной жизни, наоборот, стоит воздержаться от радикальных перемен. Даже если настигнет кризис в старых отношениях — не стоит сжигать мосты, так как это явление временное. Опрометчивые и необдуманные поступки могут привести к сильному разочарованию.

Весы

Весы увидят в этом году результат, пропорциональный вложенным усилиям. Деятельные Весы получат возможность многое приобрести. При этом бездеятельных и пассивных ждет стремительное движение вниз. Поэтому важно с первых дней наступившего года не расслабляться, а настроится на упорный труд.

2022 – это время раскрытия потенциала, обнаружения новых талантов и возможностей. Весы, которые сумеют подстроиться под энергетику Водяного Тигра, пройдут через 2022 год успешно и к концу года у них будет много достижений.

Скорпион

Скорпионы в 2022 году смогут взять ситуацию в свои руки. Им удастся справиться с трудностями, которые казались непреодолимыми ранее, поэтому возникнет иллюзия, будто бы все наладилось. Но расслабляться не стоит. 2022 год – это время, когда у Скорпионов будет возможность построить фундамент для счастливого будущего. Астролог Тамара Глоба рекомендует им трудиться, не покладая рук, и результат превзойдет все ожидания.

Во второй половине года Скорпионов ждет много новых впечатлений и знакомств. Одинокие женщины-Скорпионы встретят свою любовь, могут выйти замуж. Мужчинам же рекомендуется сосредоточиться на карьерных успехах или бизнесе.

Стрелец

Стрельцы будут загружены делами. Главное – строго придерживаться собственных приоритетов и целей, не позволять другим людям отвлекать от важного и уводить в другие направления от истинной цели. Стрельцы доверчивы, они очень легко подпадают под влияние со стороны, и нечестные люди могут воспользоваться этим. В 2022 году представителям этого знака нужно работать не только над целями, но и над собой. Можно найти новое хобби, пойти на курсы, освоить новое направление на работе.

На личном фронте Стрельцов ждет стабильность. Одинокие представители знака вряд ли найдут вторую половинку, хотя интересные знакомства все же не исключены. Те же, кто уже в браке, будут наслаждаться спокойной семейной жизнью.

Козерог

Козерогам стоит копить деньги в начале года и не делать крупных покупок. Начиная с июня у Козерогов появится много возможностей для финансового роста и успеха, но это потребует немалых вложений.

В карьере Козерогов ждет немало вызовов, и в зависимости от того, как человек будет реагировать на них, он либо добьется успеха и роста, либо лишится и того, чего уже достиг. Деятельные и активные представители знака смогут получить результаты, на которые они даже не рассчитывали, а пассивных Козерогов ждет разочарование и крах.

В личной жизни не предвидится крупных потрясений, но Козерогам нужно развивать чувство такта. Упрямство, непримиримость к мнениям других людей и черствость могут разрушить даже проверенные временем отношения.

Водолей

Водолеев в 2022 году ждет серьезный финансовый прорыв. Год Тигра откроет представителям этого знака множество новых возможностей, главное – не пропустить их. В 2022 году также намечается карьерный рост – мужчины-Водолеи могут легко занять должность о которой давно мечтали.

В семейных отношениях Водолеев ожидает гармония и любовь. Все проблемы останутся в прошлом, но придется над этим потрудиться. Искренность и бережное отношение друг к другу помогут сохранить любовь и доверие.

Рыбы

Год в целом будет удачным для Рыб. Представителям этого знака необходимо меньше нервничать и позволять себе иногда отдыхать, иначе могут возникнуть проблемами со здоровьем. Удача будет сопровождать женщин-Рыб, обстоятельства будут складываться случайным образом так, что все обернется к лучшему.

Также звезды пророчат представителям этого знака финансовый успех, но добиться его смогут только те, кто осмелится рискнуть и доверится собственной интуиции. Консервативные и нерешительные представители знака не смогут оставить свой старый, привычный образ мышления и действий, поэтому проигнорируют подаренные судьбой шансы.

Напомним, ранее астролог назвал два знака зодиака, которые встретят свою любовь в 2022 году.

Почему я должен идти на компромисс, чтобы оформить развод?

7 мая 2019 г. | Сценарий: Дайана Н. Фредерикс, эсквайр. | Поделиться

Приблизительно 97% дел о разводе урегулируются. Урегулирование может быть легко достигнуто на ранних стадиях дела или накануне суда, но более вероятно, что оно произойдет в какой-то момент каждого бракоразводного процесса. Чтобы произошло урегулирование, ОБЕ стороны должны прийти к компромиссу. Нередко обе стороны чувствуют, что они «уступили» или пошли на компромисс больше, чем другая. И, конечно же, есть определенные случаи, когда одна из сторон может быть более разумной или готовой пойти на компромисс, чтобы заключить развод (или завершить дело).

Иногда клиенты неправильно понимают компромисс и считают, что их адвокат недостаточно защищает или «борется» за них. Тем не менее, попытка найти решение или золотую середину часто необходима, чтобы прийти к выводу путем урегулирования и избежать чрезмерных затрат (эмоциональных и финансовых) на судебные разбирательства.Клиенты часто заявляют, что они «просто хотят, чтобы все было сделано», но они могут не желать идти на компромисс по малейшим вопросам. Это сложная позиция для примирения адвоката.

Если ваш адвокат рекомендует какой-то образ действий, это должно происходить потому, что он или она считает, что это отвечает вашим интересам, и иногда это не обязательно означает, что это справедливо. Конечно, ваш адвокат должен сообщить вам об этом и убедиться, что вы понимаете причину рекомендации.

Например, может показаться несправедливым согласиться «отказаться» от предмета мебели, когда ваш супруг сохраняет за собой дом, однако ваш адвокат может посоветовать вам сделать это, поскольку стоимость предмета спора слишком велика. меньше, чем судебные издержки, которые будут понесены в связи с этим.

Совет, который иногда является самым практичным, может показаться несправедливым или разумным, но не путайте недостаток защиты с практичностью, если это то, чего вы добиваетесь. Если вы хотите, чтобы ваш адвокат защищал «вещь», то вы должны быть готовы к последствиям, которые могут означать отмену мирового соглашения или начало судебного разбирательства и дополнительные судебные издержки. Семейное право представляет собой сложную головоломку. Каждая часть головоломки каким-то образом связана. Поэтому, когда вы перемещаете часть головоломки, возможно, придется переставить всю головоломку и собрать ее обратно тем же или другим способом, чтобы все части соединились вместе.

По моему опыту, этот спор о «вещах» часто происходит в одиннадцатый час, когда происходит завершение урегулирования. Я подозреваю, что иногда реальный конец и реальность закрытия вызывают у людей реакцию. Иногда «вещи» могут быть отодвинуты в сторону или отодвинуты на второй план, в то время как в центре внимания находятся «большие» проблемы, такие как алименты. Иногда это могут быть «вещи», которые создают/нарушают соглашение, особенно если одна сторона (или обе) считают, что они уже дали слишком много.

Обе стороны должны пойти на компромисс, чтобы сэкономить судебные издержки и прийти к заключению. Может случиться так, что одной стороне придется пойти на больший компромисс, чем другой стороне, чтобы добиться решения. Возможно, это даже проявилось во время брака и является одной из причин вашего развода. Может случиться так, что немедленный компромисс сейчас сэкономит вам судебные издержки и эмоциональные потрясения в будущем. «Вещи» часто можно заменить, а потерянное время и судебные издержки — нет.

Важная роль опытного юрисконсульта состоит в том, чтобы помочь обеспечить реалистичность ваших ожиданий.Если вы не последуете совету своего адвоката о компромиссе, вы можете сделать это себе во вред.

 

Диана Фредерикс, эсквайр. , является партнером компании Gebhardt & Kiefer, PC и занимается исключительно вопросами семейного права. Она является сертифицированным адвокатом по семейным делам и была включена в список восходящих звезд NJ Super Lawyers в практике семейного права Thomson Reuters в 2015, 2016, 2017, 2018 и 2019 годах, а также в список новых лидеров адвокатуры. в юридическом журнале Нью-Джерси в 2015 году.Свяжитесь с г-жой Фредерикс для консультации по телефону 908-735-5161 или по электронной почте .

Если у вас есть предложения по будущей теме блога, отправьте их через форму обратной связи.

Дело о привлечении и компрометации JSTOR

Абстрактный

Опираясь на предыдущие исследования, в этой статье предлагается, чтобы поведение выбора в условиях неопределенности предпочтений было легче объяснить, если предположить, что потребители выбирают альтернативу, подкрепленную вескими причинами. Такой подход дает объяснение так называемому эффекту притяжения и приводит к предсказанию эффекта компромисса. В соответствии с гипотезами результаты показывают, что (1) бренды имеют тенденцию увеличивать долю, когда они становятся компромиссными альтернативами в наборе вариантов; (2) эффекты притяжения и компромисса, как правило, сильнее среди субъектов, которые рассчитывают оправдать свои решения перед другими; и (3) выбор доминирующих и компромиссных брендов связан с более сложными и сложными решениями.

Информация о журнале

Журнал потребительских исследований, основанный в 1974 году, публикует научные исследования, описывающие и объясняющие поведение потребителей. В этом междисциплинарном журнале представлены эмпирические, теоретические и методологические статьи, охватывающие такие области, как психология, маркетинг, социология, экономика и антропология. Основная направленность JCR — академическая, а не управленческая, с темами, варьирующимися от процессов на микроуровне (например, до процессов на микроуровне). например, выбор бренда) до вопросов более макроуровня (например, развитие материалистических ценностей).

Информация об издателе

Издательство Оксфордского университета является подразделением Оксфордского университета. Он способствует достижению цели университета в области передового опыта в исследованиях, стипендиях и образовании, публикуясь по всему миру. OUP — крупнейшее в мире университетское издательство с самым широким глобальным присутствием. В настоящее время он издает более 6000 новых публикаций в год, имеет офисы примерно в пятидесяти странах и насчитывает более 5500 сотрудников по всему миру.Он стал известен миллионам людей благодаря разнообразной издательской программе, которая включает в себя научные работы по всем академическим дисциплинам, Библии, музыку, школьные и университетские учебники, книги по бизнесу, словари и справочники, а также академические журналы.

Компромисс: определение и примеры — видео и расшифровка урока

Positive Compromise

Общей целью компромисса является решение проблемы в интересах всех участников. Это называется положительный компромисс . Давайте посмотрим на некоторые примеры положительного компромисса.

Тетя Энн много лет не видела свою племянницу Памелу. Она слышит, что находится в городе, и приглашает ее на ужин во вторник в 19:00. К сожалению, Памела уже запланировала ужин на вторник и не может прийти. Однако она хочет навестить тетю Энн и спрашивает ее, можно ли вместо этого прийти на ужин в 19:00 в среду. Тетя Энн хочет увидеть свою племянницу, и хотя вторник был для нее лучше, она меняет свои планы на среду, чтобы приютить Памелу.Обе стороны пришли к позитивному компромиссу, который устраивает всех.

Стэнли руководит переговорами о слиянии компаний. Другая компания настаивает на том, чтобы штаб-квартира новой совместной компании была перенесена в другой город, что будет означать, что они, вероятно, потеряют ряд ключевых людей. Обе стороны в конечном итоге соглашаются переместить штаб-квартиру, но разрешить сотрудникам, которые не могут или не хотят переезжать, работать удаленно. Это поможет обеспечить плавный переход во время слияния.Опять же, это пример положительного компромисса, потому что он делается в интересах как компаний, так и их сотрудников.

Отрицательная компрометация

Не всякая компрометация является положительной. Негативный компромисс возникает, когда одна сторона получает выгоду от согласованного решения, а другая нет, и фактически может даже оказаться в худшем положении, чем раньше. Давайте рассмотрим пример негативного компромисса.

Джеймс недоволен внешностью своей жены Лори.Он думает, что с годами она расслабилась, и хочет, чтобы она похудела. Лори уверена в своей внешности и чувствует себя комфортно со своим весом. Однажды Джеймс подходит к Лори и говорит ей, что если она не похудеет, он уйдет и разведется с ней. В панике Лори начинает серию диет йо-йо, из-за которых ее вес резко колеблется. Она несчастна и подавлена. Попытка Лори пойти на компромисс была сделана из ультиматума, предъявленного Джеймсом, и будет считаться отрицательным компромиссом.

Компромисс или переговоры

Многие считают, что компромисс и переговоры — одно и то же, но это не так. Когда два человека идут на компромисс, они, по сути, соглашаются встретиться посередине. Например, Энн и Дэвид соглашаются пойти на свидание. Энн хочет посмотреть фильм, а Дэвид предпочитает пойти на пляж. В конце концов, они соглашаются вместо этого пойти поужинать. Энн не удается посмотреть фильм, который она хотела, а Дэвид не может проводить время на пляже. Таким образом, обе стороны отказываются делать то, что они действительно хотели сделать в первую очередь.

Переговоры немного отличаются и происходят, когда обе стороны получают то, чего они действительно хотят, путем взаимосогласованного обмена. Возьмем свидание Энн и Дэвида. Помните, что Энн хочет посмотреть фильм, а Дэвид хочет пойти на пляж. Если Энн и Дэвид успешно договорятся, они могут договориться провести утро на пляже, а днем ​​посмотреть фильм. По сути, ни Энн, ни Дэвиду не нужно ни от чего отказываться, и вместо этого больше не нужно идти на ужин.

Некоторые утверждают, что переговоры более эффективны, чем компромисс, поскольку обе стороны фактически получают то, что хотят, а не соглашаются сделать что-то, чего ни одна из них не хотела делать с самого начала.

Резюме урока

Компромисс происходит, когда две стороны приходят к соглашению, предлагая каждой встретиться где-то посередине. Компромисс возникает во многих различных ситуациях, включая отношения, политические вопросы и деловые сделки. Положительный компромисс достигается, когда достигается соглашение, отвечающее интересам всех участников.

Однако не все компромиссы являются положительными. Негативный компромисс имеет место, когда кто-то соглашается с предложением другой стороны, но не получает выгоды от этого соглашения. При отрицательном компромиссе одна сторона пожинает плоды в ущерб другой стороне.

Переговоры часто путают с компромиссом, но это немного другое. Переговоры имеют место, когда две стороны получают то, чего они действительно хотят, путем взаимосогласованного обмена. Некоторые утверждают, что переговоры предпочтительнее компромисса, потому что при компромиссе обе стороны соглашаются отказаться от того, чего они действительно хотят достичь посередине, ради чего-то, чего на самом деле они не хотели.

Не ставьте под угрозу лечение миеломы из-за пандемии COVID-19!

Abstract

Резюме: Пациенты с активной миеломой, особенно на ранних стадиях заболевания, восприимчивы к инфекции COVID-19 и могут иметь неблагоприятные исходы даже у тех, кто находится на лечении первой линии.Важно отметить, что терапию миеломы можно безопасно проводить, а оптимальный контроль над миеломой связан с улучшением результатов.

См. связанное видео: https://vimeo.com/486246183/559a80cfae

В этом выпуске Blood Cancer Discovery Хульткранц и его коллеги сообщают о клинических особенностях и результатах лечения 100 пациентов с множественной миеломой и COVID-19. 19 в пяти академических центрах Нью-Йорка, который был эпицентром инфекции в США (1). Они описывают более высокую частоту неблагоприятных исходов у латиноамериканцев/латиноамериканцев и афроамериканцев, а также у пациентов с более высоким уровнем воспалительных маркеров и цитокинов. Более того, 29% госпитализированных пациентов умерли, что подчеркивает тяжесть течения инфекции COVID-19 у этих пациентов.

Недавний отчет об инфекции COVID-19 у 890 онкологических больных в Европе (европейская раковая когорта), демонстрирующий более высокую смертность у пациентов с гематологическими злокачественными новообразованиями, чем при раке молочной железы и других солидных опухолях (2), в сочетании с другими отчетами, документирующими стационарную смертность частота заражения COVID-19 у пациентов с миеломой колеблется от 27% до 55%, что еще раз подчеркивает важность инфекции COVID-19 у этих пациентов (3, 4).

Важным аспектом инфекции COVID-19 является взаимосвязь между возрастом и исходом пациента. Сообщалось об инфекции в широком возрастном диапазоне как среди населения в целом, так и, в частности, у больных раком, что позволяет предположить, что возраст сам по себе не оказывает существенного влияния на восприимчивость (5). Например, в когортном исследовании VA с участием 1794 онкологических пациентов с положительным результатом на COVID-19 из базы данных по делам ветеранов США распространенность COVID-19 была одинаковой для всех возрастов (6).Следует отметить, однако, что большее количество пожилых пациентов с раком может быть диагностировано, поскольку они чаще проходят тестирование на COVID-19. В том же исследовании смертность, связанная с COVID-19, была тесно связана с возрастом: от 0,23% у пациентов моложе 50 лет до 20,5% у пациентов старше 80 лет ( P < 0,001). Хотя в отчете Нью-Йорка (NYC) возраст старше 65 лет не указан как независимый фактор риска, связанный с неблагоприятным исходом (1), более крупное исследование 650 пациентов с миеломой с инфекцией COVID-19, проведенное Международным обществом миеломы ( когорта IMS) действительно обнаружила связь между возрастом и смертностью с оценочной вероятностью смерти 17.8%, 31,4% и 49,3% у пациентов в возрасте 40, 60 и 80 лет соответственно (4). Это и другие исследования миеломы демонстрируют четкую взаимосвязь между увеличением возраста и неблагоприятным исходом инфекции COVID-19, что особенно важно, поскольку средний возраст пациентов с впервые диагностированной миеломой составляет 71 год.

В когорте VA распространенность инфекции COVID-19 среди онкологических больных составила 15% и 10,9% у афроамериканцев и латиноамериканцев/латиноамериканцев соответственно, по сравнению с 5,5% у белых (6).Важно отметить, что уровень госпитализации был в 3,5 раза выше среди афроамериканцев, но смертность, связанная с COVID-19, была одинаковой между двумя группами населения. Миелома чаще встречается у афроамериканцев, но исследование, проведенное в Нью-Йорке, не может учитывать относительную заболеваемость COVID-19 среди расовых групп населения; он действительно продемонстрировал более высокий риск неблагоприятного исхода среди афроамериканцев и латиноамериканцев. Хотя разработка новых методов лечения за последние 10–15 лет изменила парадигму лечения миеломы, медиана выживаемости у афроамериканцев не увеличилась в той же степени, что и у других подгрупп пациентов. Кроме того, недавний семинар AACR FDA продемонстрировал низкий уровень участия афроамериканцев в клинических испытаниях миеломы; тем не менее, у афроамериканских пациентов, получавших лечение новыми агентами, результаты были такими же и даже лучше, чем у других подгрупп пациентов (7). Является ли неблагоприятный исход инфекции COVID-19 у афроамериканцев уникальной восприимчивостью, генетическими факторами или факторами окружающей среды, отсутствием доступа к существующим методам лечения миеломы и/или доступом к интенсивной и поддерживающей терапии, включая противовирусную терапию и искусственную вентиляцию легких при COVID-19 инфекции, остается неясным.Исследование CCC19, в котором приняли участие 2186 взрослых американцев с инвазивным раком и инфекцией COVID-19, действительно показало, что афроамериканские пациенты примерно в два раза реже получают ремдесивир, чем белые пациенты (8). Важно отметить, что пандемия COVID-19 еще больше подчеркнула неравенство в доступе к медицинской помощи для пациентов с раком и/или инфекцией COVID-19 во всем мире.

В большинстве исследований неблагоприятный исход инфекции COVID-19 был связан с сопутствующими заболеваниями, в том числе у пациентов с раком и миеломой; однако типы сопутствующих заболеваний были переменными.Например, в европейском когортном исследовании рака COVID-19 с когнитивными нарушениями и хроническим заболеванием почек был связан с более высокими показателями смертности (2). Исследование CCC19 показало, что отдельные сопутствующие заболевания не были статистически значимыми (8), но что показатель Charlson Score, отражающий общее состояние здоровья и другие сопутствующие заболевания, коррелировал с увеличением смертности, связанной с COVID-19, в диапазоне от 3,1% у пациентов с оценкой Charlson от 0 до 15,0. % у пациентов с показателем Charlson ≥5 ( P < 0.001; исх. 6). Испанское когортное исследование показало, что по крайней мере одно сопутствующее заболевание было связано с инфекцией COVID-19 у 75% пациентов с миеломой, а также у 77% нераковых пациентов того же возраста и пола (9). В когорте IMS многофакторный анализ выявил заболевание почек как независимый предиктор неблагоприятного исхода (4). В отличие от этих исследований, сопутствующие заболевания, включая гипертонию и диабет, у пациентов с миеломой не были связаны с неблагоприятным исходом инфекции COVID-19 в когорте Нью-Йорка.

Воздействие лечения рака у пациентов с COVID-19 варьируется в зависимости как от типа рака, так и от проводимой терапии, включая его влияние на иммунный и воспалительный ответ. Например, в когорте VA предоставление химиотерапии, таргетной терапии и иммунотерапии, а также терапии рака в течение 6 месяцев после заражения COVID-19 не было связано с увеличением смертности (6). Аналогичным образом, европейская когорта рака подтвердила, что тип системной противоопухолевой терапии не был связан с тяжестью COVID-19, и фактически активная противораковая терапия во время COVID-19 была связана с более низким риском осложнений заболевания (2).В нескольких сообщениях о миеломе и инфекции COVID-19 подчеркивается важность не ставить под угрозу использование новых методов лечения миеломы, включая терапию высокими дозами и трансплантацию аутологичных стволовых клеток, из-за инфекции COVID-19. Например, терапия высокими дозами и трансплантация стволовых клеток в течение 1 года после заражения COVID-19 не предвещали неблагоприятного исхода для пациентов в когорте Нью-Йорка или когорте IMS. Что наиболее важно, в нескольких отчетах подчеркивается необходимость достижения контроля над заболеванием при миеломе и не нарушать первичную терапию из-за инфекции COVID-19.Например, субоптимальный контроль заболевания миеломой был связан с неблагоприятным исходом в отчете IMS (4). Доступ к отделению интенсивной терапии и искусственной вентиляции легких различается в отчетах пациентов с миеломой с инфекцией COVID-19 и явно влияет на исход.

Влияет ли иммунный статус на исход у пациентов с миеломой, инфицированных COVID-19? Дефекты адаптивного и врожденного иммунитета, включая как клеточные, так и иммунные реакции, являются отличительной чертой миеломы. Таким образом, пациенты с миеломой более восприимчивы к инфекциям и лечатся внутривенным иммуноглобулином в связи с повторными опасными для жизни инфекциями. Как это ни парадоксально, степень иммунопареза может не коррелировать с исходом инфекции COVID-19 у пациентов с миеломой. Пациенты с недавно диагностированной миеломой, получающие индукционную терапию, и даже пациенты с моноклональной гаммапатией неустановленной значимости или вялотекущая множественная миелома, не требующая лечения, включены в когорту Нью-Йорка и другие отчеты об инфекции COVID-19. Ясно, что у этих пациентов не развилась прогрессирующая иммуносупрессия из-за прогрессирующего заболевания и сопутствующей терапии.Действительно, уровень IgG <650 мг/дл не был связан с неблагоприятным исходом в когорте пациентов из Нью-Йорка; скорее, более высокие уровни воспалительных маркеров и активация цитокинов предвещали неблагоприятный исход у этих пациентов. В когорте IMS более высокая восприимчивость к COVID-19 наблюдалась на более ранних стадиях миеломы, поскольку у 36% пациентов с инфекцией COVID-19 была диагностирована миелома в 2019–2020 годах по сравнению с 22% пациентов, у которых в целом была диагностирована миелома в этой группе. временные рамки, согласно данным эпиднадзора, эпидемиологии и конечных результатов (4).Интересно предположить, что сохраненная иммунная компетентность у пациентов с миеломой способствует развитию цитокинового шторма и легочной токсичности/острого респираторного дистресс-синдрома и неблагоприятному исходу.

Этот опыт основан на фактических данных, а не на проспективных клинических обсервационных исследованиях. Тем не менее совокупный опыт на сегодняшний день показывает, что пациенты с миеломой, вероятно, более восприимчивы к инфекции COVID-19 и могут иметь неблагоприятные исходы, даже у тех, кто находится на лечении первой линии или не требует терапии.Это подчеркивает необходимость повышенных мер предосторожности, включая мытье рук, ношение маски, социальное дистанцирование и предотвращение воздействия вируса на всех пациентов с этими нарушениями плазматических клеток и их семьи. Важно отметить, что новые данные свидетельствуют о том, что терапию миеломы можно безопасно назначать пациентам с инфекцией COVID-19, и что контроль заболевания миеломой предвещает улучшение исхода инфекции COVID-19.

Раскрытие потенциальных конфликтов интересов

NC Munshi сообщает о личных гонорарах от Bristol-Myers Squibb (консультант), Janssen (консультант), Amgen (консультант), Takeda (консультант), Abbvie (консультант) и других от OncoPep (научный учредитель) вне представленной работы.К.С. Андерсон является консультантом/советником компаний Bristol-Myers Squibb, Janssen, Amgen, Takeda, Sanofi, Gilead и Precision Biosciences, а также научным основателем OncoPep и C4 Therapeutics.

Один из главных редакторов является автором этой статьи. В соответствии с редакционной политикой AACR, это представление было подготовлено членом редакционной группы Blood Cancer Discovery ; независимо, редакционный директор AACR принял окончательное решение относительно приемлемости.

  • © Американская ассоциация исследований рака, 2020 г.

Компрометация корпоративной электронной почты – застрахована?

Компрометация корпоративной электронной почты – застрахована?

02 февраля 2017 г.

Киберпреступник взламывает сеть вашей компании, получает контроль над электронной почтой генерального директора и отправляет финансовому директору инструкции о переводе денег на указанный банковский счет. Финансовый директор, полагая, что он действует по приказу генерального директора, делает это. Только на следующий день он узнает, что генеральный директор не имеет никакого отношения к электронной почте. К тому времени, конечно, денег уже нет.

Эта афера, известная как компрометация деловой электронной почты (BEC), набирает обороты.ФБР сообщает, что с 2013 года было совершено более 22 000 BEC с совокупными потерями, превышающими 3 миллиарда долларов. Жертвы есть во всех 50 штатах и ​​более чем 100 странах. Одна недавняя жертва, Ubiquiti Networks, Inc., потеряла 46,7 миллиона долларов!

Неудивительно, что BEC поднимают множество страховых вопросов. Последним напоминанием об этом является дело, недавно поданное в федеральный суд Техаса — Quality Sausage Company против Twin City Fire Insurance Co. , № 17-cv-00111 (S.D. Tex.2017). Там главный административный директор QSC получил электронное письмо, которое, по-видимому, пришло от клиента, в котором ей предлагалось отправить 1 миллион долларов на банковский счет за пределами штата. Она сделала это. Через два дня, когда мошенник снова попытался обмануть ее с помощью аналогичного электронного письма, она позвонила клиенту и узнала, что клиент не давал указаний ни о каком переводе. Ой. QSC обратилась за помощью к своему оператору Twin City Fire, который отверг обвинения. Не приняв этот ответ, QSC подала иск.

Пока еще слишком рано говорить о том, как будет развиваться спор между QSC и Twin City Fire, подобные случаи возникают по всей стране в течение последних нескольких лет с неоднозначными результатами.Многие коммерческие полисы не покрывают BEC, потому что застрахованные (хотя и обманутые) переводили средства добровольно. Киберполитики могут охватывать BEC, но, как всегда, это зависит от политики. Согласно опросу Betterley Report, проведенному в 2015 году, только 8 из 31 ведущего поставщика услуг киберстрахования покрывают мошеннические банковские переводы.

Это быстро развивающаяся область, на которую должны обратить внимание как страховщики, так и страхователи. И, если вы ничего не вынесете из этого сообщения в блоге, помните следующее: если вы получите электронное письмо с инструкциями по переводу денег, поговорите с отправителем лично или по телефону, прежде чем переводить средства.Всегда лучше перестраховаться, чем сожалеть.

Укорочение теломер и метаболические нарушения лежат в основе дистрофической кардиомиопатии

Значение

Мы обнаружили, что длинные теломеры защищают мышей от генетических сердечных заболеваний, аналогичных тем, которые встречаются у людей, таких как мышечная дистрофия Дюшенна (МДД). Мыши, лишенные дистрофина, как и пациенты с МДД, проявляют только легкое заболевание. Напротив, у мышей с отсутствием дистрофина и «гуманизированной» длиной теломер ( mdx 4cv /mTR G2 ) полностью проявляются как тяжелая атрофия скелетных мышц человека, так и сердечная недостаточность, типичная для МДД. Примечательно, что укорочение теломер сопровождает развитие сердца даже после прекращения деления кардиомиоцитов. Это хроническое независимое от пролиферации укорочение дистрофин-дефицитных кардиомиоцитов связано с индукцией реакции на повреждение ДНК, митохондриальной дисфункцией, повышенным окислительным стрессом и метаболической недостаточностью. Наши результаты подчеркивают взаимосвязь между длиной теломер и митохондриальным гомеостазом в этиологии дистрофической сердечной недостаточности.

Abstract

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД) — неизлечимое сцепленное с Х-хромосомой генетическое заболевание, вызываемое мутацией в гене дистрофина и поражающее одного из каждых 3600 мальчиков.Ранее мы показали, что длинные теломеры защищают мышей от смертельной сердечной болезни, наблюдаемой у людей с тем же генетическим дефектом, дефицитом дистрофина. Путем создания мышиной модели mdx 4cv /mTR G2 с «гуманизированными» длинами теломер был воссоздан разрушительный фенотип дилатационной кардиомиопатии, наблюдаемый у пациентов с МДД. Здесь мы анализируем дегенеративные последствия, которые завершаются сердечной недостаточностью и смертью в этой мышиной модели.Мы сообщаем о прогрессирующем укорочении теломер в развивающихся кардиомиоцитах мыши после 1 постнатальной недели, когда клетки больше не делятся. Это независимое от пролиферации укорочение теломер сопровождается индукцией ответа на повреждение ДНК, проявляющегося активацией p53 и повышенной экспрессией его гена-мишени p21 в изолированных кардиомиоцитах. Последующая репрессия Pgc1α/β приводит к нарушению митохондриального биогенеза, что в сочетании с высокой потребностью в сокращении приводит к усилению окислительного стресса и снижению потенциала митохондриальной мембраны.В результате дыхание кардиомиоцитов и выход АТФ серьезно нарушены. Важно отметить, что лечение митохондриально-специфическим антиоксидантом до начала сердечной дисфункции устраняет метаболические дефекты. Эти результаты свидетельствуют о связи между короткой длиной теломер и нарушением метаболизма в этиологии дилатационной кардиомиопатии при МДД и указывают на возможности для профилактических вмешательств.

Мышечная дистрофия Дюшенна (МДД), наиболее распространенное наследственное миопатическое заболевание у людей, является результатом мутации гена дистрофина, расположенного на Х-хромосоме (1, 2).Ген дистрофина, который кодирует цитоплазматический белок массой 427 кДа, образующий комплекс дистрофин-гликопротеин, соединяющий цитоскелет мышечного волокна с окружающим внеклеточным матриксом, необходим как в скелетных, так и в сердечных мышцах (1, 3). У пациентов с МДД симптомы обычно проявляются в возрасте 3–5 лет с признаками фокального некроза скелетных миофибрилл, гипертрофией мышц и высоким уровнем креатинкиназы в сыворотке (4). Потеря дистрофина в тканях сердца у пациентов с МДД приводит к притоку внеклеточного кальция, который запускает патологический каскад активации протеаз, гибель миоцитов, некроз и воспаление, что приводит к усилению фиброза (5, 6).Хотя электрокардиография позволяет выявить сердечную дисфункцию более чем у половины пациентов с МДД в ​​возрасте 6–10 лет, ранние симптомы кардиомиопатии могут остаться незамеченными из-за ограниченной толерантности к физической нагрузке. Благодаря достижениям в области респираторной поддержки у пациентов с МДД в ​​настоящее время обычно развивается сердечная недостаточность, приводящая к смерти на втором или третьем десятилетии жизни (7).

Серьезной проблемой, препятствующей разработке эффективных методов лечения МДД, было отсутствие модели на животных, которая точно повторяла бы заболевание сердца, наблюдаемое у пациентов.Наиболее часто используемой моделью мыши Дюшенна является мышь mdx 4cv , у которой отсутствует функциональный дистрофин, как у пациентов с МДД, но при этом наблюдается только легкий дистрофический фенотип скелетных мышц и отсутствует кардиальный фенотип (8, 9). Мы предположили, что длина теломер может объяснить эту разницу, поскольку у мышей теломеры намного длиннее, чем у людей (10). Теломеры представляют собой защитные последовательности повторов ДНК, которые связаны и покрыты белками шелтерина на концах хромосом.Укороченные теломеры коррелируют с болезненными состояниями как в основном непролиферативных органах, таких как сердце и мозг (11), так и в пролиферативных органах и заболеваниях, таких как рак (12). Однако функциональная роль критически укороченных теломер при сердечных заболеваниях ранее не выяснена. Недавно мы обнаружили, что когда mdx 4cv мышей были созданы с более короткими «гуманизированными» теломерами путем скрещивания с мышами, лишенными РНК-компонента теломеразы (mTR), атрофия скелетных мышц и сердечная недостаточность, характерные для пациентов с МДД, полностью исчезли. проявляется (13, 14).Наши результаты оказались неожиданными, так как в отличие от скелетных мышц, в которых потеря пролиферативной способности сателлитных клеток приводит к атрофии мышц из-за неспособности удовлетворить хроническую потребность в регенерации, сердце представляет собой в значительной степени покоящуюся ткань. Развитие сердца у взрослых характеризуется низким клеточным оборотом, как показано интеграцией углерода-14, вызванной испытаниями ядерной бомбы у людей (13) и мечением BrdU в сердцах мышей (14). В кардиомиоцитах сердца мышиной модели МДД mdx 4cv /mTR KO мы наблюдали значительное уменьшение длины теломер по сравнению с контролем (15)Важно отметить, что другие типы мышечных клеток в тех же тканях сердца, клетки гладкой мускулатуры сосудов, которые не экспрессируют дистрофин, не имеют укороченных теломер (15). Примечательно, что эти результаты были подтверждены в тканях сердца пациентов с МДД, у которых длина теломер кардиомиоцитов составляет 55% от длины теломер здоровых людей (15). Хотя эти результаты подчеркивают роль укорочения теломер в этиологии заболевания, молекулярные последствия, вызывающие сердечную недостаточность при МДД, не выяснены.

Здесь мы демонстрируем, что хроническое укорочение теломер происходит во время постнатального развития в кардиомиоцитах мышиной модели МДД ( mdx 4cv /mTR KO ) независимо от пролиферации. Хроническое укорочение в сочетании с активацией p53 приводило к уменьшению митохондриального биогенеза, уменьшению количества копий митохондрий и дыхания и усилению окислительного стресса в очищенных кардиомиоцитах. Наши результаты определяют временное окно для терапевтического вмешательства и дают представление о молекулярных перекрестных помехах между поддержанием теломер и метаболическим гомеостазом, которые лежат в основе сердечной недостаточности при МДД.

Результаты

Мышиная модель МДД.

Мы создали дистрофических мышей с «гуманизированной» длиной теломер путем скрещивания мышей mTR (отсутствующих РНК-компонент теломеразы, известных как mTR или Terc ) (16) с мутантными мышами по дистрофину экзона 53 ( mdx 4cv ), как описано ранее (15, 17). Наша схема размножения дает MDX

3 4CV / MTR KO Двойные нокауты с генетическим фоном, одинаковым до МТР KO Чтобы исключить различия в деформации как причина для наблюдаемых фенотипов.Поскольку МДД человека сцеплен с Х-хромосомой, наши исследования были ограничены самцами мышей, а сравнения проводились с использованием мышей всех генотипов одного возраста и поколения (второе поколение; G2). G2 предшествует укорочению теломер, повсеместно наблюдаемому у мышей mTR KO в последовательных поколениях, которые с помощью G4 имитируют фенотип старения (18). Чтобы исключить возможность универсального фенотипа старения, мы проанализировали длину теломер в высокопролиферативных тканях, таких как половые железы, и не наблюдали укорочения в G2, что согласуется с предыдущими отчетами, сделанными нами и другими (15, 17, 19). .Мы сравниваем мыши G2 двух мутантных мышей, не хватающих дистрофина и Terc на G2 ( MDX / MTR / MTR G2 ) с элементами управления одинаковым G2 поколением: гомозиготные TERC -NULL MUCE ( MTR

3 G2 ) и гетерозиготный MDX 4CV

6 / MTR / MTR MICE (дистрофин-ноль, но выражение одного аллеля, кодируя TERC ).

Сердца с МДД демонстрируют прогрессирующее укорочение теломер и дисфункцию после рождения.

Хотя мы наблюдали значительное укорочение теломер в кардиомиоцитах пациентов с МДД и mdx 4cv /mTR G2 мышей в начале дилатационной кардиомиопатии оставался неизвестным. Постнатальные кардиомиоциты мышей пролиферируют примерно до недели после рождения (14, 20, 21).Чтобы определить прогрессирование укорочения теломера во время развития в нашей модели мыши DMD, мы измерили длины телемера по количественным флуоресцентом в гибридизации количественций в MDX 4CV / MTR G2 , MDX 4CV 4CV / MTR Het и MTR MTR G2 CardiomyoCytes при 1, 4, 8 и 32 неделях постнатального возраста (рис. 1 A и B ).Как и ожидалось, пролиферация кардиомиоцитов была незначительной, что оценивалось путем измерения пролиферативных маркеров, таких как K i -67, фосфо-гистон 3 и BrdU (рис. S1-S3). Во время этого нераспролимерного периода развития сердца (1-32 WK), MDX / MTR / MTR / MTR / MTR G2 CardiomyoCyts проявляли значительно большее количество телемере, укоренение относительной MDX 4CV / mTR Het и mTR G2 (37. 6% против 20,7% и 23,3% соответственно) (рис. 1 C ). Эти данные свидетельствуют о том, что дефицит дистрофина усугубляет независимое от пролиферации укорочение теломер у животных mdx 4cv /mTR G2 .

Рис. 1.

Дефицитные по дистрофину кардиомиоциты демонстрируют прогрессирующее укорочение теломер в две фазы: зависимую от пролиферации и независимую от пролиферации. ( A ) Длину теломер (TelC) оценивали с помощью иммунофлуоресцентного окрашивания относительно окрашивания DAPI в сердечных тропонин Т-положительных кардиомиоцитах.Белые стрелки указывают на ядра в кардиомиоцитах животного mdx 4cv /mTR G2 . ( B ) Интенсивность окрашивания теломер относительно DAPI кардиомиоцитов показана для 1-, 4-, 8- и 32-недельных сердец ( n = 3 на генотип). Количество забитых ядер было MDX 4CV / MTR Het ( N = 560, 318, 475 и 353), MDX 4CV / MTR G2 ( N = 558, 292, 370 и 284) и МРТ G2 ( N = 513, 287, 419 и 349) для 1-, 4-, 8- и 32-недельные сердца соответственно. ( C ) Процент укорочения теломер показан для предвзрослой (1 против 8 недель), взрослой фазы (8 против 32 недель) и фазы, не зависящей от пролиферации (1 против 32 недель). (Шкала баров, 10 мкм.) Данные представлены как среднее ± SEM. Статистический анализ включал непараметрический критерий Крускала-Уоллиса, скорректированный с помощью критерия множественных сравнений Данна. * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001.

Рис. S1.

Анализ пролиферации кардиомиоцитов по К и -67.Представитель микрофотографии для кардиомиоцитов от 1, 8, и 32 WK возраста сердца разделы от MDX 4CV / MTR , G2 , MDX 4CV / MTR HET и mTR G2 иммуноокрашивание мышей на ( A ) K i -67 на уровне отдельных клеток и ( B ) на уровне популяции относительно проточной цитометрии Контроль IgG (серый). (Шкала баров, 10 мкм.) Данные представлены как среднее ± SEM.

Рис. S2.

Анализ фазы клеточного цикла в кардиомиоцитах с помощью Phospho-Histone 3 (ph4). Представитель микрофотографии для кардиомиоцитов от 1, 8, и 32 WK возраста сердца разделы от MDX 4CV / MTR , G2 , MDX 4CV / MTR HET и mTR G2 мышей, иммуноокрашенных ( A ) для ph4 на уровне отдельных клеток и ( B ) с помощью проточной цитометрии на уровне популяции, определенной относительно контроля IgG (серый).(Шкала баров, 10 мкм.) Данные представлены как среднее ± SEM.

Рис. S3.

Анализ митоза в кардиомиоцитах с помощью мечения BrdU. Анализ регистрации BRDU (24 ч пульса) по течению цитометрия выполнено в MDX 4CV , / MTR , MDX , MDX 4CV / MTR HET , и mTR G2 кардиомиоциты. ( A ) Стратегия гейтирования FACS сердечных тропонин Т-позитивных кардиомиоцитов.( B ) Включение BrdU в кардиомиоциты 8- и 32-недельных животных и ( C ) количественная оценка данных FACS о мечении BrdU относительно контроля IgG. Пролиферативная селезенка из mdx 4cv /mTR G2 служила положительным контролем для мечения BrdU. Данные представлены как среднее ± SEM.

Мы стремились определить, сопровождается ли укорочение теломер в кардиомиоцитах, лишенных дистрофина, потерей белков шелтерина, которые защищают теломеры (22).В изолированных по Лангендорфу кардиомиоцитах мы измерили уровни транскриптов белков шелтерина с помощью ОТ-количественной ПЦР и наблюдали снижение уровней экспрессии белка, связывающего теломерные повторы Trf1 , и снижение компонентов, покрывающих теломеры ( Tpp1 , POT1A , и POT1B ) В MDX / MTR G2 , но не MDX 4CV / MTR HET или MTR G2 , кардиомиоциты, тогда как у Trf2 и Tin2 различий не наблюдалось (рис. 2 B–D ). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что дистрофический фенотип связан со снижением экспрессии генов, кодирующих белки, покрывающие теломеры, что может усиливать укорочение теломер в кардиомиоцитах.

Рис. 2.

Кардиомиоциты мышиной модели МДД обнаруживают дисфункцию теломер. ( A ) Схема концов теломер, защищенных белками шелтерина. ( B ) Эндогенные уровни экспрессии генов охлаждения телемере были определены RT-QPCR в первичных кардиомиоцитах: TRF1 , TRF2 , TPP1 , TIN2 , POT1A и POT1B ( N = 4–5 мышей на генотип, технические повторы n = 2).( C ) Процент положительности маркера ответа на повреждение ДНК 53bp1 был количественно определен с помощью проточной цитометрии относительно контроля IgG (серый). ( D ) 53bp1-положительные кардиомиоциты (общий процент) показаны ( n = 3 мыши на генотип; n = 5000 сердечных тропонин Т-положительных клеток на образец). Все анализы проводили с использованием 8-недельных животных. Данные представлены как среднее ± SEM. Статистический анализ включал однофакторный дисперсионный анализ с апостериорной коррекцией Бонферрони. * P < 0.05; ** Р < 0,01; **** Р < 0,0001.

Критически короткие теломеры вызывают реакцию повреждения ДНК.

Чтобы определить, приводят ли укороченные теломеры к ответу на повреждение ДНК, мы оценили количество р53-связывающего белка 1 (53bp1). С этой целью мы провели проточную цитометрию кардиомиоцитов, выделенных из препаратов сердца, перфузированных по Лангендорфу. Кардиомиоциты от MDX 4CV / MTR G2 мыши выставлены значительно более высокий процент от 53 BP1 + кардиомиоцитов по сравнению с MDX 4CV / MTR HET и mTR G2 элементы управления (86.9 ± 2,4%, 36,4 ± 10,0% и 27,3 ± 18,8% соответственно) (рис. 2 C и D ), что свидетельствует об усилении реакции на повреждение ДНК. В качестве дополнительных показаний реакции на повреждение ДНК мы исследовали уровень p53 и его нижестоящие мишени. В соответствии с нашими выводами 53bp1, p53, который в норме подвергается убиквитинированию и деградации посредством комплекса MDM2 (23), был увеличен в mdx 4cv /mTR G2 9018 при иммуноблоттинге. (Инжир.3 А ). Кроме того, мы обнаружили значительные увеличения доли изолированных кардиомиоцитов, экспрессирующих P53 в MDX

3 4CV

6 / MTR G2 (33,7 ± 7,8%) по сравнению с MDX 4CV /mTR Het (5,2 ± 1,0 %) и mTR G2 контроли (7,6 ± 2,8 %) по данным проточной цитометрии (рис. 3 B и C ).Индукция гена-мишени p53 p21 также была очевидна в кардиомиоцитах mdx 4cv /mTR G2 с помощью RT-qPCR9 (рис. Увеличение уровня транскрипта P21 сопровождалось двумя увеличением доли кардиомиоцитов, экспрессирующих белок P21, анализируемый потоком цитометрии в MDX 4CV / MTR G2 по сравнению с MDX 4cv /mTR Het и mTR G2 элементы управления (63.4 ± 11,4% против 22,2 ± 2,1% и 29,0 ± 8,6% соответственно) (рис. 3 E и F ).

Рис. 3.

Критически короткие теломеры приводят к активации р53, что приводит к снижению митохондриального биогенеза. ( A ) Клеточные лизаты кардиомиоцитов подвергали иммуноблоттингу на р53. Экспрессию белка гистона 3 (h4) использовали в качестве контроля нагрузки. ( B ) Процент положительности p53 был количественно определен с помощью проточной цитометрии на уровне популяции. ( C ) Процент р53-позитивных кардиомиоцитов, определенный по площади под кривой относительно контроля IgG (серый; n = 3 мыши на генотип; n = 5000 сердечных тропонин-Т-положительных кардиомиоцитов на состояние). ( D ) Уровни экспрессии целевого гена p53, p21 , определяли с помощью RT-qPCR в кардиомиоцитах ( n = 4–5 мышей на генотип; технические повторы n = 2). ( E ) Активация p53 оценивалась как функция уровней белка p21 с помощью проточной цитометрии в кардиомиоцитах. ( F ) Процент p21-положительных кардиомиоцитов, определенный по площади под кривой относительно контроля IgG (серый; n = 3 мыши на генотип; n = 5000 сердечных тропонин Т-положительных клеток на образец).( G и H ) Снижение уровней экспрессии Pgc1α и Pgc1β , известных мишеней p53, определено с помощью RT-qPCR ( n = 4–5 мышей на генотип; технические повторы n = 2). Все анализы проводились на 8-недельных мышах. Данные представлены как среднее ± SEM. Статистический анализ включал однофакторный дисперсионный анализ с апостериорной коррекцией Бонферрони. * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001; **** Р < 0. 0001.

Известно, что активация р53 блокирует биогенез митохондрий путем ингибирования экспрессии коактиватора гамма-рецептора, активируемого пролифератором пероксисом, 1-альфа и 1-бета (Pgc1α и Pgc1β) (19). Соответственно, анализы RT-QPCR выявили значительное снижение уровня транскрипта PGC1β и, в меньшей степени, PGC1α , в MDX

3 4CV / MTR G2 по сравнению с контролем MDX 4cv /mTR Het и mTR G2 кардиомиоциты (рис.3 G и H ). В совокупности эти данные свидетельствуют о том, что критически укороченные теломеры в кардиомиоцитах с дефицитом дистрофина в сочетании с реакцией на повреждение ДНК блокируют митохондриальный биогенез.

Снижение митохондриального биогенеза приводит к митохондриальной дисфункции.

Чтобы оценить митохондриальный статус кардиомиоцитов с дефицитом дистрофина, мы проанализировали количество митохондрий, функцию и выход АТФ в свежевыделенных кардиомиоцитах (рис. 4 А ). Чтобы оценить уровень митохондриального биогенеза, мы использовали стандартный анализ числа копий митохондрий RT-qPCR (24). Значительное снижение количества копий Mitochondria наблюдалось в MDX 4CV / MTR G2 по сравнению с MDX 4CV / MTR HET и MTR G2 элементы управления (рис. 4 B ). Протеомическая массовая спектрометрия линдомиоцитов Langendorfff Изолированные кардиомиоциты в 8 Wk предоставили еще одно доказательство значительного снижения митохондриальных белков в MDX 4CV / MTR / MTR G2 относительно контроля MTR и мышей дикого типа (фиг.S4 и набор данных S1). В соответствии с развитием дилатационной кардиомиопатии было значительно повышено количество белков, участвующих в мышечной дифференцировке и сокращении мышц, тогда как белки, участвующие в реакциях окисления и восстановления, были значительно снижены в кардиомиоцитов по сравнению с контролем.

Рис. 4.

Критически короткие теломеры приводят к митохондриальной дисфункции в кардиомиоцитах мышиной модели МДД.( A ) Схема для митохондриальных измерений. ( B ) Mitochondria Номер копирования, оцененный как митохондриальный ген (ND2) до ядерной ДНК (NRF1) в MDX 4CV / MTR MDX , MDX 4CV / mTR Het и mTR G2 кардиомиоцитов ( n = 5–8 мышей на генотип; техническое n = 2). ( C ) Митохондриальные супероксидные формы (MitoSox Red) и ( D ) внутриклеточные активные формы кислорода (CellROX Deep Red) измеряли в кардиомиоцитах ( n = 4–5 мышей на генотип; технические повторы n = 4 –5).( E ) Мембранные потенциалы митохондрий (∆ψm) определяли с помощью флуорогенного зонда TMRM в кардиомиоцитах ( n = 4–5 мышей на генотип; технические повторы n = 4–5). ( F ) Коэффициент потребления кислорода в реальном времени был измерен в свежеизолированном MDX

3 4CV / MTR G2 , MDX 4CV / MTR HET и mTR KO кардиомиоциты.Клетки подвергали воздействию 5 мМ глюкозы, 167 мкМ пальмитата или только среды для анализа ( n = 5 мышей на генотип; технические n = 8). ( G ) Средние уровни АТФ, нормализованные к общему белку в лизатах кардиомиоцитов ( n = 4–5 мышей каждого генотипа). ( H ) Митохондриальные супероксиды (MitoSox Red). ( I ) внутриклеточные активные формы кислорода (CellROX Deep Red), ( J ) митохондриальные мембранные потенциалы (∆ψm) и ( K ) скорость потребления кислорода в реальном времени были измерены в свежевыделенных mdx 4cv /mTR G2 кардиомиоцитов, обработанных либо MnTBAP, либо физиологическим раствором ( n = 8 мышей на обработку; технические n = 4–8). Все анализы проводились с использованием мышей в возрасте 8 недель. Данные представлены как среднее ± SEM. Статистический анализ включал односторонний ANOVA с апостериорной коррекцией Бонферрони, за исключением экспериментов по спасению MnTBAP, для которых использовался двусторонний критерий Стьюдента t . * Р < 0,05; ** Р < 0,01; *** Р < 0,001; **** Р < 0,0001.

Рис. S4.

Изменения митохондриального белка, проанализированные с помощью протеомной масс-спектрометрии. ( A ) Схема пробоподготовки и мультиплексной маркировки перед протеомным анализом ( n = 2 на генотип).( B ) дифференциально регулируемый и ( C ). классифицируются терминами GO, обозначаемыми молекулярной функцией и биологическими и клеточными компонентами.

Для изучения целостности митохондрий у мышей с дистрофией изолированные кардиомиоциты анализировали на внутриклеточные активные формы кислорода (АФК), митохондриальный супероксид и мембранный потенциал митохондрий. Мы наблюдали увеличение на 20-30% как митохондриальное супероксид, так и из клеточной категории в MDX 4CV / MTR G2 кардиомиоциты относительно MDX / MTR Het и mTR G2 управления (рис. 4 C и D ). Параллельно мы наблюдали значительную 30% снижение потенциала Mitochondrial Membrane в MDX

3 4CV / MTR / MTR CardiomyoCyts относительно MDX 4CV / MTR HT и mTR G2 контроли, что свидетельствует о митохондриальной компрометации (рис.4 E ). Чтобы оценить митохондриальное дыхание в режиме реального времени, мы подвергли свежевыделенные кардиомиоциты трем субстратным условиям: базовая среда для анализа (без субстрата), 5 мкМ глюкозы или 167 мкМ пальмитата. Во всех трех условиях, MDX 4CV

6 / MTR G2 G2 кардиомиоциты показали снижение скорости потребления кислорода по сравнению с MTR G2 и MDX 4CV /mTR Het элементы управления (рис.4 Ф ). В качестве меры митохондриального выхода мы проанализировали концентрацию АТФ в очищенных клеточных лизатах кардиомиоцитов. Лязаты от MDX 4CV / MTR G2 G2 G2 CardiomyoCyts проявляли заметное снижение уровня АТФ по сравнению с MDX 4CV / MTR и MTR G2 элементы управления (рис. 4 G ). В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что кардиомиоциты при МДД демонстрируют сниженный митохондриальный биогенез и повышенный окислительный стресс в результате укорочения теломер и активации р53, что приводит к нарушению метаболизма.

Митохондриальный антиоксидант MnTBAP восстанавливает функцию митохондрий.

Ранее мы показали, что лечение дистрофических mdx 4cv /mTR G2 животных, начиная с 8-недельного возраста с митохондриально-специфическим антиоксидантом мандарина порфиринхлорид (MnTBAP) замедлял прогрессирование дистрофической кардиомиопатии на 32-й неделе, а также продлевал выживаемость (15). Чтобы определить, может ли вмешательство препятствовать митохондриальной дисфункции, наблюдаемой в возрасте 8 недель, мы подвергли мышей с дистрофией MnTBAP, начиная с 4-недельного возраста.Хотя обработка MnTBAP в течение 4-недельного периода не снижала уровень продукции митохондриального супероксида, общие клеточные уровни АФК снижались, а потенциал митохондриальной мембраны восстанавливался по сравнению с контролем, получавшим физиологический раствор (рис. 4 H-J ). Важно отметить, что лечения MnTBAP было достаточно, чтобы значительно предотвратить потерю митохондриального дыхания по сравнению с дистрофическими контролями, обработанными физиологическим раствором. В совокупности эти результаты свидетельствуют о том, что в кардиомиоцитах с дефицитом дистрофина митохондриальный компромисс может быть частично облегчен путем раннего вмешательства с помощью митохондриального антиоксиданта, специфичного для митохондрий.

Обсуждение

Наши результаты показывают, что длинные теломеры защищают мышей от генетических кардиомиопатий человека, таких как МДД, что решает главную загадку. Долгосрочная загадка заключалась в том, что, хотя у мышей mdx отсутствует дистрофин, как и у пациентов с МДД, у них не проявляется сердечный фенотип, тогда как пациенты погибают из-за дилатационной кардиомиопатии. По неизвестным причинам у людей теломеры намного короче, чем у мышей (10). Когда мы «очеловечили» теломеры мышей mdx 4cv с дефицитом дистрофина, чтобы они были похожи по длине на теломеры человека, скрещивая mdx 4cv до мышей, нокаутированные мыши умерли преждевременно1 в результате дилатационной кардиомиопатии (15). Более того, тяжелый фенотип скелетных мышц, характерный для пациентов с МДД, не проявлялся у мышей с дефицитом дистрофина mdx 4cv , несмотря на хронические циклы дегенерации и регенерации, поскольку длинные теломеры подпитывали резерв стволовых клеток и повышали регенеративную способность мышечные стволовые клетки (17). Действительно, эти результаты обеспечивают механистическое понимание наших предыдущих исследований, показывающих, что миобласты, даже у молодых пациентов с МДД, имеют заметно нарушенную пролиферативную способность (25).Используя наших мышей mdx 4cv /mTR G2 , мы показываем здесь, что значительное истощение теломер происходит во время постнатального дистрофического развития сердца независимым от пролиферации образом. Другие показали, что потеря защиты теломер из-за снижения уровня шелтерина или мишени miR-34, PNUTS, связана с сердечными заболеваниями (26, 27). Наоборот, удлинение теломер за счет повышения активности теломеразы обеспечивало защиту в сердце мышей, подвергшихся инфаркту миокарда (28). В наших MDX 4CV / MTR / MTR MTR G2 Модель, укороченные теломеры, коррелируемые со сниженным уровнями трех Shelterins TRF1 , TPP1 и POT1A / B . Чтобы исследовать причину и следствие и выявить механизм, лежащий в основе укорочения теломер, необходима альтернатива, поскольку используемые здесь культуры диссоциированных кардиомиоцитов мыши не выживают более 1-2 дней. Особый интерес представляло бы выяснение того, как теломеры кардиомиоцитов укорачиваются в результате дефицита дистрофина независимым от пролиферации образом.

Длина теломер уменьшается при кардиомиопатии из-за старения у мышей и людей (11, 19). Наша оценка проводилась на кардиомиоцитах тканей сердца мышей, поскольку длина теломер не является надежным диагностическим маркером сердечно-сосудистых заболеваний при измерении в лейкоцитах пациентов (29). Действительно, важно оценить длину теломер в соответствующем типе клеток, кардиомиоцитах. Это ясно из наших результатов, которые показывают, что уменьшенная длина теломер является надежным индикатором сердечной дисфункции в кардиомиоцитах, лишенных дистрофина.Напротив, другие типы мышечных клеток в сердце с дефицитом дистрофина, такие как гладкомышечные клетки сосудистой системы, которым не требуется дистрофин, имеют нормальную длину теломер. Вместе эти результаты подтверждают гипотезу о том, что потребность в сокращении в отсутствие критического сократительного белка, дистрофина, приводит к укорочению теломер в кардиомиоцитах. Кроме того, наши результаты показывают, что длина теломер является неотъемлемой частью здоровья сердца, и предполагают, что вмешательства, которые задерживают или останавливают эрозию теломер, могут быть полезны для пациентов с МДД и стареющего населения с повышенным риском сердечно-сосудистых заболеваний.

Наши результаты также позволяют предположить, что укорочение теломер может быть признаком других генетических дилатационных кардиомиопатий. Соответственно, «гуманизация» теломер моделей мышей, лишенных других белков, необходимых для сокращения, что приводит к дилатационной кардиомиопатии, может лучше воспроизводить фенотип заболевания, наблюдаемый у пациентов с тем же генетическим дефектом. Такие «гуманизированные» модели должны оказаться полезными для понимания этиологии и прогрессирования заболевания, а также для проверки терапевтических вмешательств.

Наше обнаружение повышенных 53bp1 и p53 в mdx 4cv /mTR G2 кардиомиоцитов предполагает, что критический ответ на повреждение ДНК в сочетании с короткими теломерами может быть достаточным. Ранее было показано, что короткие теломеры связаны с индукцией 53bp1 и активацией p53 (16, 19, 22), но не в контексте генетического заболевания сердца. Здесь мы показываем, что активация p53 в mdx 4cv /mTR G2 кардиомиоцитах приводит к заметному снижению митохондриального биогенеза и дыхательного потенциала, очевидным1c9008 Pc9008 в возрасте 8 недель — момент, когда дилатационная кардиомиопатия не выявляется с помощью электрокардиографии, эхокардиограммы или МРТ (15). Точно так же p53 был вовлечен в TERT G4 нулевых мышей, мышиную модель преждевременного старения, связанного с повсеместным укорочением теломер в результате отсутствия белкового компонента теломеразы. У этих мышей обычно развивается митохондриальная дисфункция из-за p53-зависимого ингибирования PGC1α/β и дилатационной кардиомиопатии на G4, но это можно предотвратить, если у мышей отсутствует p53 в результате генетической абляции (19). В скелетных мышцах отсутствие Pgc1α приводит к потере митохондриальной целостности и ремоделированию, частично из-за положительной регуляции белка mitofusion 2 (Mfn2) (30).Кроме того, специфичная для сердца делеция Mfn1/2 у мышей приводит к повышенной фрагментации митохондрий и летальной дилатационной кардиомиопатии (31). Примечательно, что кардиомиоциты с дефицитом дистрофина, как было показано другими, демонстрируют повышенный уровень АФК при механическом растяжении (32), а высокий уровень АФК в непролиферирующих фибробластах вызывает укорочение теломер (33). Наш вывод о том, что лечение MnTBAP способно восстанавливать митохондриальное дыхание (рис. 4) и увеличивать выживаемость (15), предполагает, что улучшение митохондриальной функции может улучшить сердечную функцию.

Недавний отчет показал, что дистрофин функционирует не только как структурный сократительный белок, но также регулирует асимметричное деление стволовых клеток скелетных мышц (34). Здесь мы показываем, что дистрофин также может защищать кардиомиоциты от истощения теломер и предотвращать митохондриальную компрометацию. Мы также предоставляем молекулярную и метаболическую характеристику дистрофических кардиомиоцитов. Кроме того, наши исследования выявили взаимосвязь между длиной теломер и митохондриальным гомеостазом, которая имеет фундаментальное значение для этиологии кардиомиопатии МДД.В совокупности наши данные свидетельствуют о том, что вмешательства, восстанавливающие биогенез митохондрий, увеличивающие количество белков, покрывающих теломеры, или индуцирующие удлинение теломер, могут остановить или отсрочить начало дилатационной кардиомиопатии при МДД.

Материалы и методы

Мыши.

Все протоколы были одобрены Административной комиссией Стэнфордского университета по уходу за лабораторными животными. Мышей C57BL6 mdx 4cv и мышей C57BL6 mTR Het использовали для создания животных с двойными мутациями, как описано ранее (15).Поскольку заболевание человека сцеплено с Х-хромосомой, наши исследования были ограничены самцами мышей. Точное количество животных для каждого набора данных и все соответствующие детали, касающиеся размера выборки, сообщаются с каждым экспериментом.

Анализы кардиомиоцитов взрослых.

Сердца вырезали и использовали для перфузии по Лангендорфу ex vivo для выделения зрелых кардиомиоцитов. Изолированные кардиомиоциты использовали непосредственно или давали им прикрепиться при 37 °C к предварительно покрытым ламинином (1:100 в dH 2 O, Sigma, L2020) черным 96-луночным планшетам с прозрачным дном (Corning Costar, 3603) в бессывороточных кардиомиоцитах. Среда AW (Cellutron, m-8034).Среду меняли через 1 ч, и клетки инкубировали в течение 30 мин при 37 °C с различными флуоресцентными красителями от Life Technologies: реагентом CellROX Deep Red (C10422), индикатором митохондриального супероксида MitoSOX Red (M36008) и тетраметилродамином, метиловым эфиром и перхлорат (ТМРМ; Т-668). Сигнал был обнаружен с помощью машины Tecan Infinite M1000 PRO в Стэнфордском центре высокопроизводительных биологических исследований. Для измерения митохондриального дыхания 5000 выделенных кардиомиоцитов высевали на покрытые ламинином микропланшеты XF96 в присутствии базальной (только среда для анализа XF), глюкозы (5 мкМ глюкозы) или пальмитата (набор субстратов XF Palmitate-BSA FAO; Seahorse Biosciences) и анализировали в соответствии с инструкции производителя.Уровни внутриклеточного АТФ измеряли с использованием набора для колориметрического/флуорометрического анализа АТФ (Biovision). РНК кардиомиоцитов экстрагировали с использованием набора RNeasy Micro Kit (Qiagen) и набора для обратной транскрипции кДНК высокой емкости (Life Sciences) для создания кДНК для RT-qPCR с различными зондами Taqman (таблица S1). Клеточные лизаты собирали в буфере для радиоиммунопреципитации и проводили иммуноблотинг, как описано ранее (35).

Таблица S1.

Зонды Taqman, использованные в этом исследовании

Telomere Q-FISH и иммунофлуоресценция и получение изображений.

Сердца вырезали в указанном возрасте и фиксировали в течение ночи в 4% (об./об.) параформальдегиде в PBS. После прогрессирующей дегидратации тканей этанолом и ксилолом образцы сердца заливали в парафин. Сердечные парафиновые срезы (5 мкм) депарафинизировали в ксилоле и регидратировали в этаноле с последовательными концентрациями. Выделение антигена проводили в цитратном буфере (10 ммоль⋅л -1 цитрата натрия при рН 6,0) в течение 30 мин в пароварке. Теломер Q-FISH был выполнен, как сообщалось ранее, с использованием зондов TelC (15).Предметные стекла блокировали окрашивающим буфером [4% (об./об.) телячьей сыворотки/0,1% Triton X-100/PBS] и окрашивали в течение ночи при 4°C различными первичными антителами: мышиные K i -67 (1: 50; BD, 556003), мышиный фосфо-Hist3 (1:50; Cell Signaling, 9706L). После промывания блокирующим раствором предметные стекла инкубировали с соответствующими вторичными антителами Alexa 594 (1:400; Abcam) в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре. Предметные стекла снова промывали PBS, фиксировали в 4% (об./об.) параформальдегиде (PFA) в течение 5 минут, промывали PBS, а затем инкубировали с предварительно разведенными мышиными антителами к сердечному тропонину t (Abcam ab74275) в течение 1 часа при комнатной температуре. , промывали PBS и инкубировали с соответствующим вторичным антителом Alexa 488 (1:400; Abcam) в течение 1 ч в темноте при комнатной температуре.Затем предметные стекла промывали PBS, докрашивали 1 мкг⋅мл раствора -1 DAPI в PBS в течение 5 минут, промывали dH 2 O, сушили на воздухе и покрывали ProLong Gold Antifade (Life Technologies). Изображения были получены на конфокальном микроскопе Nikon Spinning Disk с использованием программы NIS-Elements (Nikon).

Проточная цитометрия.

Кардиомиоциты, выделенные по Лангендорфу, немедленно фиксировали в растворе CytoFix/CytoPerm (BD) в течение 10 мин и ресуспендировали в растворе CytoPerm. Для анализа BrdU мышам вводили реагент для мечения BrdU (Life Technologies) за 24 часа до выделения кардиомиоцитов. Кардиомиоциты окрашивали в растворе CytoPerm в течение ночи при 4 °С различными первичными антителами: кроличьи 53bp1 (1:400; Novus, NB100-304), мышиные р53 (1:400; Vector Lab, VP-P956), мышиные K . i -67 (1:50; BD, 556003), мышиный фосфо-Hist3 (1:50; Cell Signaling, 9706L), мышиный BrdU (BD, 347580) и p21 (1:100; Santa Cruz Biotechnology, sc) -397). Все образцы были проанализированы на BD FACSCalibur (BD Biosciences).

Протеомный анализ.

Взрослые кардиомиоциты мышей mdx/mTR KO и mTR KO (по три от каждой) выделяли с использованием протокола выделения Langendorff. Цитозольные и ядерные фракции выделяли с использованием набора для экстракции NE-PER (Thermo Part No. 78833). Клеточные лизаты разбавляли до 2 мг/мл в 50 мМ Hepes при pH 8,0, 0,1% SDS и восстанавливали 5 мМ TCEP [трис(2-карбоксиэтил)фосфин] (Thermo Part No. 77720) в течение 1 ч при 50 °C. . Восстановленные белки метили реагентами йодоТМТ в концентрации 5–10 мМ (Thermo Part No.

) в течение 1 ч при 37 °С в защищенном от света месте. Избыток реагента йодТМТ, соли и детергента удаляли путем осаждения образцов ацетоном при -20 °С в течение 4–20 ч. Затем белки расщепляли при 37 °C в течение 4 ч с использованием трипсина (Thermo, номер детали

) и обессоливали с помощью центрифуг C18 (Thermo, номер детали 84850). Меченые пептиды (25–100 мкг) ресуспендировали в TBS в концентрации 0,5 мкг/мкл и инкубировали с 20–100 мкл смолы с иммобилизованным антителом против ТМТ (Thermo Part No.

) в течение ночи при встряхивании из стороны в сторону при 4 °C.После сбора несвязанного образца смолу четыре раза промывали 4 М мочевиной/TBS, четыре раза TBS и четыре раза водой. Затем пептиды трижды элюировали буфером для элюирования ТМТ (деталь №

), замораживали и сушили в вакууме перед анализом ЖХ-МС/МС. Всего было идентифицировано 868 белков (с использованием минимума трех пептидов). Биоинформатический анализ выполняли как для белков с повышающей (+1,2-кратная отсечка), так и с понижающей (-1,2-кратная отсечка) белков, которые были выделены путем сравнения WT с mdx/mTR G2 и mTR G2 с mdx/ МТР G2 самостоятельно.Был использован анализ Gene Ontology [программа DAVID/EASE (36)].

Статистический анализ.

Все данные представлены как среднее значение ± стандартная ошибка среднего для нескольких экспериментов. Статистический анализ был рассчитан с использованием однофакторного дисперсионного анализа с апостериорной поправкой Бонферрони, непараметрического критерия Крускала-Уоллиса с поправкой Данна для множественных сравнений или двустороннего критерия Стьюдента t . Статистическую значимость учитывали при *P<0,05, **P<0,01,***P<0.001, **** Р < 0,0001. Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Исходные данные показаны в наборе данных S2.

Благодарности

Мы благодарим Allis Chien, Chris Adams и Ryan Leib за их помощь в разработке, проведении и анализе протеомных исследований, которые были поддержаны начальным грантом Стэнфордского университета для масс-спектрометрии (для A.C.Y.C. и HMB). Это исследование было поддержано Фондом Бакстера, Калифорнийским институтом регенеративной медицины (гранты TT3-05501 и RB5-07469 для H.MB), Национальных институтов здравоохранения (гранты AG044815, AG009521, NS089533, AR063963 и AG020961), а также стипендии, включая стипендию декана Стэнфордской школы медицины, стипендию Канадского института исследований в области здравоохранения (201411MFE-338745-169197), American Heart Ассоциация (13POST14480004 для ACYC) и стипендия Американской кардиологической ассоциации (15POST22940013 для S.-GO).

Сноски

  • Вклад авторов: A.C.Y.C. и Х.М.Б. проектное исследование; А.C.Y.C., S.-G.O., E.L.L. и P.E.K. проведенное исследование; A.C.Y.C. и Х.М.Б. проанализированные данные; и A. C.Y.C., A.J.G., J.C.W. и H.M.B. написал бумагу.

  • Рецензенты: B.L.B., Калифорнийский университет, Сан-Франциско; E.S.E., Калифорнийский университет, Сан-Франциско; и НАР, Лаборатория Джексона.

  • Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

  • Эта статья содержит вспомогательную информацию в Интернете по адресу www.pnas.org/lookup/suppl/doi:10.1073/pnas.1615340113/-/DCSдоп.

Бесплатно доступны в Интернете через опцию открытого доступа PNAS.

Воспалительные цитокины нарушают опосредованную программируемой гибелью клеток-1 (PD-1) супрессию Т-клеток при воспалительном артрите за счет повышающей регуляции растворимого PD-1 | Клиническая и экспериментальная иммунология

Резюме

Рецептор программируемой гибели клеток 1 (PD-1) играет важную роль в регуляции активации Т-клеток. Наша цель состояла в том, чтобы определить, как воспаление влияет на подавление Т-клеток, опосредованное PD-1. Анализ с помощью проточной цитометрии мононуклеарных клеток синовиальной жидкости (СЖ) ревматоидного артрита (РА) и псориатического артрита (ПсА) показал увеличение процентного содержания клеток PD-1 + в Т-клеточном компартменте CD4 + и CD8 + . по сравнению с парной периферической кровью (ПБ). При стимуляции in vitro Т-клеточного рецептора (TCR) здоровых контрольных (HC) CD4 + Т-клеток в присутствии связанной с планшетом химеры PD-L1fc наблюдалось значительное снижение пролиферации и секреции интерферона (IFN)-γ. .Напротив, Т-клетки CD4 + из RA и PsA PB и SF оказались устойчивыми к такому ингибированию, опосредованному PD-1. Добавление провоспалительных цитокинов фактора некроза опухоли (TNF)α, интерлейкина (IL)-6 и IL-1β, которые были повышены при РА и ПсА SF по сравнению с остеоартритом (ОА) SF, последовательно отменяло PD-1-опосредованную супрессию при HC. CD4 + Т-клеточные культуры. Этот эффект был обращен ингибиторами этих цитокинов. Уровни растворимого PD-1 (sPD-1) были повышены в супернатантах клеточных культур из культур, стимулированных TNFα и IL-6, по сравнению с необработанными контролями, а также при РА и ПсА, но не при ОА, сыворотке и SF.Функционально добавление sPD-1fc противодействовало опосредованному PD-1 подавлению Т-клеток HC CD4 + и увеличивало пролиферацию Т-клеток в совместных культурах Т-клеток HC CD4 + /моноцитов. Эти результаты in vitro показывают, что CD4 + Т-клетки от пациентов с РА и ПсА проявляют повышенную устойчивость к опосредованной PD-1 супрессии, что может быть частично объяснено присутствием растворимого PD-1 в воспалительной среде. .

Graphical Abstract

Мы проверили гипотезу о том, что путь PD-1/PD-L1 — критический негативный регулятор активации Т-клеток — нарушен в Т-клетках CD4+ у пациентов с воспалительным заболеванием суставов.Наши результаты показывают, что CD4+ Т-клетки пациентов с ревматоидным или псориатическим артритом проявляют повышенную устойчивость к регуляции, опосредованной PD-1, по сравнению со здоровыми донорскими клетками. Механически мы предоставляем доказательства того, что при воспалительных состояниях уровни растворимого PD-1 увеличиваются, что может мешать эффективному лигированию PD-1.

Graphical Abstract

Мы проверили гипотезу о том, что путь PD-1/PD-L1 — критический негативный регулятор активации Т-клеток — нарушен в Т-клетках CD4+ у пациентов с воспалительным заболеванием суставов.Наши результаты показывают, что CD4+ Т-клетки пациентов с ревматоидным или псориатическим артритом проявляют повышенную устойчивость к регуляции, опосредованной PD-1, по сравнению со здоровыми донорскими клетками. Механически мы предоставляем доказательства того, что при воспалительных состояниях уровни растворимого PD-1 увеличиваются, что может мешать эффективному лигированию PD-1.

Введение

Рецептор программируемой гибели клеток 1 (PD-1), трансмембранный белок и член семейства B7, играет решающую роль в регуляции Т-клеток [1]. PD-1 экспрессируется на Т-клетках, где его экспрессия увеличивается в течение первых 24 часов после активации Т-клеток и снижается при клиренсе антигена [2,3,4]. При лигировании PD-1 его лигандами (PD-L1/B7-h2 и PD-L2/B7-DC) ответы Т-клеток подавляются [5,6]. Лигирование PD-1 приводит к ингибированию пути фосфатидилинозитол-3-киназы (PI3K), что приводит к снижению фосфорилирования Akt (протеинкиназы B) и снижению экспрессии факторов транскрипции GATA-3, T-bet и Eomes [7,8]. Общий эффект лигирования PD-1 заключается в снижении активации Т-клеток и продукции цитокинов [9,10,11,12].Клиническая значимость PD-1 в иммунной регуляции подтверждается недавним успехом блокады PD-1 при лечении некоторых видов рака на терминальной стадии, что приводит к снижению опухолевой массы и усилению противоопухолевого иммунитета у значительного числа пациентов [13]. ,14]. Наоборот, при воспалительных состояниях было документально подтверждено, что нарушение гена PD-1 ( pdcd1 ) у мышей приводит к волчаночноподобному синдрому, пролиферативному артриту, диабету, аутоиммунной кардиомиопатии и повышенной восприимчивости к артриту, индуцированному коллагеном (КИА). 15,16,17,18,19,20].У людей полиморфизмы в гене PDCD1 были связаны с предрасположенностью к ревматоидному артриту (РА), анкилозирующему спондилиту (АС), системной красной волчанке (СКВ), рассеянному склерозу (РС) и сахарному диабету 1 типа [21,22, 23,24,25].

Несколько исследователей показали, что частоты PD-1 + CD4 + Т-клеток повышены в синовиальной жидкости РА по сравнению с периферической кровью (PB) и здоровым контролем (HC) PB [20,26,27]. Однако, несмотря на высокие уровни этого ингибиторного рецептора в месте воспаления, иммунная система, по-видимому, не способна регулировать постоянную активацию Т-клеток и продукцию цитокинов.Это ставит вопрос о том, нарушается ли путь PD-1 во время воспаления. Указание на дефектный путь PD-1 при РА исходит из исследования, показывающего, что синовиальная жидкость (SF) CD4 + Т-клеток РА демонстрирует сниженное PD-1-опосредованное ингибирование по сравнению с PB-клетками РА [20]. Это говорит о том, что в условиях хронического воспаления путь PD-1 модулируется. До сих пор мало что известно о пути PD-1/PD-L1 в контексте псориатического артрита (ПсА). ПсА и РА, хотя и имеют ряд общих патологических признаков, представляют собой два разных заболевания с серологическими, генетическими и рентгенологическими различиями [28].Здесь мы определили экспрессию PD-1 на Т-клетках из PB и SF пациентов с РА или ПсА и исследовали, как медиаторы воспаления, связанные с РА и ПсА, влияют на PD-1-опосредованное подавление Т-клеток. Наши данные показывают, что CD4 + Т-клетки от пациентов с РА и ПсА скомпрометированы их PD-1-опосредованным ингибированием, и раскрывают потенциальную роль растворимого PD-1 (sPD-1) в аберрантной PD-1-опосредованной регуляции. при этих заболеваниях.

Материалы и методы

Пациенты и здоровые добровольцы

Гепаринизированный PB и соответствующие образцы SF были получены от пациентов с РА и ПсА, набранных из амбулаторной ревматологической клиники в больнице Гая и Сент-Томаса NHS Trust (Лондон, Великобритания). Информация о клинических и демографических параметрах представлена ​​во вспомогательной информации, таблица 1. Субъекты HC были набраны из числа местных студентов и добровольцев из штата. От всех участников было получено письменное информированное согласие. Этическое одобрение было дано Комитетом по этике исследований Bromley (одобрение № 06/Q0705/20) для HC, RA и PsA и Комитетом по этике исследований Guy’s (одобрение № 01/05/01) для остеоартрита (ОА). Все образцы были собраны в соответствии с Хельсинкской декларацией.

Изоляция PBMC, SFMC и подмножества клеток

мононуклеарных клеток PB (PBMC) и мононуклеарных клеток SF (SFMC) выделяли с помощью Lymphoprep™ (Axis-Schield, Осло, Норвегия) центрифугированием в градиенте плотности. Субпопуляции клеток выделяли с помощью магнитной сепарации (Miltenyi Biotech, Бергиш-Гладбах, Германия и Dynabeads Thermofisher, Пейсли, Великобритания), а чистоту определяли с помощью проточной цитометрии. Т-клетки CD4 + (диапазон чистоты 95–99%) выделяли отрицательным выделением из PBMC или SFMC или из клеточных фракций с обедненным CD14, следуя инструкциям производителей.CD14 + моноцитов (диапазон чистоты 96–98%) были положительно отобраны с использованием CD14 MicroBeads (Miltenyi Biotec).

Клеточная культура

Субпопуляции клеток культивировали в течение 5 дней в культуральной среде (RPMI-1640; Gibco, Пейсли, Великобритания) с добавлением 1% пенициллина/стрептомицина, 1% L-глутамина (Gibco) и 10% термоинактивированной фетальной телячьей сыворотки (Gibco ) и поддерживали при 37°C и 5% CO 2 атмосферы. Клетки стимулировали моноклональным антителом (mAb) против CD3, связанным с планшетом (OKT3; Janssen-Cilag Ltd, High Wycombe, UK) (1,5 мкг/мл) только в культурах CD4 + Т-клеток, или растворимым антителом против CD3. -CD3 mAb (OKT3; Janssen-Cilag Ltd) (100 нг/мл) в кокультурах CD4 + T-клеток/CD14 + моноцитов.

Анализ частоты клеток и фенотипа методом проточной цитометрии

Для анализа ex-vivo частоты и фенотипа каждой субпопуляции клеток РВМС или SFMC окрашивали внеклеточно в течение 30 минут при 4°C с использованием различных комбинаций следующих антител: флуоресцеинизотиоцианат (FITC), конъюгированный с CD279 (PD-1 ; BioLegend, Кембридж, Великобритания), CD274, конъюгированный с фикоэритрином (PE) (PD-L1; BD Pharmingen, Оксфорд, Великобритания), CD3, конъюгированный с PE/цианином 7 (Cy7) (Biolegend), перидинин-хлорофилл (PerCP)/Cy5· CD4, конъюгированный с 5 (Biolegend), CD8, конъюгированный с PacBlue (Biolegend), CD8, конъюгированный с аллофикоцианином (APC) (Biolegend), и CD14, конъюгированный с Vio770 (Miltenyi Biotech).После поверхностного окрашивания клетки фиксировали в 2% параформальдегиде (PFA) в течение 15 минут при 4°C, дважды промывали и собирали на сортировщике клеток с активированной флуоресценцией (FACS)Calibur или BD FACSCanto II. Данные анализировали с использованием программного обеспечения FlowJo (версия 7.6.5; Tree Star, Ashland, OR, USA).

Анализы пролиферации Т-клеток и лигирования PD-1

96-луночные планшеты с плоским дном (Costar, Corning Inc., Corning, NY, USA) покрывали mAb против CD3 (OKT3; Janssen-Cilag Ltd) (1,5 мкг/мл) и либо PD-L1fc, либо иммуноглобулин (Ig)G1fc (R&D Systems, Абингдон, Великобритания) (в пределах от 0 до 5 мкг/мл согласно эксперименту) в растворе фосфатно-солевого буфера ( PBS) (Sigma Aldrich, Пул, Великобритания) в течение 4 ч при 37°C и 5% CO 2 .Планшеты дважды промывали PBS перед добавлением клеток для культивирования. CD4 + Т-клетки выделяли из криоконсервированных МПК HC, RA и PsA PBMC и RA и PsA SFMC и высевали в концентрации 1×10 5 клеток на лунку в конечном объеме 200 мкл культуральной среды. В некоторые культуры добавляли человеческий рекомбинантный фактор некроза опухоли (hrTNF)α, человеческий рекомбинантный интерлейкин (hrIL)-6 или hrIL-1β (все в концентрации 10 нг/мл; R&D Systems) в отсутствие или в присутствии препарата против TNFα адалимумаба. (AbbVie, Чикаго, Иллинойс, США), лекарство против IL-6R тоцилизумаб (Roche, Базель, Швейцария) или mAb против IL-1β (R&D Systems) (все в концентрации 1 мкг/мл).В некоторых культурах Т-клетки HC CD4 + культивировали в планшетах, покрытых PD-L1fc (0, 0,1 и 1 мкг/мл), в присутствии растворимого PD-1fc (0,5 и 1 мкг/мл; системы НИОКР). В других экспериментах свежевыделенные Т-клетки HC CD4 + и аутологичные моноциты CD14 + (используемые в качестве источника лиганда PD-L1) совместно культивировали в 96-луночных планшетах с плоским дном (Costar, Corning Inc.) в соотношении 1 : 1 (всего клеток на лунку 1 × 10 5 ) в культуральной среде, содержащей 100 нг/мл растворимых mAb против CD3 и растворимых PD-1fc или IgG1fc (0, 0,25, 0,5 и 1 мкг /мл).Во всех анализах на 4-й день клетки обрабатывали [ 3 H]-тимидином (0,25 мкКи/лунку) (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) и пролиферацию Т-клеток оценивали через 18 ч (на 5-й день). ) с использованием сцинтилляционного счетчика Topcount (Perkin Elmer, Кембридж, Великобритания). Пролиферацию определяли и выражали числом импульсов в минуту (имп/мин) и подавлением пролиферации Т-клеток (%) по следующей формуле: [(условие только среды - условие PD-L1fc)/условие только среды] × 100.

Обнаружение растворимых цитокинов и растворимого PD-1

CD4 + Супернатанты культур Т-клеток собирали на 5-й день и хранили при -80°C.Уровни IFN-γ определяли с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) с использованием стандартного набора ELISA MAX™ (Biolegend). Уровни sPD-1 определяли с помощью ELISA DuoSet PD-1 человека (R&D Systems). Образцы сыворотки от доноров HC и образцы сыворотки и парных бесклеточных образцов SF от пациентов с OA, RA или PsA собирали и хранили при -80°C до анализа с помощью ELISA (для sPD-1; R&D Systems) или Bio-Plex Pro™ (для TNFα, IL-6 и IL-1β; Bio-Rad Laboratories) на платформе Luminex FlexMap 3D (Luminex Corporation, Остин, Техас, США).Все анализы проводились в соответствии с протоколами производителей.

Экстракция РНК и количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (RT-qPCR)

Тотальную РНК выделяли с использованием системы ReliaPrep™ RNA cell Miniprep System (Promega, Southampton, UK) в соответствии с протоколом производителя. Синтез кДНК проводили с использованием набора для обратной транскрипции кДНК большой емкости (Applied Biosystems, Фостер-Сити, Калифорния, США), а экспрессию мРНК PD-1Δex3 определяли с использованием набора SensiMix™ SYBR No-ROX (Bioline, Лондон, Великобритания).Данные собирали и анализировали на термоциклере Rotor-Gene Q (Qiagen, Hilden, Germany). Ген β-актина использовали в качестве эндогенного контроля, и относительную экспрессию гена выражали как 2 –ΔΔCT . Пары праймеров для ПЦР (IDT, Левен, Бельгия) были следующими: PD-1Δex3, 5′-AGGGTGACAGGGACAATAGG-3′ и 5′-CCATAGTCCACAGAGAACAC-3′, β-актин, 5′-ATTGGCAATGAGCGGTTC-3′ и 5′-CGTGGATGCCACAGGACT. −3′.

Статистический анализ

Тестирование значимости проводилось с помощью программного обеспечения GraphPad Prism (версия 7; GraphPad, Ла-Хойя, Калифорния, США) с использованием соответствующих статистических тестов, как указано в подписях к рисункам.

Результаты

PD-1

+ Частота Т-клеток повышена в синовиальной жидкости при РА и ПсА по сравнению с периферической кровью

Сначала мы исследовали частоты клеток PD-1 + среди Т-клеток в ПБ и парных СФ у пациентов с РА и ПсА. Значительно увеличенный процент клеток PD-1 + был обнаружен в SF CD4 + Т-клетках (обозначенных как CD3 + CD14 CD4 + клеток или CD3 + CD8 – клеток) по сравнению с к ПБ (рис. 1а,б). Кроме того, повышенный процент клеток PD-1 + был обнаружен в компартменте Т-клеток SF CD8 + как при РА, так и при ПсА (рис. 1c, d).

Рис. 1.

Запрограммированная гибель клеток 1 (PD-1) + Частота Т-клеток повышена при ревматоидном артрите (РА) и псориатическом артрите (ПсА) в синовиальной жидкости по сравнению с периферической кровью. Частоты PD-1 + Т-клеток были проанализированы ex vivo с помощью проточной цитометрии в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) и мононуклеарных клетках синовиальной жидкости (SFMC) у пациентов с РА и ПсА.( а ) Контурный график клеток CD3 + CD14 CD4 + PD-1 + из парных РВМС и SFMC одного репрезентативного донора ПсА. (б) Кумулятивные данные, показывающие процент клеток PD-1 + в CD3 + или CD3 или CD3 CD14 CD4 (RA N = 10; PSA N = 11) Популяции клеток PB и SF. ( c ) Контурный график клеток CD3 + CD8 + PD-1 + из парных РВМС и SFMC одного репрезентативного донора РА.( d ) Совокупные данные, показывающие процент клеток PD-1 + в CD3 + CD8 + (RA n  = 7; PsA n  = 8) клеточных популяций PB и SF. Данные были проанализированы с помощью критерия знакового ранга Уилкоксона для согласованных пар. * P  < 0,05, ** P  < 0,01 и *** P  < 0,001. Окрашивание изотипического контроля показало результат, аналогичный окрашиванию флуоресценцией минус 1 (FMO) (вспомогательная информация, рис. S5).

Рис. 1.

Запрограммированная гибель клеток 1 (PD-1) + Частота Т-клеток повышена при ревматоидном артрите (РА) и псориатическом артрите (ПсА) в синовиальной жидкости по сравнению с периферической кровью.Частоты PD-1 + Т-клеток были проанализированы ex vivo с помощью проточной цитометрии в мононуклеарных клетках периферической крови (PBMC) и мононуклеарных клетках синовиальной жидкости (SFMC) у пациентов с РА и ПсА. ( а ) Контурный график клеток CD3 + CD14 CD4 + PD-1 + из парных РВМС и SFMC одного репрезентативного донора ПсА. (б) Кумулятивные данные, показывающие процент клеток PD-1 + в CD3 + или CD3 или CD3 CD14 CD4 (RA N = 10; PSA N = 11) Популяции клеток PB и SF.( c ) Контурный график клеток CD3 + CD8 + PD-1 + из парных РВМС и SFMC одного репрезентативного донора РА. ( d ) Совокупные данные, показывающие процент клеток PD-1 + в CD3 + CD8 + (RA n  = 7; PsA n  = 8) клеточных популяций PB и SF. Данные были проанализированы с помощью критерия знакового ранга Уилкоксона для согласованных пар. * P  < 0,05, ** P  < 0,01 и *** P  < 0,001. Окрашивание изотипическим контролем показало результат, аналогичный окрашиванию флуоресценцией минус 1 (FMO) (вспомогательная информация, рис. С5).

Лигирование PD-1 снижает пролиферацию CD4

+ Т-клеток здоровых доноров, но не CD4 + Т-клеток пациентов с РА или ПсА

Чтобы выяснить, является ли экспрессия PD-1 функциональной при РА и ПсА, мы провели анализ лигирования PD-1 с использованием планшетов, покрытых анти-CD3 и PD-L1fc (или IgG1fc в качестве контроля), на основе ранее описанных протоколов [9]. ,29,30]. Как и ожидалось, лигирование PD-1 приводило к значительному и дозозависимому снижению пролиферации Т-клеток CD4 + , полученных из здорового контроля PB, в то время как в присутствии контроля IgG1fc эффекта не наблюдалось (фиг.2а,б). Продукция IFN-γ также ингибировалась в зависимости от дозы PD-L1fc (дополнительная информация, рис. S1a). Затем мы сравнили лигирование PD-1 полученных из PB CD4 + Т-клеток от здоровых доноров и пациентов с РА в параллельных экспериментах. В отличие от супрессивных эффектов на пролиферацию Т-клеток, наблюдаемых при лигировании PD-1 Т-клеток CD4 + от здоровых доноров, Т-клетки CD4 + от пациентов с РА оказались устойчивыми к опосредованной PD-1 супрессии Т-лимфоцитов. пролиферация клеток (рис.2в,г). Затем мы культивировали CD4 + Т-клетки из крови и синовиальной жидкости пациентов с РА и ПсА с возрастающими дозами PD-L1fc, связанного с пластинами. Даже при самой высокой дозе PD-L1fc (5 мкг/мл) мы не обнаружили снижения пролиферации Т-клеток при лигировании PD-1 (рис. 2e,f). Точно так же, когда супернатанты клеточных культур RA и PsA были протестированы на продукцию IFN-γ, мы не смогли обнаружить последовательное снижение уровней IFN-γ (вспомогательная информация, рис. S1b). Эти данные показывают, что CD4 + Т-клетки из крови и синовиальной жидкости пациентов с РА или ПсА устойчивы к лигированию PD-1 по сравнению со здоровыми контрольными клетками.

Рис. 2.

Лигирование программируемой гибели клеток-1 (PD-1) снижает пролиферацию CD4 + Т-клеток от здоровых доноров, но не CD4 + Т-клеток от пациентов с ревматоидным артритом (РА) или псориатическим артритом ( ПсА). (a–f) CD4 + Т-клетки были выделены из здоровых контрольных (HC) мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) и RA и PsA PBMC и мононуклеарных клеток синовиальной жидкости (SFMC) и культивированы в течение 5 дней в чашках, предварительно покрытых анти- Моноклональное антитело к CD3 (mAb) (OKT3; 1,5 мкг/мл) и PD-L1fc/IgG1fc (0, 0,1, 1, 2 и 5 мкг/мл). Пролиферацию оценивали на 5-й день по включению [ 3 H]-тимидина. (а) пролиферация Т-клеток HC CD4 + (имп/мин) и (б) подавление пролиферации после лигирования PD-1 с помощью PD-L1fc ( n  = 7) или иммуноглобулина (Ig)G1fc ( n  = 5– 7). (c) Пролиферация клеток (cpm) и (d) подавление пролиферации CD4 + T-клеток, выделенных из HC и RA PBMC ( n  = 9) в присутствии PD-L1fc. (д) Пролиферация клеток (имп/мин) и (е) подавление пролиферации CD4 + Т-клеток, выделенных из РВМС РА и ПсА и парных SFMC в присутствии PD-L1fc ( n  = 3 RA PB/SF; n  = 4 PsA PB/SF).Данные анализировали с помощью критерия Фридмана с критерием множественного сравнения Данна. * P  < 0,05, ** P  < 0,01 и *** P  < 0,001. Данные в (b, d, f) показывают среднее   ±   стандартную ошибку среднего.

Рис. 2.

Лигирование программируемой гибели клеток-1 (PD-1) снижает пролиферацию CD4 + Т-клеток от здоровых доноров, но не CD4 + Т-клеток от пациентов с ревматоидным артритом (РА) или псориатическим артритом (ПсА). (a–f) CD4 + Т-клетки были выделены из здоровых контрольных (HC) мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) и RA и PsA PBMC и мононуклеарных клеток синовиальной жидкости (SFMC) и культивированы в течение 5 дней в чашках, предварительно покрытых анти- Моноклональное антитело к CD3 (mAb) (OKT3; 1,5 мкг/мл) и PD-L1fc/IgG1fc (0, 0,1, 1, 2 и 5 мкг/мл).Пролиферацию оценивали на 5-й день по включению [ 3 H]-тимидина. (а) пролиферация Т-клеток HC CD4 + (имп/мин) и (б) подавление пролиферации после лигирования PD-1 с помощью PD-L1fc ( n  = 7) или иммуноглобулина (Ig)G1fc ( n  = 5– 7). (c) Пролиферация клеток (cpm) и (d) подавление пролиферации CD4 + T-клеток, выделенных из HC и RA PBMC ( n  = 9) в присутствии PD-L1fc. (д) Пролиферация клеток (имп/мин) и (е) подавление пролиферации CD4 + Т-клеток, выделенных из РВМС РА и ПсА и парных SFMC в присутствии PD-L1fc ( n  = 3 RA PB/SF; n  = 4 PsA PB/SF). Данные анализировали с помощью критерия Фридмана с критерием множественного сравнения Данна. * P  < 0,05, ** P  < 0,01 и *** P  < 0,001. Данные в (b, d, f) показывают среднее   ±   стандартную ошибку среднего.

TNFα, IL-6 и IL-1β противодействуют опосредованному PD-1 подавлению CD4

+ Т-клеточной пролиферации

Поскольку Т-клетки CD4 + РА и ПсА, особенно из синовиальной жидкости, происходят из провоспалительной среды, мы стремились изучить, как воспалительные цитокины могут влиять на PD-1-опосредованное подавление Т-клеток.Во-первых, мы определили уровни TNFα, IL-6 и IL-1β в сыворотке, полученной из РА и ПсА, и парном SF, по сравнению со здоровой сывороткой и сывороткой и SF у пациентов с остеоартритом (ОА) с контролем заболевания. Повышенные уровни всех трех цитокинов были обнаружены в SF как RA, так и PsA по сравнению с сывороткой HC или SF OA (рис. 3a, b). Эти данные подтверждают воспалительную природу СФ как при РА, так и при ПсА. В проанализированных сыворотках при РА и ПсА мы обнаружили лишь незначительное увеличение TNFα и IL-6 по сравнению со здоровой или контрольной сывороткой при ОА.

Рис. 3.

Фактор некроза опухоли (TNF)α, интерлейкин (IL)-6 и IL-1β противодействуют опосредованному лигандом 1 (PD-L1) запрограммированной гибели клеток подавлению здорового контроля (HC) CD4 + Т-клеточная пролиферация. (а,б) Уровни провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-1β при парном ревматоидном артрите (РА) и псориатическом артрите (ПсА) сыворотка/синовиальная жидкость (СЖ) ( n  = 12), при остеоартрите (ОА ) (контроль заболевания) сыворотка/SF ( n  = 3–4) и в сыворотке HC ( n  = 7).Критерий знакового ранга Вилкоксона для сыворотки РА/ПсА по сравнению с SF РА/ПсА и критерий Манна-Уитни для РА/ПсА SF по сравнению с HC сыворотки или ОА SF. * P  < 0,05, ** P  < 0,01 и *** P  < 0,001. (c) Планшеты покрывали PD-L1fc в указанных концентрациях, и оценивали опосредованное PD-L1 подавление пролиферации CD4 + Т-клеток из HC PB в отсутствие (среда, M) или в присутствии 10 нг/мл. TNFα ( n  = 9), IL-6 ( n  = 5) или IL-1β ( n  = 6) ± анти-TNFα (адалимумаб; ADA), анти-IL-6R (тоцилизумаб; TOC ) и анти-ИЛ-1β (все в концентрации 1 мкг/мл).Данные в (c) были проанализированы с помощью критерия знакового ранга Уилкоксона для согласованных пар. * P  < 0,05 и ** P  < 0,01.

Рис. 3.

Фактор некроза опухоли (TNF)α, интерлейкин (IL)-6 и IL-1β противодействуют опосредованному лигандом 1 (PD-L1) запрограммированной гибели клеток подавлению CD4 здорового контроля (HC) + Т-клеточная пролиферация. (а,б) Уровни провоспалительных цитокинов TNFα, IL-6 и IL-1β при парном ревматоидном артрите (РА) и псориатическом артрите (ПсА) сыворотка/синовиальная жидкость (СЖ) ( n  = 12), при остеоартрите (ОА ) (контроль заболевания) сыворотка/SF ( n  = 3–4) и в сыворотке HC ( n  = 7). Критерий знакового ранга Вилкоксона для сыворотки РА/ПсА по сравнению с SF РА/ПсА и критерий Манна-Уитни для РА/ПсА SF по сравнению с HC сыворотки или ОА SF. * P  < 0,05, ** P  < 0,01 и *** P  < 0,001. (c) Планшеты покрывали PD-L1fc в указанных концентрациях, и оценивали опосредованное PD-L1 подавление пролиферации CD4 + Т-клеток из HC PB в отсутствие (среда, M) или в присутствии 10 нг/мл. TNFα ( n  = 9), IL-6 ( n  = 5) или IL-1β ( n  = 6) ± анти-TNFα (адалимумаб; ADA), анти-IL-6R (тоцилизумаб; TOC ) и анти-ИЛ-1β (все в концентрации 1 мкг/мл).Данные в (c) были проанализированы с помощью критерия знакового ранга Уилкоксона для согласованных пар. * P  < 0,05 и ** P  < 0,01.

Затем мы оценили, оказывает ли присутствие TNFα, IL-6 или IL-1β функциональное влияние на опосредованное PD-1 подавление пролиферации CD4 + Т-клеток. Т-клетки HC CD4 + культивировали с возрастающими концентрациями PD-L1fc (0, 0·1 и 1 мкг/мл) в отсутствие или в присутствии TNFα, IL-6 или IL-1β (10 нг/мл). Чтобы блокировать действие цитокинов, в начале культивирования, где указано, добавляли лекарство против TNFα адалимумаб, лекарство против IL-6R тоцилизумаб или mAb против IL-1β (1 мкг/мл).Добавление каждого отдельного цитокина было способно отменить подавляющее действие лигирования PD-1 на пролиферацию Т-клеток CD4 + при концентрациях PD-L1 как 0,1, так и 1 мкг/мл (фиг. 3c). В каждом протестированном образце адалимумаб, тоцилизумаб и mAb против IL-1β были способны полностью обратить вспять эти опосредованные цитокинами эффекты. Вместе эти данные указывают на то, что воспалительные цитокины, связанные с РА и ПсА, TNFα, IL-6 и IL-1β могут противодействовать супрессивным эффектам лигирования PD-1 на CD4 + T-клетки, по крайней мере in vitro .

Растворимый PD-1 (sPD-1) индуцируется

in vitro TNFα и IL-6 в культурах HC CD4 + T-клеток и может быть обнаружен в сыворотке и SF пациентов с РА и ПсА

Продемонстрировав, что TNFα, IL-6 и IL-1β могут быть обнаружены у пациентов с РА и ПсА и что каждый из этих цитокинов аннулирует активность PD-L1fc in vitro , мы попытались определить возможный основной механизм. ELISA-анализ супернатантов Т-клеток HC CD4 + из культур, стимулированных цитокинами, показал, что как TNFα, так и IL-6 были способны индуцировать sPD-1 по сравнению с условиями, содержащими только среду (фиг.4а,б). В культурах, стимулированных IL-1β, не наблюдалось значительного увеличения sPD-1 (рис. 4c). Это увеличение sPD-1 прекращалось в присутствии адалимумаба или тоцилизумаба. Количественный ПЦР-анализ Т-клеток HC CD4 + из тех же культур, стимулированных TNFα и IL-6, выявил увеличение сплайс-варианта PD-1∆ex3 (вспомогательная информация, рис. S2). Эти результаты согласуются с предыдущим исследованием другой группы, в котором сообщалось, что TNFα способствует экспрессии sPD-1 [31], но также идентифицирует IL-6 как индуктор sPD-1 и PD-1∆ex3.

Рис. 4.

Растворимая запрограммированная гибель клеток-1 (sPD-1) индуцируется in vitro фактором некроза опухоли (TNF)α, интерлейкином (IL)-6 в культурах Т-клеток HC CD4 + и может обнаруживаются в сыворотке и синовиальной жидкости (СЖ) больных ревматоидным артритом (РА) и псориатическим артритом (ПсА). (a–c) Уровни sPD-1 в супернатантах здорового контроля (HC) CD4 + Т-клеток, стимулированных (a) TNFα (10 нг/мл) или TNFα+ адалимумаб (ADA; 1 мкг/мл) ( н = 7), (б) ИЛ-6 (10 нг/мл) или ИЛ-6+ тоцилизумаб (ТОС; 1 мкг/мл) ( n = 5–-7) и (в) ИЛ-1β (10 нг/мл) или IL-1β+ анти-IL-1β (анти-IL-1β; 1 мкг/мл) ( n = 5).(d) уровни sPD-1 (медиана с межквартильным диапазоном) при РА и ПсА в паре сыворотка/синовиальная жидкость (СЖ) и при остеоартрите (ОА) сыворотка/СЖ (ОА, n = 3–4; РА, n = 17; ПсА, n = 18). (e) уровни sPD-1 (медиана с межквартильным диапазоном) при ОА ( n = 3–4), РА ( n = 5) и ПсА ( n = 6–7) в сыворотке и SF пациенты, получавшие TNFi , по сравнению с терапией без TNFi. Данные в (a, b, c, e) были проанализированы с помощью теста Манна-Уитни, а данные в (d) были проанализированы с помощью теста Краскела-Уоллиса с тестом множественных сравнений Данна.* P  < 0,05, ** P  < 0,01, *** P  < 0,001.

Рис. 4.

Растворимая запрограммированная гибель клеток-1 (sPD-1) индуцируется in vitro фактором некроза опухоли (TNF)α, интерлейкином (IL)-6 в культурах Т-клеток HC CD4 + и могут быть обнаружены в сыворотке и синовиальной жидкости (СЖ) пациентов с ревматоидным артритом (РА) и псориатическим артритом (ПсА). (a–c) Уровни sPD-1 в супернатантах здорового контроля (HC) CD4 + Т-клеток, стимулированных (a) TNFα (10 нг/мл) или TNFα+ адалимумаб (ADA; 1 мкг/мл) ( н = 7), (б) ИЛ-6 (10 нг/мл) или ИЛ-6+ тоцилизумаб (ТОС; 1 мкг/мл) ( n = 5–-7) и (в) ИЛ-1β (10 нг/мл) или IL-1β+ анти-IL-1β (анти-IL-1β; 1 мкг/мл) ( n = 5).(d) уровни sPD-1 (медиана с межквартильным диапазоном) при РА и ПсА в паре сыворотка/синовиальная жидкость (СЖ) и при остеоартрите (ОА) сыворотка/СЖ (ОА, n = 3–4; РА, n = 17; ПсА, n = 18). (e) уровни sPD-1 (медиана с межквартильным диапазоном) при ОА ( n = 3–4), РА ( n = 5) и ПсА ( n = 6–7) в сыворотке и SF пациенты, получавшие TNFi , по сравнению с терапией без TNFi. Данные в (a, b, c, e) были проанализированы с помощью теста Манна-Уитни, а данные в (d) были проанализированы с помощью теста Краскела-Уоллиса с тестом множественных сравнений Данна.* P  < 0,05, ** P  < 0,01, *** P  < 0,001.

Кроме того, анализ ELISA показал, что sPD-1 не определялся ни в одном из трех образцов сыворотки при ОА и ни в одном из четырех образцов SF при OA, в то время как он был обнаружен на высоких уровнях в 13 из 17 образцов сыворотки RA и 13 из 18 образцов сыворотки и SF при PsA ( рис. 4г). Кроме того, перекрестный анализ сыворотки и SF от пациентов с РА или ПсА, получающих терапию ингибитором TNF (TNFi), выявил более низкие уровни sPD-1 по сравнению с пациентами, не получающими терапию TNFi (рис.4д). Эти данные показывают, что провоспалительные цитокины, такие как TNFα и IL-6, могут модулировать количество sPD-1 in vitro и что терапия TNFi может модулировать уровни sPD-1 в сыворотке и SF пациентов с воспалительным артритом.

sPD-1 модулирует опосредованное PD-1 подавление HC CD4

+ Т-клеток и индуцирует пролиферацию CD4 + T-клеток/CD14 + кокультуры моноцитов

Чтобы выяснить, способен ли sPD-1 модулировать взаимодействия PD-1/PD-L1, мы сначала проверили, способствует ли сам sPD-1fc пролиферации Т-клеток стимулированных анти-CD3 HC CD4 + Т-клеток, культивируемых в отсутствие PD -L1fc.В этих экспериментальных условиях sPD-1fc не вызывал увеличения пролиферации клеток (подтверждающая информация, рис. S3), что свидетельствует об отсутствии прямого воздействия на Т-клетки HC CD4 + . Затем мы культивировали Т-клетки HC CD4 + в присутствии возрастающих количеств лиганда PD-L1fc в отсутствие или в присутствии химеры sPD-1fc (0,5 или 1 мкг/мл). В планшетах, предварительно покрытых PD-L1fc, добавление sPD-1fc способно блокировать активность лиганда дозозависимым образом, что приводит к менее эффективному подавлению пролиферации Т-клеток по сравнению с использованием только среды (рис. 5а,б). Эти данные показывают, что в системе культивирования только Т-клеток CD4 + sPD-1 способен негативно модулировать взаимодействие PD-1/PD-L1, которое в остальном функционально.

Рис. 5.

Растворимая запрограммированная гибель клеток 1 (sPD-1) модулирует PD-1-опосредованное подавление здорового контроля (HC) CD4 + Т-клеток и индуцирует пролиферацию CD4 + Т-клеток/CD14 + кокультур моноцитов. (a) Пролиферация и (b) подавление пролиферации Т-клеток HC CD4 + , культивируемых в планшетах с моноклональным антителом против CD3 (mAb) (OKT3) и предварительно покрытых PD-L1fc с растворимым PD-1fc или без него (0.5 и 1 мкг/мл) ( n = 9–10). (в) Пролиферация и (г) подавление пролиферации Т-клеток HC CD4 + , культивируемых с аутологичными моноцитами CD14 + в соотношении 1 : 1 ( n = 7) в присутствии растворимых mAb против CD3 (100 нг/мл) и растворимый контроль PD-1fc/IgG1fc (0, 0,25, 0,5 и 1 мкг/мл). Данные анализировали с помощью критерия Фридмана с критерием множественных сравнений Данна (а, б) и критерием знакового ранга Уилкоксона (в, г). * P  < 0,05 и *** P  < 0,001.

Рис. 5.

Растворимая запрограммированная гибель клеток 1 (sPD-1) модулирует PD-1-опосредованное подавление здорового контроля (HC) CD4 + Т-клеток и индуцирует пролиферацию CD4 + Т-клеток/CD14 + кокультур моноцитов. (а) Пролиферация и (б) подавление пролиферации Т-клеток HC CD4 + , культивируемых в планшетах с моноклональным антителом против CD3 (mAb) (OKT3) и PD-L1fc, предварительно покрытых растворимым PD-1fc (0,5 и 1 мкг/мл) ( n = 9–10).(в) Пролиферация и (г) подавление пролиферации Т-клеток HC CD4 + , культивируемых с аутологичными моноцитами CD14 + в соотношении 1 : 1 ( n = 7) в присутствии растворимых mAb против CD3 (100 нг/мл) и растворимый контроль PD-1fc/IgG1fc (0, 0,25, 0,5 и 1 мкг/мл). Данные анализировали с помощью критерия Фридмана с критерием множественных сравнений Данна (а, б) и критерием знакового ранга Уилкоксона (в, г). * P  < 0,05 и *** P  < 0,001.

Для дальнейшего изучения способности sPD-1 модулировать взаимодействие PD-1/PD-L1 мы создали систему совместного культивирования с использованием Т-клеток HC CD4 + и аутологичных клеток CD14 + в качестве источника натуральный PD-L1.Способность клеток HC CD14 + экспрессировать PD-L1 тестировали с помощью проточной цитометрии путем культивирования клеток в течение ночи с 10 нг/мл IFN-γ, известного индуктора PD-L1 [27, 32] (дополнительная информация, Рис. S4). Свежевыделенные Т-клетки HC CD4 + и аутологичные моноциты культивировали в соотношении 1 : 1 с растворимыми анти-CD3 mAb (100 нг/мл) в отсутствие или в присутствии возрастающих доз контроля sPD-1 или IgG1fc (0· 25, 0,5 и 1 мкг/мл). Добавление sPD-1fc приводило к значительному дозозависимому увеличению пролиферации Т-клеток по сравнению с контрольными обработанными клетками (фиг. 5в,г). Эти данные показывают, что растворимый рецептор PD-1 может модулировать лигирование PD-1 как в искусственной системе (планшеты, предварительно покрытые PD-L1fc), так и в более физиологическом контексте (в присутствии PD-L1 + APC).

Обсуждение

Настоящее исследование предоставляет данные о нарушенной супрессии, опосредованной PD-1, в CD4 + Т-клетках у пациентов с РА и ПсА. Наше исследование идентифицирует провоспалительные цитокины TNFα, IL-6 и IL-1β как негативные модуляторы PD-1-опосредованной супрессии Т-клеток in vitro и демонстрирует, что sPD-1 способен препятствовать эффективному лигированию PD-1.Насколько нам известно, это первое исследование, в котором одновременно изучается функция PD-1 при РА и ПсА, и предоставляются доказательства того, что воспалительная среда этих двух заболеваний играет роль в модулировании лигирования PD-1.

Мы показываем, что частота клеток PD-1 + в подмножествах CD4 + и CD8 + Т-клеток значительно увеличивается в синовиальной жидкости пациентов с РА или ПсА по сравнению с периферической кровью, что увеличивает результаты предыдущих исследований, посвященных только РА [20,26,27,33]. Увеличение частот Т-клеток PD-1 + свидетельствует о том, что при РА и ПсА PD-1 может играть роль в регуляции эффекторов Т-клеток, особенно в месте воспаления. Однако, несмотря на эту повышенную частоту Т-клеток PD-1 + , воспаление сохраняется, что позволяет предположить, что этот путь нарушен при этих заболеваниях.

На данный момент имеются лишь ограниченные данные о функции PD-1 при воспалительном артрите. Одно исследование с использованием химеры PD-L1fc продемонстрировало, что лигирование PD-1 ингибирует клеточную пролиферацию и выработку IFN-γ CD4 + Т-клетками из периферической крови пациентов с РА, но что синовиальная жидкость CD4 + Т-клеток требует более высоких концентраций PD-L1fc для достижения аналогичных уровней ингибирования [20].Авторы предположили, что воспалительная среда, обнаруженная в суставе RA, может быть причиной снижения PD-1-опосредованной супрессии, поскольку они показали, что добавление бесклеточного SF к PB CD4 + T-клеток RA отрицательно модулировало лигирование PD-1 [4]. 20]. Однако специфический медиатор эффекта не был идентифицирован. Ранее было показано, что обычные цитокины гамма-цепи IL-2, IL-7 и IL-15, а также костимуляция CD28 могут препятствовать перекрестному связыванию PD-1 посредством активации pSTAT-5 [9,29]. .В нашем исследовании мы показываем, что как при РА, так и при ПсА CD4 + Т-клетки из крови и синовиальной жидкости более устойчивы к лигированию PD-1 с точки зрения подавления пролиферации Т-клеток и продукции IFN-γ по сравнению со здоровыми клетки. Мы показываем, что провоспалительные цитокины TNFα, IL-6 и IL-1β обнаруживаются на повышенных уровнях при RA и PsA SF и могут снижать опосредованное PD-1 подавление пролиферации в CD4 + Т-клетках здоровых доноров. Ингибиторы этих цитокинов могут противодействовать этому эффекту.Эти результаты предоставляют дополнительные доказательства того, что присутствие определенных провоспалительных цитокинов может иметь решающее значение для определения результата вовлечения PD-1 во время иммунного ответа.

Механически наши данные демонстрируют, что TNFα и IL-6, но не IL-1β, индуцируют секрецию sPD-1 CD4 + Т-клетками, и что уровни sPD-1 значительно повышаются в сыворотке и SF пациентов с РА или ПсА по сравнению с ОА. Последние данные подтверждают и расширяют результаты двух недавних исследований, показавших, что sPD-1 можно обнаружить в сыворотке и SF пациентов с РА [27,34].В этих исследованиях уровни sPD-1 в сыворотке положительно коррелировали с показателем активности заболевания (DAS28), наличием ревматоидного фактора и уровнями TNFα в RA SF, но не в сыворотке [27,34]. Недавние исследования показали, что экспрессия варианта PD-1Δex3 наблюдается в Т-клетках пациентов с РА, но лишь в минимальной степени в Т-клетках пациентов с ОА или ГХ [27,31]. PD-1∆ex3 представляет собой вариант сплайсинга PD-1, в котором отсутствует трансмембранный домен и предполагаемый продукт трансляции которого является растворимой формой PD-1 [34,35].Было показано, что TNFα, IL-17 и IFN-γ могут повышать экспрессию мРНК сплайс-варианта PD-1Δex3 в здоровых человеческих Т-клетках CD4 + [31]. Наши данные показывают, что в дополнение к этим цитокинам экспрессия белка sPD-1 и экспрессия мРНК сплайс-варианта PD-1Δex3 также могут регулироваться IL-6. Кроме того, предварительный анализ поперечного исследования сыворотки и SF при ПсА и РА позволяет предположить, что пациенты, получавшие терапию TNFi, имеют более низкие уровни sPD-1 по сравнению с пациентами, не получавшими терапию TNFi.Однако необходимы дальнейшие продольные исследования пациентов, получавших адалимумаб или тоцилизумаб, прежде чем можно будет сделать окончательные выводы о влиянии биологических препаратов на уровни sPD-1.

Наши данные показывают, что воспалительные цитокины TNFα и IL-6 могут приводить к повышению уровня сплайс-варианта PD-1Δex3, а также sPD-1. Не исключено, что определенное количество PD-1 может также высвобождаться из клеточной мембраны посредством других механизмов. Наличие высоких уровней некоторых металлопротеиназ (ММР), таких как ММР-9 и ММР-13, было описано ранее при воспалительном артрите [36,37], а недавно было показано, что экспрессия лигандов PD-1 PD-L1 и PD-L2 в фибробластах крайней плоти младенцев можно регулировать посредством протеолитического расщепления с помощью MMP [38]. Будущие исследования могут показать, может ли такое MMP-опосредованное протеолитическое расщепление также способствовать образованию растворимого PD-1.

В частности, мы показываем, используя рекомбинантную химеру PD-1, что sPD-1 функционально способен противодействовать опосредованному PD-L1fc подавлению пролиферации здоровых CD4 + Т-клеток и усиливать пролиферацию CD4 + Т-клеток при совместном культивировании с моноцитами CD14 + , которые могут естественным образом экспрессировать PD-L1. Важно отметить, что недавние исследования аутоиммунного гепатита [39] и кожного системного склероза [40] подтверждают мнение о том, что sPD-1 может вмешиваться в путь PD-1, тем самым нарушая регуляцию Т-клеток.

В совокупности наши данные показывают, что CD4 + T-клетки из PB и SF пациентов с хроническим РА или PsA более устойчивы к PD-1-опосредованной регуляции, чем CD4 + T-клетки от здоровых людей. Мы показываем, что провоспалительные цитокины TNFα, IL-6 и IL-1β, которые присутствуют в повышенных количествах в воспаленных суставах пациентов с РА и ПсА, способны негативно модулировать лигирование PD-1 in vitro . Наконец, мы показываем, что TNFα и IL-6 способны индуцировать sPD-1 в Т-клетках HC CD4 + и что sPD-1 модулирует пролиферацию Т-клеток, препятствуя лигированию PD-1.Таким образом, наши результаты предоставляют новые доказательства того, что воспалительная среда суставов РА и ПсА ставит под угрозу регуляцию Т-клеток, опосредованную PD-1 / PD-L1.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом BTCure от Innovative Medicines Initiative (ref. 115142). Авторы хотели бы поблагодарить профессора Брюса Киркхэма и доктора Эсти Чан из отделения ревматологии Фонда ГСЗ Гая и Сент-Томаса за их помощь в сборе образцов пациентов.Авторы также хотели бы поблагодарить всех пациентов и здоровых добровольцев, сдавших кровь и синовиальную жидкость для проекта. Авторы выражают признательность Министерству здравоохранения за финансовую поддержку через награду Центра биомедицинских исследований Национального института исследований в области здравоохранения (NIHR) фонду NHS Foundation Trust Гая и Сент-Томаса в партнерстве с Королевским колледжем Лондона и Больницей Королевского колледжа NHS Foundation Trust.

Раскрытие информации

Авторы заявили об отсутствии раскрытия информации, касающейся этого исследования.

Вклад авторов

Д. Б. задумал исследование, провел большую часть экспериментов и написал рукопись. CH выполнил некоторые из экспериментов. В. М. К. и Л. С. Т. задумали и руководили исследованием, а также написали рукопись.

Каталожные номера

1

Okazaki

T

,

T

,

Chikuma

S

,

IWAI

Y

,

Fagarasan

S

,

Honjo

T.

 

Реостат для иммунных реакций: уникальные свойства PD-1 и их преимущества для клинического применения

.

Нат Иммунол

 

2013

;

14

:

1212

8

. 2

Нисимура

 

H

,

Агата

 

Y

,

Кавасаки

 

A

 и др.

Регулируемая в процессе развития экспрессия белка PD-1 на поверхности двойных негативных (CD4–CD8–) тимоцитов

.

Int Immunol

 

1996

;

8

:

773

80

. 3

Chemnitz

JM

,

PARRY

RV

,

RV

,

Nichols

KE

,

июня

CH

,

Riley

JL.

 

SHP-1 и SHP-2 связываются с основанным на тирозине иммунорецептором переключающим мотивом запрограммированной смерти 1 при первичной стимуляции Т-клеток человека, но только лигирование рецептора предотвращает активацию Т-клеток

.

J Иммунол

 

2004

;

173

:

945

54

. 4

Барбер

 

DL

,

Wherry

 

EJ

,

Масопуст

 

D

 и др.

Восстановление функции истощенных CD8 Т-клеток при хронической вирусной инфекции

.

Природа

 

2006

;

439

:

682

7

. 5

Чжан

 

X

,

Шварц

 

JC

,

Го

 

X

 и др.

Структурно-функциональный анализ костимуляторного рецептора запрограммированной смерти-1

.

Иммунитет

 

2004

;

20

:

337

47

. 6

Кейр

 

ME

,

Лян

 

SC

,

Гулерия

 

I

 и др.

Тканевая экспрессия PD-L1 опосредует толерантность периферических Т-клеток

.

J Exp Med

 

2006

;

203

:

883

95

.7

Парри

 

RV

,

Хемниц

 

JM

,

Фраувирт

 

KA

 и др.

Рецепторы CTLA-4 и PD-1 ингибируют активацию Т-клеток по разным механизмам

.

Mol Cell Biol

 

2005

;

25

:

9543

53

. 8

Као

 

C

,

Oestreich

 

KJ

,

Палей

 

MA

 и др.

Фактор транскрипции T-bet подавляет экспрессию ингибирующего рецептора PD-1 и поддерживает вирусспецифические ответы CD8 + Т-клеток во время хронической инфекции

.

Нат Иммунол

 

2011

;

12

:

663

71

. 9

Freeman

 

GJ

,

Long

 

AJ

,

Iwai

 

Y

 и др.

Взаимодействие иммуноингибиторного рецептора PD-1 с новым членом семейства B7 приводит к негативной регуляции активации лимфоцитов

.

J Exp Med

 

2000

;

192

:

1027

34

. 10

Latchman

 

Y

,

Wood

 

CR

,

Чернова

 

T

 и др.

PD-L2 является вторым лигандом для PD-1 и ингибирует активацию Т-клеток

.

Нат Иммунол

 

2001

;

2

:

261

8

.] 11

Keir

ME

,

Butte

MJ

,

Freeman

GJ

,

Sharpe

AH

 

PD-1 и его лиганды при толерантности и иммунитете

.

Annu Rev Immunol

 

2008

;

26

:

677

704

.12

Tseng

 

SY

,

Otsuji

 

M

,

Горски

 

K

 и др.

B7-DC, новая молекула дендритных клеток с сильными костимулирующими свойствами для Т-клеток

.

J Exp Med

 

2001

;

193

:

839

46

. 13

Zou

W

,

Wolchok

JD

,

JD

,

CHEN

L.

PD-L.

PD-L1 (B7-H2) и Пути PD-1 Blockade для терапии рака: механизмы, биомаркеры и комбинации и комбинации

.

Sci Transl Med

 

2016

;

8

:

328rv4

. 14

HAMANISHI

J

,

J

,

MANDAI

M

,

MATSUMURA ​​

N

,

,

K

,

Baba

T

,

Konishi

I.

PD-1 / Блокада PD-L1 в лечении рака: перспективы и проблемы

.

Int J Clin Oncol

 

2016

;

21

:

462

73

.15

Nishimura

НИШИМУРА

H

,

H

,

,

HIAI

M

,

HIAI

H

,

H

,

Minaato

N

,

Hontjo

T.

Разработка волчавных аутоиммунных заболеваний с нарушением Ген PD-1, кодирующий иммунорецептор

, несущий мотив ITIM.

Иммунитет

 

1999

;

11

:

141

51

. 16

Нисимура

 

H

,

Окадзаки

 

T

,

Танака

 

Y

 и др.

Аутоиммунная дилатационная кардиомиопатия у мышей с дефицитом рецептора PD-1

.

Наука

 

2001

;

291

:

319

22

. 17

Wang

J

,

Йошида

T

,

T

,

Nakaki

F

,

F

,

,

H

,

Okazaki

T

,

Honsjo

T.

Установление новичков Мыши Pdcd1–/– как эффективная животная модель диабета I типа

.

Proc Natl Acad Sci USA

 

2005

;

102

:

11823

8

. 18

Okazaki

T

,

Honjo

T.

Путь PD-1-PD-L при иммунологической толерантности

.

Тренды Иммунол

 

2006

;

27

:

195

201

. 19

Okazaki

 

T

,

Honjo

 

T.

 

Лиганды PD-1 и PD-1: от открытия до клинического применения

.

Int Immunol

 

2007

;

19

:

813

24

. 20.

Ингибирующий путь запрограммированной смерти 1/лиганда запрограммированной смерти 1 активируется в ревматоидной синовиальной оболочке и регулирует ответы периферических Т-клеток при артрите человека и мыши

.

Ревматоидный артрит

 

2010

;

62

:

1870

80

.21

Kong

 

EK

,

Prokunina-Olsson

 

L

,

Wong

 

WH

 et al.

Новый гаплотип PDCD1 связан с ревматоидным артритом в Гонконге, Китай

.

Ревматоидный артрит

 

2005

;

52

:

1058

62

. 22

Lee

 

SH

,

Lee

 

YA

,

Woo

 

DH

 и др.

Ассоциация полиморфизма гена запрограммированной клеточной смерти 1 (PDCD1) с анкилозирующим спондилитом в корейской популяции

.

Артрит Рес Тер

 

2006

;

8

:

R163

.] 23

Берциас

 

ГК

,

Накоу

 

М

,

Чоулаки

 

С

 и др.

Генетический, иммунологический и иммуногистохимический анализ пути запрограммированной смерти 1/лиганда запрограммированной смерти 1 при системной красной волчанке человека

.

Ревматоидный артрит

 

2009

;

60

:

207

18

.24

Huang

 

CH

,

Wong

 

RH

,

Wei

 

JC

 et al.

Влияние генетических полиморфизмов запрограммированной гибели клеток 1 и ее лигандов на развитие анкилозирующего спондилоартрита

.

Ревматология (Oxf)

 

2011 

;

50

:

1809

13

. 25

James

ES

,

Harney

S

,

S

,

Wordsworth

BP

,

Cookson

WO

,

Davis

SJ

,

Moffatt

MF.

 

PDCD1: тканеспецифический локус чувствительности к наследственным воспалительным заболеваниям

.

Genes Immun

 

2005

;

6

:

430

7

. 26

Hatachi

 

S

,

Iwai

 

Y

,

Kawano

 

S

 и др.

CD4 + PD-1 + Т-клетки накапливаются как уникальные анергические клетки в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите

.

J Ревматол

 

2003

;

30

:

1410

9

.27

Wan

 

B

,

Nie

 

H

,

Liu

 

A

 и др.

Аберрантная регуляция активации синовиальных Т-клеток растворимыми костимулирующими молекулами при ревматоидном артрите

.

J Иммунол

 

2006

;

177

:

8844

50

. 28

Veale

 

DJ

,

Fearon

 

U.

 

Что отличает псориатический и ревматоидный артрит?

 

RMD Открыто

 

2015

;

1

:

e000025

.29

Bennett

 

F

,

Luxenberg

 

D

,

Ling

 

V

 и др.

Вовлечение программы death-1 при активации TCR имеет различные эффекты на костимуляцию и управляемую цитокинами пролиферацию: ослабление ответов ICOS, IL-4 и IL-21, но не CD28, IL-7 и IL-15

.

J Иммунол

 

2003

;

170

:

711

8

. 30

Booke

MJ

,

Keir

Me

,

Phamduy

TB

,

Sharpe

AH

,

Freeman

GJ.

 

Лиганд 1 программируемой смерти-1 специфически взаимодействует с костимулирующей молекулой B7-1, подавляя ответы Т-клеток

.

Иммунитет

 

2007

;

27

:

111

22

.] 31

Лю

 

C

,

Цзян

 

J

,

Гао

 

L

 и др.

Растворимый PD-1 усугубляет прогрессирование индуцированного коллагеном артрита через пути Th2 и Th27

.

Артрит Рес Тер

 

2015

;

17

:

340

32

Донг

H

,

Чжу

G

,

Тамада

K

,

Чен

L.

 

B7-h2, третий член семейства B7, костимулирует пролиферацию Т-клеток и секрецию интерлейкина-10

.

Nat Med

 

1999

;

5

:

1365

9

. 33

Чо

 

BA

,

Sim

 

JH

,

Парк

 

JA

 и др.

Характеристика эффекторной памяти CD8 + Т-клетки в синовиальной жидкости при ревматоидном артрите

.

J Clin Immunol

 

2012

;

32

:

709

20

.34

Greisen

 

SR

,

Rasmussen

 

TK

,

Stengaard-Pedersen

 

K

 et al.

Повышенная растворимая запрограммированная смерть-1 (sPD-1) связана с активностью заболевания и рентгенологическим прогрессированием при раннем ревматоидном артрите

.

Scand J Rheumatol

 

2014

;

43

:

101

8

. 35

Nielsen

C

,

C

,

OHM-Laursen

L

,

BARINGTON

T

,

T

,

HUSBY

S

,

Lillevang

ул.

 

Альтернативные варианты сплайсинга гена PD-1 человека

.

Селл Иммунол

 

2005

;

235

:

109

16

. 36

Линди

 

O

,

Конттинен

 

YT

,

Сорса

 

T

 и др.

Матриксная металлопротеиназа 13 (коллагеназа 3) в синовиальной оболочке человека при ревматоидном артрите

.

Ревматоидный артрит

 

1997

;

40

:

1391

9

.37

Gruber

 

BL

,

Sorbi

 

D

,

French

 

DL

 и др.

Заметно повышенный уровень MMP-9 (желатиназы B) в сыворотке крови при ревматоидном артрите: потенциально полезный лабораторный маркер

.

Клин Иммунол Иммунопатол

 

1996

;

78

:

161

71

. 38

Dezutter-Dambuyant

C

,

Durand

I

,

Alberti

L

et al.

Новая регуляция лигандов PD-1 на мезенхимальных стромальных клетках посредством MMP-опосредованного протеолитического расщепления

.

Онкоиммунология

2016

;

5

:

e10

. 39

Aarslev

 

K

,

Dige

 

A

,

Greisen

 

SR

 и др.

Уровни растворимой запрограммированной смерти-1 связаны с активностью заболевания и реакцией на лечение у пациентов с аутоиммунным гепатитом

.

Scand J Гастроэнтерол

 

2016

;

52

:93

9

. 40

Yanaba

K

,

k

,

K

,

Hayashi

M

,

yoshihara

y

,

y

,

Nakagawa

H.

Сыворовочные уровни растворимого запрограммированной смерти — 1 и запрограммированная смерть Лиганд-1 в системном склерозе: связь со степенью склероза кожи

.

Дж Дерматол

 

2016

;

43

:

954

7

.

Примечания автора

© 2017 Авторы. Клиническая и экспериментальная иммунология

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями некоммерческой лицензии Creative Commons Attribution (https://creativecommons.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *